何　峰， 張　昀

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 2.貴州瑞和制藥有限公司， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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頂空-氣相色譜法測(cè)定舒肝寧注射液4種提取物中乙醇的殘留量*

何峰1， 張昀2**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴州瑞和制藥有限公司， 貴州 貴陽(yáng)550004)

目的： 建立頂空-氣相色譜法測(cè)定舒肝寧注射液中茵陳、梔子、板藍(lán)根及靈芝提取物中乙醇?xì)埩袅康姆椒?。方法?采用ZB-624石英毛細(xì)管柱(30.0 m×0.53 mm×3 μm)，柱溫采取程序升溫的方法，載氣為氮?dú)?，進(jìn)樣口溫度為200 ℃，檢測(cè)器溫度為250 ℃，測(cè)定舒肝寧注射液上述4種提取物中乙醇?xì)埩袅?，探討乙醇?xì)埩袅繖z測(cè)的線性范圍，回收率及最低檢測(cè)限。結(jié)果： 乙醇在15.46～773 mg/L(r=0.999 3) 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，4種提取物的回收率均良好，最低檢測(cè)限為 11 ng。結(jié)論: 所建立的方法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確，可用于舒肝寧4種提取物中乙醇?xì)埩袅康臏y(cè)定。

色譜法，氣相; 舒肝寧注射液; 乙醇； 殘留量

[Abstract]Objective: To determine the residual quantity of ethanol in four extracts(wormwood,fructuscardeniae,radixisatidis,andganodermalucidum) in Shuganning injection by headspace gas chromatographic method. Methods: ZB-624 (30.0 m×0.53 mm×3 μm) column was used. The temperature programming was adopted for column temperature with carrying gas as nitrogen. Inlet temperature and FID detector were 200 ℃ and 250 ℃, respectively. The residual quantity of ethanol above-mentioned 4 extracts in Shuganning injection was detected, and he linear range, recovery rate and the lowest detection limit of ethanol residue were discussed. Results: The result showed good linearity in the ethanol content range of 15.46～773 μg·mL-1(r=0.999 3), recovery of four kinds of extracts were good and the detection limit was 11ng. Conclusion: This method is rapid, sensitive and accurate for detecting the residual ethanol in four extracts of Shuganning injection．

[Key words]chromatography,gas; Shuganning injection; ethanol; residual

近年來(lái)，中藥注射劑等高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品中殘存有機(jī)溶劑的毒性和致癌作用日益引起各方面的關(guān)注，因此對(duì)中藥注射劑生產(chǎn)過(guò)程中引入有機(jī)溶劑殘留物進(jìn)行有機(jī)溶劑殘留量測(cè)定變得非常必要。舒肝寧注射液是由茵陳、梔子、板藍(lán)根、及靈芝等提取物為原料制備而成的純中藥注射劑，臨床常用于治療黃疸，急、慢性病毒性肝炎[1-2]。茵陳、梔子、板藍(lán)根及靈芝這4種提取物的生產(chǎn)工藝均為水提取、兩次乙醇醇沉，按《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定, 乙醇為Ⅲ類有機(jī)溶劑。為了有效控制產(chǎn)品質(zhì)量和保證用藥安全，本研究嘗試建立一種采用頂空-氣相色譜法檢測(cè)舒肝寧注射液中茵陳、梔子、板藍(lán)根、及靈芝4種提取物中乙醇?xì)埩舻姆治龇椒?，為舒肝寧注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供可行的質(zhì)檢方法。

1　儀器與試藥

Agilent 7820A氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，Agilent 7694E頂空進(jìn)樣器， MS d=0.01 mg電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn))，無(wú)水乙醇(批號(hào)20101025，重慶川東化工有限公司)，注射用水，茵陳提取物(批號(hào)T-Y20120524、T-Y20120823及T-Y20120829)、梔子提取物(批號(hào)T-Z20130114、T-Z20120807及T-Z20121212)、板藍(lán)根提取物(批號(hào)T-B20121108、T-B20120118及T-B20121106)、靈芝提取物(T-L20121120、T-L20121112及T-L20121114)，以上12批提取物均為貴州瑞和制藥公司生產(chǎn)。

