劉天奇，趙宇，田海玉，汪志強(qiáng)，張東生，劉姍姍，鄒冬璇，錢俊紅

（華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海200237）

TCF類比色探針的合成及其對(duì)亞硫酸鹽的高靈敏度檢測(cè)

劉天奇，趙宇，田海玉，汪志強(qiáng)，張東生，劉姍姍，鄒冬璇*，錢俊紅*

（華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海200237）

本文以2-二氰基亞甲基-3-氰基-4，5，5-三甲基-2，5-二氫呋喃（TCF）為發(fā)色團(tuán)，合成了三個(gè)比色探針。研究了探針對(duì)幾種小分子含硫化合物如硫化氫、亞硫酸鹽以及小分子硫醇的光譜響應(yīng)，結(jié)果表明探針TNS-2對(duì)亞硫酸鹽具有較高的選擇性。濃度滴定曲線結(jié)果顯示在0.2～40 μM范圍內(nèi)，A334 / A447與亞硫酸鹽濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為7.0 ×10-8 mol/L，表明探針TNS-2對(duì)亞硫酸鹽具有較高的檢測(cè)靈敏度。

2-二氰基亞甲基-3-氰基-4，5，5-三甲基-2，5-二氫呋喃；比色探針；小分子含硫化合物

引言

含硫化合物（如硫醇、亞硫酸鹽以及硫化氫等）在生物、環(huán)境、工業(yè)等領(lǐng)域具有極其重要的作用［1］。硫醇類化合物是生物體內(nèi)研究最多的含硫化合物，是生命體中許多蛋白質(zhì)、多肽、酶的重要組成部分，在生理活動(dòng)中扮演著重要角色［2］。硫化氫是繼CO、NO之后發(fā)現(xiàn)的第三種信號(hào)分子，參與人體內(nèi)的多種生理過(guò)程，但其含量過(guò)多會(huì)造成阿茲海默癥、肝硬化等多種疾?。?］。亞硫酸鹽作為一種抗氧化劑和防腐劑，廣泛地應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥等領(lǐng)域，但過(guò)量攝入會(huì)對(duì)人體造成傷害［4，5］。因此，高靈敏度、高選擇性地檢測(cè)含硫化合物的含量對(duì)疾病檢測(cè)、環(huán)境保護(hù)、食品安全評(píng)價(jià)等具有重要的意義。

檢測(cè)含硫化合物的方法主要有液相色譜法［6，7］、電化學(xué)法［8，9］、Monier-Williams法［10，11］、毛細(xì)管電泳法［12，13］以及熒光探針法［14］。其中熒光探針分析技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)，近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前報(bào)道的熒光探針主要基于含硫化合物的以下特點(diǎn)：強(qiáng)的親核能力、強(qiáng)的還原性、與金屬離子螯合作用［15］等實(shí)現(xiàn)對(duì)含硫化合物的檢測(cè)。

本文針對(duì)不同含硫化合物的親核能力不同，以TCF為發(fā)色團(tuán)、C=C雙鍵為受體設(shè)計(jì)合成對(duì)含硫化合物具有高選擇性檢測(cè)的熒光探針。該類探針?biāo)苄院茫l(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)，能較好地消除背景干擾，在生理?xiàng)l件下與含硫化合物結(jié)合前后光譜性質(zhì)有明顯變化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)含硫化合物的選擇性檢測(cè)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

3-羥基-3-甲基-丁二酮（分析純）、丙二腈（分析純）、苯甲醛（分析純）、對(duì)甲氧基苯甲醛（分析純），對(duì)乙酰氨基苯甲醛（分析純）、半胱氨酸（Cys），高半胱氨酸（Hcy），谷胱甘肽（GSH），硫化鈉（Na2S），亞硫酸鈉（Na2SO3），溴化鈉（NaBr），磷酸鈉（Na3PO4），硫酸鈉（Na2SO4），硝酸鉀（KNO3），氯化鈉（NaCl），碳酸氫鈉（NaHCO3），醋酸鈉（CH3COONa），亞硝酸鈉（NaNO2），硫代硫酸鈉（Na2S2O3），Thermo Scientific Evolution 220紫外可見分光光度計(jì)，Thermo Scientific Lumina分子熒光光度計(jì)、pH計(jì)，所有實(shí)驗(yàn)均在25℃條件下進(jìn)行。

