肖　源， 車筑平， 程　華， 楊紅靜， 譚慶華

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 貴州 都勻　558000； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 內(nèi)鏡中心， 貴州 貴陽　550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽　550004； 4.四川大學(xué)華西醫(yī)院 消化內(nèi)科， 四川 成都　610041)

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NSAIDs腸病大鼠回腸SIgA、IL-1β、IL-8、IL-10水平及樹突狀細(xì)胞數(shù)的變化*

肖源1， 車筑平2， 程華1， 楊紅靜3， 譚慶華4**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 貴州 都勻558000； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 內(nèi)鏡中心， 貴州 貴陽550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽550004； 4.四川大學(xué)華西醫(yī)院 消化內(nèi)科， 四川 成都610041)

目的： 探討非甾體類消炎藥(NSAIDs)腸病時(shí)SD大鼠回腸分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-8、IL-10水平及樹突狀細(xì)胞數(shù)的變化。方法: 34只清潔級(jí)SD大鼠均分為藥物損傷模型組(模型組)和對照組，模型組大鼠腹腔注射阿司匹林(100 mg/kg，2次/d)，對照組腹腔注射等量生理鹽水；造模2周后處死大鼠，在距回盲瓣5 cm近端腸管切取回腸段2 cm，采用ELISA法檢測大鼠回腸黏膜組織SIgA、IL-1β、IL-8及IL-10水平，免疫組織化學(xué)(IHC)檢測回腸黏膜CD205陽性染色的樹突狀細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果： HE染色結(jié)果顯示，模型組黏膜上皮細(xì)胞破壞，黏膜杯狀細(xì)胞減少，隱窩結(jié)構(gòu)變形，固有腺體排列紊亂，黏膜以及黏膜下層見大量淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞；對照組黏膜正常，未被破壞；免疫組織化學(xué)染色后，與對照組比較，模型組大鼠CD205陽性細(xì)胞增多，IOD值升高(P<0.05)；模型組大鼠回腸黏膜SIgA降低(P<0.05),IL-1β、IL-8及IL-10增加，樹突狀細(xì)胞數(shù)量增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： NSAIDs腸病發(fā)生后，回腸黏膜保護(hù)屏障受損，體液免疫紊亂。

樹突狀細(xì)胞； 分泌型免疫球蛋白A； 白細(xì)胞介素； 非甾體類消炎藥腸??； 大鼠,Sprague-Dawley

隨著非甾體類抗炎藥(NSAIDs)的廣泛使用， NSAIDs腸病成為其主要的副作用之一。NSAIDs腸病是一種以腸道蛋白丟失、腸道出血、腸黏膜炎癥及通透性改變、回腸吸收障礙為臨床表現(xiàn)的非特異性腸炎[1]。目前，NSAIDs對胃部損害的發(fā)病機(jī)制現(xiàn)已闡明，但對于腸道黏膜的損傷機(jī)制，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是局部及系統(tǒng)免疫共同作用的結(jié)果[2-3]。以CD205為代表的樹突狀細(xì)胞是腸道內(nèi)重要的抗原遞呈細(xì)胞，是腸道免疫的重要參與者[4]。T細(xì)胞被激活之后通過分泌白細(xì)胞介素-10(IL-10)等抑制性細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫抑制，維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)；另外T細(xì)胞還可以通過分泌IL-1、IL-6及IL-8等促炎因子，釋放炎性介質(zhì)介導(dǎo)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。腸道免疫中的體液免疫的主要參與者為分泌型免疫球蛋白A(SIgA)，SIgA是腸道黏膜屏障的第一道屏障，它的削弱，將導(dǎo)致腸道黏膜屏障功能減弱，引起腸道免疫平衡失調(diào)，腸道細(xì)菌移位，蛋白丟失等反應(yīng)，導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生[5]。因此，為探討NSAIDs對腸道黏膜的損傷機(jī)制，本研究通過觀察大鼠NSAIDs腸病模型中IL-1β、IL-8、IL-10、SIgA水平及樹突狀細(xì)胞數(shù)(CD205)，了解NSAIDs時(shí)大鼠腸黏膜免疫功能的變化。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及分組

清潔級(jí)SD大鼠34只(購于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量(210±10)g，飼養(yǎng)溫度(23±2)℃，采用自然光，分籠飼養(yǎng)，自由飲食。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠均分為藥物損傷組(模型組)和對照組，模型組大鼠腹腔注射100 mg/kg精氨酸阿司匹林注射液(海南靈康制藥有限公司，130401，海南，中國)，對照組大鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水，2次/d，連續(xù)2周。

