馮海潮， 孫朝琴， 張　姝， 何　蕓， 吳　瓊， 莫　非， 羅昭遜*

(貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽　550004)

?

頭花蓼對幽門螺桿菌胃炎大鼠血清干擾素-γ和白細(xì)胞介素-4含量的影響*

馮海潮**， 孫朝琴， 張姝， 何蕓， 吳瓊， 莫非， 羅昭遜***

(貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽550004)

目的： 探討苗藥頭花蓼對幽門螺桿菌(H.pylori)感染相關(guān)性胃炎大鼠血清干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)含量的影響。方法： 30只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組及頭花蓼組,采用H.pylori灌胃造模，空白組灌胃無菌腦心浸液肉湯，模型組和頭花蓼組用消炎痛預(yù)處理后灌胃H.pylori制作H.pylori感染相關(guān)性胃炎大鼠模型，之后空白組和模型組大鼠灌胃生理鹽水、頭花蓼組大鼠灌胃頭花蓼2周；采用HE染色評估胃黏膜炎炎癥損傷程度，酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測3組大鼠血清IFN-γ、IL-4含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time-PCR)檢測胃黏膜中IFN-γ、IL-4 mRNA的相對表達(dá)水平。結(jié)果：H.pylori灌胃造模后，大鼠胃竇黏膜有H.pylori定植，HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠胃組織呈現(xiàn)相關(guān)性胃炎病理形態(tài)改變；頭花蓼干預(yù)后，H.pylori感染大鼠胃黏膜炎癥明顯改善，IFN-γ mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)、IFN-γ血清含量明顯降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而頭花蓼干預(yù)對IL-4分泌的影響比較輕。結(jié)論： 頭花蓼可減輕H.pylori對胃黏膜炎性損傷，其機(jī)制可能是通過下調(diào)IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平而實(shí)現(xiàn)的。

頭花蓼； 苗藥； 幽門螺桿菌； 干擾素-γ； 白介素-4； 炎癥； 大鼠，Sprague-Dawley

頭花蓼是貴州省的精選苗藥，具有清熱利濕，活血解毒的功效，對幽門螺桿菌具有抗菌活性[1-3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)頭花蓼體外可刺激淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)和白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)的分泌，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)[4]。INF-γ、IL-4分別作為T淋巴細(xì)胞的兩種亞型Th1型和Th2型的代表因子，其分泌水平可一定程度上反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。本研究采用酶聯(lián)免疫(ELISA)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time-PCR)方法檢測頭花蓼治療前后H.pylori胃炎大鼠血清IFN-γ、IL-4的含量及胃黏膜IFN-γ、IL-4 mRNA相對表達(dá)水平，旨在探討頭花蓼改善H.pylori感染相關(guān)性胃炎的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

頭花蓼浸膏粉(批號(hào)141196)，由浙江眾益有限有限責(zé)任公司提供。H.pylori馴化株SS200由中國疾病控制中心傳染病所張建中教授惠贈(zèng)，保存于貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院臨床檢驗(yàn)教研室。SPF級(jí)SD大鼠30只，周齡6～8周，體質(zhì)量150～180 g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SYXK(渝)2012-0001，實(shí)驗(yàn)獲得貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。試劑有哥倫比亞血瓊脂粉(購自O(shè)xoid)，腦心浸液瓊脂(購自O(shè)xoid)，無菌脫纖維羊血(購自南京便診生物科技有限公司)，ELISA試劑盒(購自ebioscience)，RNA提取試劑盒(購自O(shè)mega)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自Takara)，real time-PCR試劑盒(購自Takara)。主要儀器有酶標(biāo)儀(BIO-xMark生產(chǎn))，三氣培養(yǎng)箱(Thermo生產(chǎn))，熒光定量PCR儀(購自德國ROCHE)。

