楊占武，楊 君，張 艷，吳金華，李志坤，王省芬，吳立強，張桂寅，馬峙英

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棉花的亞細胞定位及其超表達煙草抗病性分析

楊占武，楊 君，張 艷，吳金華，李志坤，王省芬，吳立強，張桂寅，馬峙英

（河北農業(yè)大學農學院/教育部華北作物種質資源研究與利用重點實驗室，河北保定071001）

【目的】研究棉花NB-LRR家族基因的亞細胞定位及超表達煙草的黃萎病抗性，為解析介導的植物抗黃萎病機制提供依據?！痉椒ā繉φ婧吮磉_載體pJCV52進行改造，在Ⅰ酶切位點插入，使其兼具亞細胞定位的功能，命名為GPJCV52。應用Gateway技術構建的亞細胞定位和超表達載體，并分別轉化農桿菌GV3101。利用生物信息學和農桿菌介導的煙草瞬時表達技術對GbRvd分別進行亞細胞定位預測與觀察。采用農桿菌介導法轉化煙草，并通過組織培養(yǎng)技術獲得轉基因植株。運用PCR對超表達的煙草進行陽性植株篩選，且利用半定量RT-PCR對陽性轉基因植株進行表達檢測。制備棉花黃萎病菌孢子懸浮液，通過灌根法對T3代轉基因煙草株系進行接種，利用5級標準統(tǒng)計發(fā)病情況并計算病情指數(shù)。【結果】利用在線分析軟件ProtComp預測GbRvd為一種胞外（分泌）蛋白；GbRvd的跨膜預測結果顯示其包含3個跨膜域；在線分析軟件WoLF PSORT預測結果顯示GbRvd在細胞膜、內質網及葉綠體的預測分值分別為7、3和1，表明GbRvd主要存在于植物細胞膜上。利用農桿菌介導的煙草瞬時表達技術進一步對GbRvd的亞細胞定位進行觀察，結果顯示在單獨表達GFP蛋白的煙草細胞中，熒光信號在細胞核、細胞質和細胞膜均有分布；而GbRvd與GFP融合表達后的熒光信號主要分布于煙草表皮細胞質和細胞膜。綜合生物信息學分析和亞細胞定位觀察結果，表明細胞膜和細胞質是GbRvd的主要分布位置。利用農桿菌介導和組織培養(yǎng)獲得了轉基因煙草植株，通過對轉基因煙草植株的PCR檢測顯示，陽性轉基因煙草植株能夠通過PCR擴增出與預期大小一致的目的條帶，而野生型植株未出現(xiàn)相應條帶；陽性轉基因煙草植株半定量RT-PCR同樣能夠檢測出與預期大小一致的目的條帶，由此表明成功整合于煙草基因組并能夠進行正常轉錄。對3個T3代超表達煙草株系的黃萎病抗性進行分析，結果顯示超表達的煙草植株病情指數(shù)顯著低于野生型對照植株，表明過表達可有效提高植株對黃萎病的抗性?！窘Y論】GbRvd主要存在于植物細胞質和細胞膜，其超表達可顯著提高煙草對黃萎病的抗性。