1.2方法

1.2.1取材兩組大鼠禁食24 h，禁飲8 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/100 g)麻醉，打開腹腔，距回盲瓣近端5 cm處向近端切取回腸段2 cm，用PBS沖凈腸內(nèi)容物。腸管組織均分為2份，一份按1∶5的比例加入PBS液，低溫下制備組織勻漿，以3 000 r/min離心20 min，取上清液測定SIgA、IL-1β、IL-8、IL-10水平；另一份放入10%中性福爾馬林固定，制作石蠟切片，用于HE及免疫組化學(xué)染色。通過HE染色觀察大鼠腸道黏膜損傷情況。

1.2.2IL-1β、IL-8、IL-10、SIgA水平及CD205染色陽性樹突狀細(xì)胞數(shù)采用ELISA法測定SIgA(Rat secretory immunoglobulin A SIgA ELISA Kit，批號(hào)E-30311，美國rndsystems公司)、IL-1β、IL-8及IL-10水平(試劑盒購于北京永輝，編號(hào)E-30418、E-30581、E-30581)，嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書操作。采用免疫組織化學(xué)(IHC)染色測定CD205(Rabbit Anti-CD205，編號(hào)bs-2565R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，一抗-4 ℃過夜23 h，DAB顯色劑染色，顯色時(shí)間1～2 min，蘇木素復(fù)染后，脫水、透明，中性樹膠封片，觀察染色陽性的細(xì)胞。采用Image Proplus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，計(jì)算出陽性細(xì)胞IOD值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1HE和IHC染色

HE染色結(jié)果顯示(圖1A、B)，模型組黏膜上皮細(xì)胞破壞，黏膜杯狀細(xì)胞減少，隱窩結(jié)構(gòu)變形，固有腺體排列紊亂，黏膜以及黏膜下層見大量淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞；對照組黏膜正常，未被破壞。IHC染色后，模型組大鼠CD205陽性細(xì)胞增多，與對照組比較，觀察組IOD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1C、D。

注：A、C對照組，B、D為模型組；A、B為HE染色，CD為IHC染色；箭頭所指為CD205陽性細(xì)胞圖1　大鼠回腸組織HE和IHC染色(400×)Fig.1　Immunohistochemical staining of rat intestinal mucosa

2.2IL-1β、IL-8、IL-10及SIgA水平

ELISA結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組腸黏膜IL-1β、IL-8及IL-10含量明顯增多，SIgA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　兩組大鼠回腸黏膜CD205 IOD值、IL-1β、IL-8、IL-10及SIgA水平

(1)與對照組比較，P<0.05

3　討論

隨著人口老齡化的進(jìn)展，NSAIDs引起消化道損傷備受大家關(guān)注，目前，NSAIDs引起腸道黏膜損傷機(jī)制仍不清楚，有研究表明NSAIDs引起腸道黏膜損害，黏膜通透性增加是其發(fā)病的主要因素之一，腸道黏膜免疫是其發(fā)病因素的重要組成部分[6]。本研究通過比較模型組以及對照組SD大鼠腸黏膜免疫功能的變化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生NSAIDs腸病時(shí)， CD205表達(dá)增強(qiáng)，提示腸道免疫反應(yīng)的增強(qiáng)，樹突狀細(xì)胞染色增加不僅表現(xiàn)在腸黏膜淋巴結(jié)內(nèi)，上皮細(xì)胞也明顯增多、增強(qiáng)，說明樹突狀細(xì)胞細(xì)胞可能直接和間接發(fā)揮遞呈抗原的作用都在增強(qiáng)，但局部腸道免疫是否相應(yīng)增加，還要看效應(yīng)細(xì)胞的反應(yīng)情況[7]。IL-8是一種很重要的炎癥趨化因子，對中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞的趨化作用，可誘導(dǎo)它們局部釋放炎性介質(zhì)引起炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落并廣泛損害[8]。IL-10是腸道內(nèi)重要的抑炎因子，是下調(diào)腸道免疫反應(yīng)的炎癥因子， IL-1、IL-8的釋放，可減輕或者削弱腸道炎癥的發(fā)生[9-10]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NSAIDs腸病時(shí)，模型組腸黏膜中IL-1β、IL-8、IL-10水平高于對照組，說明NSAIDs腸病發(fā)生，IL1-β、IL-8等促炎因子參與了疾病的進(jìn)程，隨著病程進(jìn)展，免疫平衡被打亂，抑炎因子也釋放，力求維持腸道內(nèi)免疫平衡，可見在NSAIDs腸病時(shí)，細(xì)胞免疫參與了腸道免疫的過程。SIgA的產(chǎn)生開始于小腸集合淋巴結(jié)， B細(xì)胞中活化的漿細(xì)胞可以分泌IgA， SIgA釋放如腸腔，可以與相應(yīng)的抗原結(jié)合，抑制病原體以及細(xì)菌的增殖、中和毒素，清除食物蛋白抗原，又可以抵抗蛋白溶解酶的作用，抵御腸道黏膜被其破壞，進(jìn)而保護(hù)腸道黏膜的完整性，是腸道黏膜屏障的重要組成部分，在維持腸道微生態(tài)平衡中起著決定性作用[11-13]。在本研究中，大鼠NSAIDs腸病發(fā)生后腸道內(nèi)SIgA含量低于對照組(P<0.05)，表明SIgA在NSAIDs腸病時(shí)腸黏膜中的含量降低，SIgA的合成、分泌減少，獲得性體液免疫受到損害。同時(shí)腸道黏膜免疫屏障功能失調(diào)，抵御腸腔內(nèi)病毒、細(xì)菌及中和腸道毒素的功能減弱，腸腔內(nèi)抗原物質(zhì)與效應(yīng)細(xì)胞接觸引起局部炎癥細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子如IL-1、IL-8，進(jìn)一步加重了腸道炎癥。