1.2方法

1.2.1H.pylori培養(yǎng)和菌液制備H.pylori培養(yǎng)：H.pylori復(fù)蘇后穩(wěn)定傳代3次，取長勢良好菌苔接種于哥倫比亞血瓊脂平板，置微需氧環(huán)境(85%N2，10%CO2，5%O2)培養(yǎng)48 h。菌懸液制備：無菌接種環(huán)從哥倫比亞血瓊脂平板上收集H.pylori菌落，以預(yù)冷的無菌腦心浸液肉湯制成混懸液，3 000 g，4 ℃離心3 min后，棄上清液，洗滌3次，采用比濁法調(diào)整菌懸液濃度為1×1012cfu/L，預(yù)冷，備用。

1.2.2H.pylori感染相關(guān)性胃炎大鼠模型30只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和頭花蓼組，每組10只；參照文獻(xiàn)[5-6]，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食禁水12 h，模型組和頭花蓼組采用1.0 mL/只的消炎痛藥液(1g/L)預(yù)處理6 h后用H.pylori懸液1.5 mL/只隔天灌胃，連續(xù)5次；空白組以等量的無菌腦心浸液肉湯代替。灌胃8周后，每組隨機(jī)取3只大鼠處死，留取胃竇黏膜組織用于H.pylori相關(guān)性胃炎模型鑒定。

1.2.3H.pylori相關(guān)性胃炎模型鑒定H.pylori感染的鑒定：采用快速尿素酶實(shí)驗(yàn)、組織切片Giemsa染色以及細(xì)菌培養(yǎng)檢測H.pylori，3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中至少2項(xiàng)陽性判斷為H.pylori感染。H.pylori相關(guān)性胃炎評價(jià)：取胃竇黏膜組織用4%中性甲醛固定，常規(guī)HE染色，病理醫(yī)生雙盲閱片，行胃黏膜慢性炎癥評分。SD大鼠胃黏膜有H.pylori定植且出現(xiàn)慢性炎癥病理學(xué)改變，判斷為造模成功。

1.2.4頭花蓼干預(yù)治療成功建模后，頭花蓼組參照文獻(xiàn)[7-8]的頭花蓼臨床[3.49 g生藥/(kg·d)]3倍劑量作為治療H.pylori感染SD大鼠的給藥劑量進(jìn)行灌胃處理，連續(xù)14 d(1次/d)，空白組和模型組給予等量的無菌生理鹽水。治療結(jié)束后4周處死所有大鼠，留取大鼠胃竇黏膜組織和靜脈血，用于后續(xù)研究。

1.2.5血清FN-γ和IL-4含量取各組大鼠血清200 μL，采用ELISA法檢測血清IFN-γ和IL-4含量，具體操作按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6胃黏膜組織IFN-γ、IL-4 mRNA表達(dá)采用real time-PCR法，用Omega試劑盒提取胃竇黏膜組織的RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR ?Ⅱ進(jìn)行real time-PCR，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成，引物信息見表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。采集IFN-γ、IL-4、β-actin內(nèi)參照基因各循環(huán)熒光信號(hào)，用EXCEL軟件計(jì)算Ct值、ΔΔCt值及相對表達(dá)值RQ，ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，ΔΔCT=ΔCT給藥組-ΔCT模型組，IFN-γ、IL-4的RQ以2-ΔΔCT表示。

表1　PCR引物信息、基因序列號(hào)及產(chǎn)物大小

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1H.pylori相關(guān)性胃炎模型

H.pylori感染8周后，模型組大鼠胃黏膜快速尿素酶實(shí)驗(yàn)陽性，Giemsa染色見胃竇腺腔內(nèi)分布有細(xì)小、彎曲的短桿菌，微需氧培養(yǎng)見細(xì)小、濕潤、透明的針尖樣菌落，菌落經(jīng)尿素酶、觸酶和氧化酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)為H.pylori，H.pylori感染率為100%； HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠胃黏膜破損、糜爛，腺體腫脹，黏膜下層有大量淋巴細(xì)胞浸潤，甚至形成淋巴肉芽腫，呈現(xiàn)相關(guān)性胃炎病理形態(tài)改變(圖1)。說明成功構(gòu)建H.pylori感染相關(guān)性胃炎動(dòng)物模型。