1.2合成方法

圖1　目標(biāo)化合物的合成路線Fig. 1 Synthesis procedures of the target compounds

1.2.1TCF的合成

將900 mg乙醇鈉（13 mmol）溶于10 mL乙醇中，向上述體系加入9.0 g（88 mmol）3-甲基-3-羥基-2-丁酮和12 g（181 mmol）新鮮蒸餾的丙二腈，室溫下水浴中攪拌。用薄層色譜法（TLC）跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，當(dāng)原料點(diǎn)消失后，再向反應(yīng)體系加入30 mL乙醇繼續(xù)加熱回流一小時(shí)。冰箱冷凍后抽濾，所得固體用少量冷乙醇洗滌，干燥后得白色晶體。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ（ppm）: 2.36（s，3H），1.64（s，6H）。

1.2.2探針TNS的合成

向5 mL甲醇中先后加入0.44 g合成的TCF（0.0022 mol），苯甲醛（0.233 g，0.0022 mol），再滴加5滴哌啶加熱回流4小時(shí)。用薄層色譜跟蹤反應(yīng)。當(dāng)原料點(diǎn)消失后，溶液中析出棕色沉淀，抽濾得到黃色固體TNS-1。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ（ppm）: 7.93（m，J=21.61Hz，2H），7.54（m，J=27.78Hz，3H），7.25（d，J=16.06，2H），1.809（s，6H）。EI-MS，測(cè)量值287.1060，計(jì)算值287.1059。以4-甲氧基-苯甲醛代替苯甲醛重復(fù)上述反應(yīng)可得到紅色固體TNS-2。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ（ppm）: 7.92（d，J=9.18Hz，2H），7.69（d，J=8.99Hz，2H），7.11（d，J=16.66，2H），3.868（s，3H），1.794（s，6H）。EI-MS，測(cè)量值317.1165，計(jì)算值317.1164。以4-乙酰氨基苯甲醛代替苯甲醛重復(fù)上述反應(yīng)可得到紅色固體TNS-3。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ（ppm）: 10.35（s，1H），7.89（d，J=8.44Hz，2H），7.73（d，J=8.48Hz，2H），7.10（d，J=16.22，2H），2.09（s，3H），1.79（s，6H）。ESI-MS，測(cè)量值367.1179（M+Na），計(jì)算值367.1171（M+Na）。

1.3光譜測(cè)試

1.3.1探針和分析物母液的配制

準(zhǔn)確稱取3.4 mg TNS-1、3.8 mg TNS-2和4.1 mg TNS-3，分別溶于4 mL乙腈溶液中配成3.0 mM探針乙腈溶液。分別配制30 mM的半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy），谷胱甘肽（GSH）、亞硫酸鈉、硫化鈉和其它無(wú)機(jī)陰離子鈉鹽（Br-、PO43-、SO42-、NO3-、Cl-、HCO3-、AcO-、NO2-、S2O32-）的水溶液。

1.3.2探針對(duì)亞硫酸根離子的選擇性和競(jìng)爭(zhēng)性

準(zhǔn)確移取10μL探針母液于3 mL乙腈-水（1:2）的混合溶液中，再加入10μL分析物母液，反應(yīng)10分鐘后測(cè)試體系的吸收光譜。

準(zhǔn)確移取10μL探針母液、10μL亞硫酸鹽母液于3 mL乙腈-水（1:2）的混合溶液中，再加入10μL其他陰離子母液，反應(yīng)10分鐘后測(cè)試體系的吸收光譜。

1.3.3亞硫酸鹽的濃度滴定曲線

準(zhǔn)確移取10μL探針母液于3 mL乙腈-水（1:2）的混合溶液中，加入不同體積的亞硫酸鹽母液使得亞硫酸鹽的最終濃度在0～40μM，反應(yīng)10分鐘后測(cè)試體系的紫外-可見光譜。

2　結(jié)果與討論

本文利用含硫化合物較強(qiáng)的親核活性，通過(guò)C=C不飽和鍵將取代苯和2-二氰基亞甲基-3-氰基-4，5，5-三甲基-2，5-二氫呋喃（TCF）共軛連接。當(dāng)含硫化合物與探針分子混合時(shí)會(huì)對(duì)探針上的C=C雙鍵發(fā)生親核加成反應(yīng)，導(dǎo)致探針分子的共軛體系變短、吸收波長(zhǎng)藍(lán)移，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)含硫化合物的檢測(cè)。另外，通過(guò)改變?nèi)〈鵕的電子效應(yīng)可以改善探針上C=C雙鍵的反應(yīng)活性，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)不同含硫化合物的區(qū)分檢測(cè)。

圖2　探針對(duì)含硫化合物的檢測(cè)機(jī)理Fig. 2 The proposed reaction mechanism of the probe with sulphur-containing compounds