綜上 ，NSAIDs腸病發(fā)生后，樹突狀細(xì)胞數(shù)量增多，提示腸道免疫反應(yīng)啟動(dòng)。IL-1β、IL-8及IL-10增多，表明腸道內(nèi)炎癥因子增多，促炎因子增加，細(xì)胞免疫平衡紊亂，腸道黏膜內(nèi)SIgA分泌明顯較少，回腸黏膜保護(hù)屏障受損，體液免疫紊亂。

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(2016-06-25收稿，2016-08-28修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 趙毅

Changs of SIgA,IL-1β、IL-8、IL-10 Levels and Dendritic Cells in Intestinal Mucosa of Rats with NSAIDs Enteropathy

XIAO Yuan1, CHE Zhuping2, CHENG Hua1, YANG Hongjing3，TAN Qinghua4

(1.DepartmentofDigestiveSystem,ThirdAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Duyun558000,Guizhou,China;2.DigestiveEndoscopyCenter,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofClinicalMedicine,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.DepartmentofDigestiveSystem,WestChinaHospitalUniversity,Chengdu610041,Sichuan,China)

Objective: To investigate the changes of non-steroidal anti-inflammatory drug enteropathy in SD rats with ileal SIgA, interleukin-Iβ, interleukin-8, interleukin-10 and dendritic cells change. Methods: 34 SPF grade Sprague-Dawley rats were randomly divided into 2 groups in equal number. The aspirin group received intraperitoneally injections of 100 mg/kg of aspirin twice a day for 14 days, the control group received equal volume of normal saline. 5 cm from the ileocecal valve in the proximal intestine was cut off by 2 cm after constructing the model for 2 weeks and executed the rats. The levels of SIgA, IL-1β, IL-8 and IL-10 in ileal tissue were detected by ELISA. The quantity of CD205-positive cells in mucosa was tested by immunohistochemistry analysis. Results: Aspirin group compared with control group, the level of SIgA in ileal tissue of aspirin group decreased (P<0.05)，IL-1β, IL-8, IL-10 and the number of dendritic cells increased (P<0.05); mucosa of control group was normal and stayed intact; after IHC staining, CD205 positive cells increased in model rats, comparing with control group, observation showed increased IOD value(P<0.05); comparing with control group, SIgA in model group rats ileal mucosa decreased(P<0.05), IL-1β, IL-8 and IL-10 increased, dendritic cells increased (P<0.05). Conclusion：NSAIDs bowel disease would damage intestinal mucosal barrier and caused thumoral immune disorder.

dendritic cell； secretory immunoglobulin A; Interleukin; non steroidal anti-inflammatory drug enteropathy; rats, Sprague-Dawley

貴州省科技廳基金(E2011-10)

E-mail:tanqh2007@163.com

R574

A

1000-2707(2016)09-1064-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.017

**

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-09-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.040.html