棉花；；亞細胞定位；轉基因煙草；黃萎病

0 引言

【研究意義】黃萎病（Verticillium wilt）是影響棉花生產的主要病害之一，已成為制約中國棉花生產實現(xiàn)高產、穩(wěn)產和優(yōu)質的瓶頸，抗黃萎病機制研究是抗病育種領域的重要科學問題之一[1-2]。對棉花抗黃萎病相關基因的發(fā)掘和功能研究，不僅有助于全面闡述棉花抗黃萎病機制，還為棉花抗病遺傳改良提供重要理論依據。【前人研究進展】目前，一些參與棉花抗黃萎病的重要基因已經被成功克隆和研究，如[3]、和[4]及[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]等。其中，編碼蛋白屬于NB-LRR（nucleotide-binding-leucine rich repeat）家族，而該家族通過免疫識別參與植物對多種病原的抗性，如病毒、細菌、真菌、昆蟲、線蟲等[12]。目前，大多數(shù)已知的R（resistance）蛋白來自該家族。NB-LRR家族蛋白含有3個獨立的結構域：N端CC（coiled-coil）/TIR（Toll-interleukin 1 receptor），中心NB（nucleotide- binding，亦稱為NB-ARC，nucleotide-binding adaptor shared by Apaf1, certain R genes and CED4）和C端富含亮氨酸重復序列（leucine-rich repeat，LRR）。關于NB-LRR介導的植物免疫機制主要歸結為2種：其一，按照基因對基因假說，NB-LRR直接與病菌效應子（effector）互作，以使它們不能發(fā)揮致病作用[13]；其二，間接保護機制，即NB-LRR識別病菌效應子與植物預警蛋白（guard protein）的結合，進而引發(fā)植物免疫反應[14]。擬南芥（）基因組中包含大約150個NB-LRR基因，其中幾個獲得了較深入的研究，如（resistance to）被證明參與霜霉?。╠owny mildew）抗性[15]，RPS4（resistance to4）和RRS1-R識別效應子PopP2引發(fā)植物對的抗性[16]，以及RPS5能夠被效應子AvrPphB激活[17]等。在棉花基因組中，僅二倍體亞洲棉（）和雷蒙德氏棉（）注釋的NB-LRR家族基因就分別有280和391個[18]，因此，研究NB-LRR基因的功能具有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于棉花NB-LRR家族基因的克隆和抗黃萎病功能的研究還鮮有報道。河北農業(yè)大學棉花遺傳育種研究室前期從黃萎病菌（）脅迫處理后的海島棉（）中篩選并克隆到一個編碼CC-NB-LRR家族蛋白的基因——，并通過VIGS（virus induced gene silencing）技術初步證實其在棉花抗黃萎病過程中發(fā)揮重要作用[11]?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過生物信息學分析和亞細胞定位觀察，綜合確定GbRvd在植物細胞中的分布位置。利用遺傳轉化獲得超表達的轉基因煙草株系，并通過接菌處理和病情指數(shù)分析，進一步明確其抗病功能，為解析其抗黃萎病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型本氏煙草（）由清華大學劉玉樂教授饋贈，種植于溫度25℃，濕度60%—70%，光照強度5 000 lx，16 h光照/8 h黑暗的光照培養(yǎng)室中。

落葉型黃萎病菌臨西2-1由河北農業(yè)大學棉花遺傳育種研究室分離鑒定并繼代保存于PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基。大腸桿菌DB3.1、DH5α及農桿菌GV3101由河北農業(yè)大學棉花遺傳育種研究室保存。植物真核表達載體pJCV52由比利時根特大學VIB植物科學研究所饋贈，載體詳細信息參見網站https:// gateway.psb.ugent.be/search；Gateway?載體pDONRTM207、攜帶編碼綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因質粒pGM-GFP和攜帶質粒pGM-GbRvd均由河北農業(yè)大學棉花遺傳育種研究室保存。高保真酶2×PhantaTMMaster Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；pGM-T載體、2×Taq PCR Master Mix、T4 DNA連接酶、限制性內切酶、質粒小提試劑盒及植物基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；BP ClonaseTMEnzyme Mix和LR ClonaseTMEnzyme Mix購自賽默飛世爾科技中國有限公司；膠回收試劑盒購自OMEGA Bio-Tek公司；其他生化試劑均為進口或國產分析純。

引物合成以及DNA測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 生物信息學分析

在線軟件ProtComp Version 9.0（http://www. softberry.com/berry.phtml?topic=protcomp pl&group= program s&subgroup=proloc）和WoLF PSORT（http:// www.genscript.com/wolf-pso r.html）[19]用于蛋白的亞細胞定位預測；在線軟件TMpred（http://www.ch. embnet.org/softwar e/TMPRED_form.html）用于蛋白的跨膜域分析。