2.2大鼠胃黏膜組織的HE染色及病理評分

HE染色結(jié)果顯示，空白組大鼠胃黏膜完整，腺體規(guī)則，黏膜下層偶見淋巴細(xì)胞浸潤；模型組大鼠胃黏膜破損、糜爛，腺體腫脹，黏膜下層有大量淋巴細(xì)胞浸潤；經(jīng)頭花蓼治療后，大鼠胃黏膜損傷得到一定程度的修復(fù)，黏膜比較完整，腺體比較規(guī)則，黏膜下層散在少量淋巴細(xì)胞浸潤，炎癥有所改善；與空白組病理評分比較，模型組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組比較，頭花蓼組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表2。

注：A 為空白組，B為模型組，C為頭花蓼組；箭頭為胃黏膜腺體腫脹圖1　SD大鼠胃黏膜組織的病理學(xué)變化(HE，×400)Fig.1　The pathological change of gastric mucosa of SD rats

組別病理評分(分)空白組0.55±0.37模型組2.59+0.59(1)頭花蓼組1.73±0.40(1)(2)

(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05

2.3血清FN-γ和IL-4含量

H.pylori感染后，模型組大鼠血清IFN-γ含量明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)頭花蓼治療后，IFN-γ含量明顯降低(P<0.05)。H.pylori感染后，模型組大鼠血清IL-4含量雖較空白組降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)頭花蓼治療后，血清IL-4含量雖有所升高，但與模型組比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.4胃黏膜組織IFN-γ和IL-4 mRNA表達(dá)

與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜IFN-γ mRNA相對表達(dá)量升高，IL-4 mRNA相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)頭花蓼治療后，與模型組比較，大鼠胃黏膜IFN-γ mRNA的相對表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； IL-4 mRNA的相對表達(dá)量雖有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：A為FN-γ，B為IL-4；(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05圖2　大鼠血清FN-γ和IL-4含量Fig.2　Cytokine levels in serum of rats

注：(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05圖3　3組大鼠胃黏膜組織中 IFN-γ、IL-4 mRNA相對表達(dá)量比較Fig.3　mRNA levels of IFN-γ and IL-4 of rat gastric mucosa in the three groups

3　討論

H.pylori感染是引起胃炎、胃及十二指腸潰瘍乃至胃癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。隨著廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，使得H.pylori耐藥株不斷增加，研發(fā)高效及高選擇性的抗H.pylori藥物已成為趨勢。有研究報(bào)道，中藥或中西醫(yī)結(jié)合用藥可提高H.pylori根除率，改善胃黏膜炎癥或抑制消化性潰瘍，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度分析有功效的中藥抑制H.pylori感染的作用機(jī)制[9]。中藥抑制H.pylori相關(guān)性胃炎的可能機(jī)制為抑制其毒力因子的表達(dá)、調(diào)節(jié)感染所致的免疫失衡、糾正胃腸激素分泌紊亂、干擾信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)等。本研究采用頭花蓼治療H.pylori感染SD大鼠胃炎模型，對頭花蓼的可能作用機(jī)制進(jìn)行初步分析。輔助性T細(xì)胞Ⅰ型和Ⅱ型(Th1、Th2)在人體的免疫中起著重要作用。Th1主要執(zhí)行因子是IFN-γ和IL-2，而Th2主要執(zhí)行因子是IL-4、IL-10等，二者通過分泌不同的細(xì)胞因子，彼此交叉調(diào)節(jié)，相互抑制，共同維持Th1/Th2平衡。H.pylori感染后，其抗原持續(xù)刺激引起機(jī)體局部或整體發(fā)生免疫反應(yīng)。人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)H.pylori感染后胃黏膜發(fā)生以Th1型為主的免疫反應(yīng)，Th1型細(xì)胞因子分泌增多，而Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10很少或缺乏[10]。但機(jī)體在抵御外來抗原與限制自身組織損傷的過程中同時(shí)存在Th1、Th2反應(yīng)與炎癥反應(yīng)自我平衡的過程，兩種免疫反應(yīng)相互制約，此起彼伏，其結(jié)果決定疾病的結(jié)局[11]。