2　方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液及供試品溶液的制備

吸取1 mL恒溫至25 ℃的無(wú)水乙醇置于100 mL容量瓶，定容至100 mL，搖勻，吸取1 mL轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶，定容至50 mL，搖勻，即得對(duì)照品溶液。吸取各提取物2 mL，置于25 mL容量瓶，定容至50 mL，搖勻，即得供試品溶液。

2.2色譜條件

色譜柱為Agilent ZB-624石英毛細(xì)管柱(30.0 m×0.53 mm×3 μm，美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn))，柱溫為程序升溫：初始溫度為40 ℃保持 7 min，以30 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持5 min，進(jìn)樣口溫度為200 ℃，檢測(cè)器溫度為250 ℃。分流進(jìn)樣，分流比為10∶1，載氣為氮?dú)猓魉?.8 mL/min；檢測(cè)器氫氣流速30 mL/min，氧氣流速300 mL/min。頂空條件：樣品瓶溫度80 ℃，樣品環(huán)溫度100 ℃，傳輸線溫度120 ℃，樣品瓶加熱平衡時(shí)間10 min，進(jìn)樣時(shí)間0.3 min，頂空進(jìn)樣1 mL。

2.3專屬性實(shí)驗(yàn)

精密量取對(duì)照樣品、供試品溶液及空白溶液各5 mL分別置于頂空瓶中，加蓋，密封，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖[3-6]。結(jié)果表明，供試品與對(duì)照品在相應(yīng)的保留時(shí)間均顯示相應(yīng)色譜峰，空白試劑在與對(duì)照品出峰時(shí)間點(diǎn)上無(wú)吸收峰，方法專屬性良好。見(jiàn)圖1。

注：A為空白溶液， B為對(duì)照品溶液，C為茵陳提取物， D為梔子提取物，E為板藍(lán)根提取物，F(xiàn)為靈芝提取物；a為乙醇峰圖1　提取物中乙醇?xì)埩魴z測(cè)方法的專屬性實(shí)驗(yàn)色譜結(jié)果Fig.1　Specific experimental results of the determination of ethanol residue in the extracts

2.4線性關(guān)系考察

精密吸取恒溫至25 ℃的無(wú)水乙醇，置100 mL容量瓶中，依次逐級(jí)稀釋，定容，制得濃度梯度依次為：0.773 00、0.309 20、0.154 60、0.077 30、0.038 65、0.015 46 g/L的6個(gè)對(duì)照品溶液，再分別精密量取上述各濃度對(duì)照品溶液5.0 mL，置于頂空進(jìn)樣瓶中，加蓋，密封，按按2.2項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，以各溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析，繪制線性關(guān)系圖，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r)，得到回歸方程為Y=5 713.7X-31.591，r=0.999 3。由線性關(guān)系圖得出在15.46～773 mg/L的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為11 ng。

圖2　提取物中乙醇?xì)埩魴z測(cè)方法的線性關(guān)系Fig.2　The linear relationship of the method for the determination of ethanol in the extract

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密量取批號(hào)為T(mén)-Y20120524的茵陳提取物2 mL(2.069 6 g、2.069 2 g、2.069 2 g、2.069 5 g、2.069 3 g、2.069 6 g)共6份，按2.1項(xiàng)下要求，制備供試品，分別置于6支頂空進(jìn)樣瓶中進(jìn)樣分析[8-9]，試驗(yàn)結(jié)果表明重復(fù)性良好，保留時(shí)間RSD為0.1%，峰面積RSD為0.7%。

2.6中間精密度試驗(yàn)