1.3 亞細胞定位載體的構建

以質粒pGM-GFP為模板，利用引物SGFP-F：5′-GGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′和SGFP-R：5′-GGGCTTGTACAGCTCGT CCATGC-3′（下劃線為Ⅰ酶切位點），擴增ORF序列（去終止子）。PCR反應體系（20 μL）為1 μL pGM-GFP質粒、1 μL SGFP-F、1 μL SGFP-R、10 μL 2×PhantaTMMaster Mix和7 μL去離子水。PCR反應程序為94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃10 min。將目的片段進行膠回收，連接于pGM-T載體并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR篩選陽性克隆并測序。提取測序完全正確的單克隆質粒，經Ⅰ單酶切后用T4 DNA連接酶與相同酶切后的pJCV52載體連接（16℃過夜）。連接產物轉化大腸桿菌DB3.1感受態(tài)細胞，并在含有慶大霉素（100 mg·L-1）的LB培養(yǎng)基平板上進行陽性克隆篩選并測序。測序正確的載體命名為GPJCV52，并用于后續(xù)亞細胞定位研究。

1.4 植物亞細胞定位及超表達載體的構建

以質粒pGM-GbRvd為模板，通過引物gRvd-F （5′-ATGGGGACTCACATCTTGAAATC-3′）和gRvd-R（5′-GCGCAAGATGTTTTGGAATATGA-3′）擴增含有Gateway通用接頭（下劃線表示）的ORF序列。PCR反應體系（20 μL）為1 μL pGM-GbRvd質粒、1 μL gRvd-F、1 μL gRvd-R、10 μL 2×PhantaTMMaster Mix和7 μL去離子水。PCR反應程序為94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃3 min，35個循環(huán)；72℃10 min。回收目的條帶進行BP反應，體系（5 μL）為2 μL PCR產物（＞10 ng）、2 μL pDONRTM207（＞150 ng）、1 μL BP ClonaseTMEnzyme Mix。體系轉化方法：將體系混勻后，于PCR儀25℃反應10 h；加1 μL Proteinase K，37℃ 10 min終止反應；轉化DH5α后進行陽性克隆篩選（慶大霉素）和測序。測序正確的質粒命名為pDONRTM207-GbRvd。通過LR反應將分別克隆至GPJCV52載體和pJCV52，反應體系（5 μL）為2 μL pDONRTM207-GbRvd（＞150 ng）、2 μL GPJCV52或pJCV52（＞150 ng）、1 μL LR ClonaseTMEnzyme Mix。體系轉化方法同BP反應，陽性克隆篩選抗性變?yōu)閴延^霉素（100 mg·L-1）。測序正確的載體分別命名為GPJCV52-GbRvd和pJCV52-GbRvd。構建超表達GFP的載體pJCV52-gfp的方法同GPJCV52-GbRvd，僅所用引物序列變?yōu)椋篻GFP-F（5′-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；gGFP-R（5′-CGGTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′）（下劃線表示Gateway通用接頭）。

1.5 農桿菌轉化

載體轉化農桿菌GV3101參考An[20]的方法。利用引物gGFP-F/gGFP-R和gRvd-F/gRvd-R分別對轉化表達載體pJCV52-GbRvd、pJCV52-gfp和GPJCV52- GbRvd的農桿菌進行菌落PCR鑒定。