本研究中，H.pylori感染后，大鼠胃黏膜IFN-γ mRNA表達(dá)量增高，血清IFN-γ水平上升，而胃黏膜IL-4 mRNA 表達(dá)明顯降低，血清IL-4 水平無明顯改變，胃黏膜呈現(xiàn)慢性炎癥損傷。表明H.pylori感染后，發(fā)生了Th1偏移，Th2應(yīng)答受到抑制，Th1應(yīng)答分泌的大量IFN-γ，增強(qiáng)了局部各種炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的活性，刺激釋放炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、活性氧簇和活性單簇，引起胃上皮損傷，同時(shí)因IFN-γ與IL-4存在相互限制的關(guān)系，主要針對胞外感染的Th2應(yīng)答受到抑制，H.pylori不能有效的被清除，細(xì)菌長期持續(xù)感染，胃黏膜損傷難以得到修復(fù)。另外，有研究報(bào)道H.pylori感染早期Th1應(yīng)答占優(yōu)勢地位產(chǎn)生過量IFN-γ，增強(qiáng)各類炎癥細(xì)胞活性，造成胃黏膜上皮細(xì)胞的損傷；而關(guān)于H.pylori感染后Th2應(yīng)答出現(xiàn)較晚，說明Th2應(yīng)答在H.pylori感染早期發(fā)揮作用甚微[12]。本研究中大鼠血清Th2型細(xì)胞因子在H.pylori感染后或經(jīng)治療后，其水平變化輕微，支持以上觀點(diǎn)。經(jīng)頭花蓼治療后，IFN-γ mRNA表達(dá)量降低，血清IFN-γ水平降低，IL-4 mRNA及血清IL-4含量有所升高，提示頭花蓼在促進(jìn)T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化方面起重要作用，能抑制IFN-γ水平并下調(diào)Th1型免疫反應(yīng)，從而減輕由H.pylori感染所致的炎癥反應(yīng)。同時(shí)下調(diào)Th2應(yīng)答的因素減弱，有利于炎癥的恢復(fù)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)頭花蓼可減輕大鼠胃黏膜炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與降低IFN-γ等致炎因子水平，抑制H.pylori感染所致Th1/Th2失衡，從而減輕黏膜炎癥有關(guān)。然而參與Th1/Th2免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞因子眾多，彼此之間相互聯(lián)系，關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，關(guān)于頭花蓼經(jīng)何種途徑調(diào)節(jié)Th1/Th2的失衡作用機(jī)制仍不明確，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1] 于明，李占林．頭花蓼的化學(xué)成分[J]．沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008(8)：633-635．

[2] 任艷君，莫非，張姝，等．頭花蓼對幽門螺桿菌生長及代謝相關(guān)基因的影響[J]．貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2016(2)：175-178．

[3] 張姝，羅昭遜,莫非,等．頭花蓼對幽門螺桿菌抗菌作用分析[J]．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2015(2)：113-117．

[4] 馮海超，孫朝琴，何蕓,等．頭花蓼對淋巴細(xì)胞分泌干擾素γ和白介素4的影響[J]．貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016(6)：645-648.

[5] 封迎帥, 易受鄉(xiāng), 林亞平，等.艾灸預(yù)處理對幽門螺桿菌胃黏膜炎性損傷大鼠血清IgG和eHSP72含量的影響[J].世界華人消化雜志, 2012 (13):1131-1136.