試驗(yàn)中由2名有資質(zhì)的檢驗(yàn)人員分別獨(dú)立對(duì)同一批次茵陳提取物(T-Y20120524)平行進(jìn)行2次檢測(cè)，以考察隨機(jī)變動(dòng)因素、試驗(yàn)誤差因素對(duì)精密度的影響。兩人所測(cè)結(jié)果的RSD為5.0%，符合中間精密度的要求。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取6份茵陳提取物2 mL(T-Y201205

24)，按2.1項(xiàng)下程序制備供試品，分別精密量取5 mL置于6支頂空進(jìn)樣瓶中，密封，分別于0、1、2、3、4及5 h進(jìn)行乙醇量測(cè)定，計(jì)算峰面積，結(jié)果不同時(shí)間點(diǎn)乙醇峰面積RSD為0.6%，樣品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8回收率試驗(yàn)

分別取1 mL已準(zhǔn)確測(cè)定乙醇?xì)埩袅康?種提取物(茵陳提取物T-Y20120524，梔子提取物T-Z20120807，板藍(lán)根提取物T-B20121108，靈芝提取物T-L20121112)各6份，精密稱定，加入1 mL 濃度為38.65 mg/L的乙醇溶液，按2.1項(xiàng)下程序制備樣品，按上述色譜條件測(cè)定回收率[10]。測(cè)得乙醇平均回收率為：茵陳提取物99.85%(RSD=1.62%)，梔子提取物 99.81%(RSD=1.01%)，板藍(lán)根提取物99.92%(RSD=1.12%)，靈芝提取物99.65%(RSD=0.98%)。

2.9樣品乙醇含量測(cè)定

分別精密吸取各提取物2 mL，按“2.1” 項(xiàng)下方法制備樣品，按“2.4” 項(xiàng)下方法色譜條件進(jìn)樣分析，試驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，樣品中乙醇峰的理論塔板數(shù)均>8 000，乙醇含量均<0.5%(g/g)。

表1　樣品乙醇含量測(cè)定結(jié)果

3　討論

課題組前期研究參照《中國(guó)藥典》2010年版附錄ⅧP殘留溶劑測(cè)定法[11]，對(duì)舒肝寧注射液及其4種提取物中可能含有的溶劑進(jìn)行了篩選，對(duì)其中的乙醇、三氯甲烷與正丁醇等殘留溶劑進(jìn)行測(cè)定，均未檢出三氯甲烷和正丁醇，而甲醇的含量也很低，幾乎未檢出，由于各提取物的制備方法均為水提醇沉法，因此本研究?jī)H將提取物的乙醇?xì)埩羧軇┝腥雰?nèi)控標(biāo)準(zhǔn)中。

根據(jù)本研究中采用頂空-樣氣相色譜法建立了舒肝寧注射液4種提取物中乙醇?xì)埩袅康臏y(cè)定方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇在15.46～773 mg/L(r=0.999 3) 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，4種提取物的回收率均良好，最低檢測(cè)限為 11 ng，成功建立了檢測(cè)舒肝寧注射液4種提取物中乙醇?xì)埩袅康臏y(cè)定方法，且利用此方法測(cè)定所測(cè)樣品的乙醇?xì)埩袅烤?0.5%，符合ICH乙醇量不得超過(guò)0.5%的規(guī)定，進(jìn)一步證實(shí)本研究所涉及的12批提取物樣品中乙醇量未超標(biāo)，但是考慮到注射液的安全性，因此建議企業(yè)將提取物的乙醇?xì)埩袅孔鳛槠髽I(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控。

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(2016-02-31收稿，2016-06-30修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Determination of Residual Ethanol in Four Extraction of Shuganning Injection by Headspace Gas Chromatography

HE Feng1, ZHANG Yun2

(1.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China;2.GuizhouRuihePharmaceuticalCo.,Ltd,Guiyang550004,Guizhou,China)

貴州省科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目[黔科合重大專項(xiàng)字(2011)6019號(hào)]

Email:838396231@qq.com

R917.7

A

1000-2707(2016)08-0911-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.08.011

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