2.1取代基對(duì)化合物吸收光譜的影響

由于三個(gè)探針R取代基的電子效應(yīng)不同，因此分子的電子推拉作用不同，使得其最大吸收波長(zhǎng)有明顯的差異。圖3是三個(gè)化合物的紫外-可見吸收光譜，由圖可見TNS1-3的最大吸收波長(zhǎng)分別位于405，447和435 nm處。由圖1的結(jié)構(gòu)式可知，三個(gè)取代基的給電子作用按照以下順序遞減-OCH3 >-NHCOCH3>H，而TCF是強(qiáng)的吸電子基團(tuán)，因此三個(gè)化合物的推拉效應(yīng)和最大吸收波長(zhǎng)依下列順序TNS-2>TNS-3>TNS-1遞減。

圖3　三個(gè)探針在MeCN/PBS（1:2，20 mM，pH 7.4）中的紫外可見吸收光譜。探針濃度為10μM。Fig. 3 The UV-vis spectra of three probes in MeCN/PBS（1:2，20 mM，pH 7.4），［probe］=10μM.

2.2探針對(duì)含硫化合物的光譜響應(yīng)

我們首先研究了不同含硫化合物對(duì)探針吸收光譜的影響，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知探針TNS-1的響應(yīng)最快，在1 min內(nèi)對(duì)硫醇、硫化氫和亞硫酸鹽等三種含硫化合物均有明顯的光譜響應(yīng)，其最大吸收波長(zhǎng)由405 nm藍(lán)移至340 nm，反應(yīng)在10 min后達(dá)到平衡，因此利用探針TNS-1可實(shí)現(xiàn)對(duì)含硫化合物總量的測(cè)定。探針TNS-2的響應(yīng)最慢，且其對(duì)不同含硫化合物的響應(yīng)也不同，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們選用TNS-2為探針研究其對(duì)不同化合物的光譜響應(yīng)。

圖4a是在10倍量亞硫酸鹽存在時(shí)探針TNS-2的紫外可見吸收光譜隨時(shí)間的變化曲線。由圖可知，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，探針在447 nm處的吸收峰不斷降低，在334 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其強(qiáng)度不斷增大，在360 nm處的等吸收點(diǎn)表明有新化合物生成。在反應(yīng)10分鐘后，吸收光譜不再有明顯的變化，表明反應(yīng)在10 min內(nèi)完成。同時(shí)也測(cè)定了TNS-2對(duì)硫化氫和半胱氨酸的光譜響應(yīng)，將其在334 nm-與447 nm處的吸光度比值對(duì)時(shí)間作圖，結(jié)果如圖4b所示。由圖可知，TNS-2與亞硫酸鹽反應(yīng)速率最快，10分鐘后達(dá)到平衡，而其與硫化氫以及半胱氨酸的反應(yīng)較慢，在10分鐘內(nèi)光譜幾乎沒有明顯的變化，因此利用TNS-2可實(shí)現(xiàn)對(duì)亞硫酸鹽的選擇性檢測(cè)。

圖4　（a）TNS-2-亞硫酸鹽體系吸收光譜隨時(shí)間的變化曲線，（b）TNS-2與三種含硫化合物反應(yīng)的時(shí)間曲線，［TNS-2］=10 μM，［Na2SO3］=［H2S］=［Hcy］=100 μM，20 mM PBS/MeCN=2:1，pH 7.4.Fig. 4（a）Time-dependent UV-vis spectrum of TNS-2 in the presence of sulfite，（b）Time-dependent absorbance ratio（A394/A447）of TNS-2 in the presence of sulfite/sulfode/Hcy. ［TNS-2］=10 μM，［Na2SO3］=［H2S］=［Hcy］=100 μM，20 mM PBS/MeCN=2:1，pH 7.4.

2.3探針對(duì)亞硫酸鹽的選擇性和競(jìng)爭(zhēng)性

生物樣品一般都比較復(fù)雜，其他共存物可能會(huì)對(duì)亞硫酸鹽的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，因此測(cè)試探針TNS-2對(duì)亞硫酸鹽的選擇性和競(jìng)爭(zhēng)性非常必要。圖5a為探針與不同種離子在相同實(shí)驗(yàn)條件下反應(yīng)10分鐘后的吸收光譜，由圖5a可知大多數(shù)分析物對(duì)探針的吸收光譜無(wú)明顯影響，亞硫酸鹽的存在使得探針吸收光譜發(fā)生113 nm的藍(lán)移，小分子硫醇Cys、Hcy和GSH對(duì)探針的光譜有較小的影響，表明TNS-2對(duì)亞硫酸根具有較好的選擇性，能較短時(shí)間內(nèi)特異性識(shí)別亞硫酸根。圖5c是在自然光下，各種不同分析物對(duì)探針溶液顏色的影響。亞硫酸鹽使得溶液的顏色由黃色變?yōu)闊o(wú)色，其他分析物對(duì)溶液顏色影響較小，表明TNS-2可以實(shí)現(xiàn)對(duì)亞硫酸鹽的裸眼識(shí)別。