[6] Al-Omari FA, Matalka ll, Al-Jarrah MA,et al. An intelligent decision support system for quantitative assessment of gastric atrophy [J]. J Clin Pathol, 2011 (4):330-337.

[7] 俞建軍，馬小琴．熱臨清顆粒治療尿路感染的療效評價(jià)[J]．臨床泌尿外科雜志， 2001(12)：543-544．

[8] 黃繼漢，黃曉輝．藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算[J]．中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)， 2004(9)：1069-1072．

[9] 宋茜，胡德兵，李英倫．中藥抑制幽門螺桿菌及其作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J]．中成藥， 2015(8)：1795-1799．

[10]Larussa T, Leone I, Suraci E, et al. Enhanced expression of indole amine 2,3-Dioxygenase in helicobacter pylori-infected human gastric mucosa modulates Th1/Th2 pathway and interleukin 17 production [J]. Helicobacter, 2015 (1)：41-48.

[11]趙東，徐桂芳，鄒曉平.益生菌對感染幽門螺桿菌的C57BL/6小鼠胃黏膜IL-8、IFN-γ以及IL-4、IL-10的調(diào)節(jié)效應(yīng)[ J].胃腸病學(xué)， 2012(5)：271-275．

[12]Shi Y，Liu XF, Zhuang Y, et al. Helicobacter pylori-induced Th17 responses modulate Th1 cell responses, benefit bacterial growth, and contribute to pathology in mice [J]. J Immunol, 2010 (9):5121-5129.

(2016-04-28收稿，2016-08-12修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 趙毅

Effects ofPolygonumcapitatumon Content of IFN-γ and IL-4 in Rats withHelicobacterpyloricGastritis

FENG Haichao, SUN Chaoqin, ZHANG Shu, HE Yun, WU Qiong, MO Fei, LUO Zhaoxun

(GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effects ofPolygonumcapitatumon content of IFN-α and IL-4 in rats withHelicobacterPyloricgastritis. Methods: 30 SD rats were randomly divided into blank group, model group andPolygonumcapitatumgroup. Gastritis was induced in rats by oral gavage withH.pylori; blank group was treated with sterile Brain Heart Infusion Broth, model group andPolygonumcapitatumgroup were first treated with indomethacin, then served to constructH.pyloriinfected relevance gastritis rats model. Blank group and model group were treated with normal saline irrigation,Polygonumcapitatumgroup were treated withPolygonumcapitatumirrigation for two weeks; HE staining was adopted to evaluate the Acute gastritis inflammation damage level, ELISA to test IFN-γ and IL-4 content of three groups; real time-PCR to test relative expression level of IFN-γ mRNA and IL-4 mRNA in mucositis. Result: After treatment, gastric inflammation inPolygonumcapitatumgroup was improved obviously. The mRNA expression and the serum content of IFN-γ inPolygonumcapitatumgroup were significantly lower than the model group, it was statistically significant (P<0.05). ButPolygonumcapitatumhad little effect on secretion IL-4 in the process of H.pylori infection. Conclusion:Polygonumcapitatumcould inhibitH.pylori-associated gastritis probably via down-regulation of IFN-γ mRNA expression.

Polygonumcapitatum;Miao medicine;Helicobacterpyloric; interferon-γ; interleukin-4; inflammation; rats,Sprague-Dawley

貴州省科學(xué)技術(shù)基金[黔科合(2014)2027號(hào)]； 貴州省科技合作計(jì)劃基金[黔科合LH(2015)7417號(hào)]； 貴州省衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)基金(gzwikj2015-1-003)； 貴陽市科技局計(jì)劃項(xiàng)目[筑科合同(2014001)]

E-mail:418611578@qq.com

R931

A

1000-2707(2016)09-1037-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.011

**貴陽醫(yī)學(xué)院2013級(jí)碩士研究生

***

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-09-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.018.html