1.6 蛋白亞細胞定位

參考Sparkes等[21]方法進行目的蛋白在煙草瞬時表達。具有4片真葉的野生型本氏煙草生長用于農桿菌侵染。方法簡述如下：農桿菌于含有壯觀霉素和利福平（100 mg·L-1）的LB液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)（28℃，200 r/min），至菌液OD600約為1.0時，通過離心（6 000 r/min，10 min）收集和清洗（滅菌去離子水）細胞，重懸于侵染液（2-(N-嗎啡啉)乙磺酸9.76 g·L-1、葡萄糖50 g·L-1、Na3PO4·12H2O 0.76 g·L-1、乙酰丁香酮0.0196 g·L-1）并調整OD600≈0.2，置于室溫待用。用1 mL注射器將重懸于侵染液中的農桿菌注入煙草葉背面，之后暗培養(yǎng)24 h，再正常培養(yǎng)2—3 d。撕取侵染后的煙草葉片下表皮，置于接有熒光激發(fā)模塊U-RFL-T（Olympus，Tokyo，Japan）的BX51型顯微鏡（Olympus，Tokyo，Japan）下，通過Image-Pro?Plus 6.0 software（Media Cybernetics，Rockville，MD，USA）觀察并拍照記錄。

1.7 農桿菌介導的煙草遺傳轉化

活化含有真核表達載體pJCV52-GbRvd的農桿菌GV3101，用于侵染煙草葉片，具體方法如下：將活化的農桿菌于含有壯觀霉素和利福平（100 mg·L-1）的LB液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)（28℃，200 r/min），至菌液OD600約為1.0時，通過離心（6 000 r/min，10 min）收集和清洗（滅菌去離子水）細胞，重懸于侵染液（2-(N-嗎啡啉)乙磺酸9.76 g·L-1、葡萄糖50 g·L-1、Na3PO4·12H2O 0.76 g·L-1、乙酰丁香酮0.0196 g·L-1），并調整OD600≈0.2；用1 mL注射器將重懸于侵染液中的農桿菌注入煙草葉背面，侵染后的煙草暗培養(yǎng)24 h，再正常光照培養(yǎng)2—3 d后用于組織培養(yǎng)。組織培養(yǎng)的具體方法如下：將農桿菌侵染的煙草葉片于70%的乙醇溶液中消毒1 min，1/1000的升汞溶液消毒3 min，之后用滅菌水清洗3—5次。在無菌條件下將消毒后的煙草葉片切成1 cm2大小，放入生芽培養(yǎng)基（2.15 g·L-1MS培養(yǎng)基、8 g·L-1瓊脂、30 g蔗糖、0.1 mg·L-1吲哚丁酸、0.8 mg·L-16-芐氨基嘌呤、100 mg·L-1卡那霉素和100 mg·L-1頭孢霉素）中培養(yǎng)（25℃，16 h光照/8 h黑暗）。3—4周后，將幼芽從基部與愈傷組織分離并插入生根培養(yǎng)基（2.15 g·L-1MS培養(yǎng)基、8 g·L-1瓊脂、30 g蔗糖、0.5 mg·L-1吲哚丁酸、100 mg·L-1卡那霉素和100 mg·L-1頭孢霉素）中培養(yǎng)。約10 d后，將生根幼苗移栽至營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.8 轉基因煙草檢測

提取煙草基因組DNA。以其為模板，利用全長擴增引物RvdORF-F（5′-ATGGGGACTCACAT CTTGAAATC-3′）和RvdORF-R（5′-GCGCAAGATG TTTTGGAATATGA-3′）擴增，檢測在轉基因煙草中的插入情況。PCR反應體系和程序設置同1.4。

在煙草中的表達采用半定量RT-PCR檢測。煙草RNA提取和反轉錄分別通過EasySpin植物RNA提取試劑盒和PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser，具體操作按照說明書進行。半定量引物為qRvd-F（5′-GGAAGGTTCGTAGGGTTTCT GTGC-3′）和qRvd-R（5′-CTACTGCCTCCTCCGAAAA GAACTC-3′）。煙草α作為內參，引物為EF1α-F（5′-ACGCTTGAGATCCTTAACCGC-3′）和EF1α-R（5′-ACGCTTGAGATCCTTAACCGC-3′）。反應體系為1 μL cDNA、1 μL正向引物、1 μL反向引物、10 μL 2×Taq PCR Master Mix和7 μL去離子水。PCR反應程序為94℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，25個循環(huán)；72℃10 min。反應結束后進行1%瓊脂糖電泳檢測并拍照。