圖5　不同分析物在無(wú)（a）有（b）亞硫酸鹽存在下對(duì)TNS-2紫外可見吸收光譜的影響，（c）不同分析物存在時(shí)TNS2溶液的顏色。［TNS-2］=10 μM，分析物濃度為100 μM，20 mM PBS/MeCN=2:1，pH 7.4，平衡時(shí)間10 min。分析物：（1）亞硫酸鈉，（2）探針本身，（3）Cys，（4）GSH，（5）硝酸鈉，（6）Hcy，（7）硫化鈉，（8）硫酸鈉，（9）硫代硫酸鈉。Fig. 5 The UV-vis spectrum of TNS-2 in the presence of different analytes without（a）and with（b）sulfite，and the photograph of TNS-2 without and with different additives. ［TNS-2］=10 μM，［analyte］=100 μM，20 mM PBS/MeCN=2:1，pH 7.4，equilibrium time=10 min. Analytes:（1）sulfite，（2）none，（3）Cys，（4）GSH，（5）NaNO2，（6）Hcy，（7）sulfide，（8）Na2SO4，（9）Na2S2O3。

圖5b是其他分析物共存時(shí)對(duì)亞硫酸鹽-TNS-2體系吸收光譜的影響，由圖可知其他分析物的存在對(duì)亞硫酸鹽的檢測(cè)幾乎沒有影響，表明探針分子具有較好的競(jìng)爭(zhēng)性，在對(duì)實(shí)際樣品中亞硫酸鹽的檢測(cè)具有潛在應(yīng)用。

2.4亞硫酸鹽的濃度滴定曲線

基于圖5所示探針TNS-2對(duì)亞硫酸鹽良好的選擇性和競(jìng)爭(zhēng)性，本文測(cè)試了TNS-2對(duì)亞硫酸鹽的濃度滴定曲線。在PBS/MeCN（2:1）體系中，向TNS-2（10 μM）中分別滴加0～300 μM的亞硫酸鹽，反應(yīng)時(shí)間為10 min。從圖6a可知，隨著亞硫酸鹽濃度的增加，探針本身在447 nm處的吸收峰逐漸降低，在334 nm處出現(xiàn)新的吸收峰且新峰的強(qiáng)度隨亞硫酸鹽濃度的增加而增大。以334 nm和447 nm處的吸光度比值（A334/ A447）對(duì)亞硫酸鹽濃度作圖（圖6b）可知，在亞硫酸鹽濃度為0.2～40 μM范圍內(nèi)，A334 / A447與亞硫酸鹽濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為7.0 ×10-8 mol/L，表明探針能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)亞硫酸鹽的高靈敏度定量。

圖6?。╝）亞硫酸鹽濃度對(duì)探針TNS-2紫外吸收光譜的影響，（b）吸光度比值A(chǔ)334/A447與亞硫酸濃度的關(guān)系曲線。［TNS-2］=10 μM，20 mM PBS/MeCN=2:1，pH 7.4，每次滴定平衡時(shí)間10 min.Fig. 6 Effect of sulfite concentration on the UV-vis spectrum of TNS-2（a）and the absorbance ratio of A334/A447vs sulfite concentration（b）.［TNS-2］=10 μM，20 mM PBS/MeCN=2:1，pH 7.4，recorded 10 min after each addition.

3　結(jié)論

通過(guò)改變?nèi)〈碾娮有?yīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)小分子含硫化合物的同時(shí)及區(qū)分檢測(cè)，合成的化合物TNS-2對(duì)亞硫酸鹽具有較高的檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)線低至7.0 ×10-8 mol/L。本研究為小分子含硫化合物的檢測(cè)提供了新的思路。

［1］ Reiffenstein R J，Hulbert W C，Roth S H. Toxicology of hyogen sulfide［J］. Annu Rev Pharmacol Toxicol，1992，32:109-134.

［2］ Rahman I，MacNee W. Regulation of redox glutathione levels and gene transcription in lung inflammation: therapeutic approaches［J］. Free Radic. Biol. Med，2000，28:1405-1420.

［3］ Townsend D. M.，Tew K. D.，Tapiero H. The importance of glutathione in human disease［J］. Biomedicine & Pharmacotherapy，2003，57（3-4）: 145-155.

［4］ Fazio T，Warner C R. A review of sulphites in foods: Analytical methodology and reported findings［J］. Food Addit. Contam，1990，7:433-454.

［5］ De A L C，Reis M M，Motta L F，et al. Evaluation of the Formation and Stability of Hydroxyalkylsulfonic Acids in Wines［J］. J. Agric. Food Chem，2007，55: 8670-8680.

［6］ Ku mierek K，Chwatko G，G owacki R，et al. Determination of endogenous thiols and thiol drugs in urine by HPLC with ultraviolet detection［J］. J. Chromatogr. B. 2009，877: 3300-3308.

［7］ McDermott G P，Terry J M，Conlan X A，et al. Direct Detection of Biologically Significant Thiols and Disulfides with Manganese（IV）Chemiluminescence［J］. Anal. Chem，2011，83: 6034-6039.

［8］ Ivanov A R，Nazimov I V，Baratova L A. Qualitative and quantitative determination of biologically active low-molecularmass thiols in human blood by reversed-phase high-performance liquid chromatography with photometry and fluorescence detection［J］. J. Chromatogr. A，2000，870:433-442.

［9］ Inoue T，Kirchhoff J R. Determination of Thiols by Capillary Electrophoresis with Amperometric Detection at a Coenzyme Pyrroloquinoline Quinone Modified Electrode［J］. Anal. Chem，2002，74:1349-1354.

［10］ Wang J F，Jin S，Senol A，et al. Design and Synthesis of Long-Wavelength Fluorescent Boronic Acid Reporter Compounds［J］. Eur. J. Org. Chem.，2007，2007（13）: 2091-2099.

［11］ Schmidt A C，Lauckner S，Lindner K. CZE of Sulfur-Containing Amino Acids and Peptides and Its Application to the Quantitative Study of Heavy Metal-Caused Thiol Oxidations［J］. Chromatographia，2012，75: 661-670.

［12］ Seiwert B，Karst U. Simultaneous LC/MS/MS Determination of Thiols and Disulfides in Urine Samples Based on Differential Labeling with Ferrocene-Based Maleimides［J］. Anal. Chem.，2007，79:7131-7138.

［13］ MacCoss M J，F(xiàn)ukagawa N K，Matthews D E. Measurement of Homocysteine Concentrations and Stable Isotope Tracer Enrichments in Human Plasma［J］. Anal. Chem. 1999，71: 4527-4533.

［14］ Vellasco A P，Haddad R，Eberlin M N，et al. Combined cysteine and homocysteine quantitation in plasma by trap and release membrane introduction mass spectrometry［J］. Analyst，2002，127:1050-1053.

［15］ Wang W，Li L，Liu S，et al. Determination of Physiological Thiols by Electrochemical Detection with Piazselenole and Its Application in Rat Breast Cancer Cells 4T-1［J］. J. Am. Chem. Soc. 2008，130:10846-10847.

Synthesis of TCF-based Colorimetric Probes and Their Application in Sulfite Detection

Liu Tianqi，Zhao Yu，Tian Haiyu，Wang Zhiqiang，Zhang Dongsheng，Liu Shanshan，Zou Dongxuan*，Qian Junhong*
（School of Chemistry & Molecular Engineering，East China University of Science & Technology，Shanghai 200237，China）

Three colorimetric probes were synthesized with 2-dicyanomethylene-3- cyano-4，5，5-trimethyl-2，5-dihydrofuran（TCF）as the chromophore. The spectral responses of the probes toward several sulfur-containing molecules such as sulfite，sulfide and thiols，were investigated. The results showed that TNS-2 exhibited good selectivity toward sulfite. The absorbance ratio at 334 nm and 447 nm（A334 / A447）was linear with sulfite concentration over the range of 0.2-40 μM. The detection limit for sulfite was calculated to be 7.0 ×10-8 mol/L，revealing that TNS2 is quite sensitive to sulfite.

2-dicyanomethylene-3-cyano-4，5，5-trimethyl-2，5-dihydrofuran； colorimetric probe； small weighted

Q65［Document Code］ A

10. 11967/ 2016140405

Q65

ADOI: 10. 11967/ 2016140405

?通訊聯(lián)系人：鄒冬璇，碩士，助理工程師，e-mail: dongxuanzou@ecust.edu.cn。

本文受到國(guó)家自然科學(xué)基金（21576085）和上海市自然科學(xué)基金（15ZR1409000）的資助。