1.9 轉基因煙草抗病性鑒定

用T3代轉基因煙草進行黃萎病抗性鑒定。參考Yang等[11]的方法進行黃萎病菌孢子懸浮液的制備。煙草種植于體積為600 mL的六棱缽中，生長約4周后用于灌根接菌，接菌量60 mL，濃度為1×107孢子/mL。操作如下：接菌前3 d停止對植株澆水，以使土壤含水量降低而易于菌液吸收；用醫(yī)用注射器將孢子懸浮液注入距植株1 cm處培養(yǎng)土中，注射深度2 cm。接菌后的植株于溫室條件下繼續(xù)培養(yǎng)。20 d后檢查植株發(fā)病情況，并按黃萎病溫室苗期發(fā)病的5級制分級記錄，即0級為植株無癥狀表現(xiàn)；1級為1—2片真葉發(fā)病；2級為3—4片真葉發(fā)病；3級為4片真葉以上發(fā)病或脫落；4級為全株枯死。病情指數(shù)（Disease index）= [Σ（發(fā)病級數(shù)×該級株數(shù)）]÷（調查總株數(shù)×4）×100。轉基因煙草黃萎病抗病性鑒定試驗共重復3次，每次處理不少于20株植株。使用GraphPad Prism?6軟件進行差異顯著性分析及制圖。

2 結果

2.1 GbRvd亞細胞定位

利用ProtComp和WoLF PSORT 2個在線分析軟

件對GbRvd進行亞細胞定位預測。ProtComp預測采用神經網絡（neural nets）算法，結果顯示，GbRvd為一種胞外（分泌）蛋白；WoLF PSORT是根據分選信號（sorting signals）、氨基酸組成（amino acid composition）和功能域（functional motif），采用簡單的-nearest neighbor classifier算法進行的預測，獲得GbRvd在細胞膜（plasma membrane）、內質網（endoplasmic reticulum）及葉綠體（chloroplast）的預測分值分別為7、3和1。此外，GbRvd的跨膜預測結果顯示其包含3個跨膜域（圖1）：（1）從第2位氨基酸殘基到第18位氨基酸殘基；（2）從第355位氨基酸殘基到第373位氨基酸殘基；（3）從第584位氨基酸殘基到第605位氨基酸殘基。綜合以上生物信息學分析結果，推測GbRvd主要存在于植物細胞膜上。

為進一步確認GbRvd在細胞中的位置，將其與GFP進行融合，在煙草表皮細胞中進行瞬時表達（圖2）。在單獨表達GFP蛋白的煙草細胞中，熒光分布于細胞核、細胞質和細胞膜；而對于GbRvd-GFP融合表達，熒光主要分布于煙草細胞膜和細胞質。綜合預測和觀察的結果，表明細胞膜和細胞質是GbRvd主要的分布位置。

①、②、③：3個跨膜域 ①, ②, ③: Three transmembrane domains

圖2 GbRvd在煙草表皮細胞中的亞細胞定位

2.2 轉GbRvd煙草植株的獲得

為進一步分析的抗黃萎病功能，將其ORF克隆至超表達載體pJCV52并轉入農桿菌。農桿菌浸染后的煙草葉片首先在生芽培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3—4周后開始產生愈傷組織，再經過約10 d后愈傷組織分化出不定芽（圖3-A）；待不定芽分化出明顯的莖和葉時，將其與愈傷組織分離并插入篩選生根培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)（圖3-B）；經過7—10 d，植株生出根（圖3-C）；在根伸長至2—3 cm時，將植株移栽至營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)成完整、健壯的植株（圖3-D）。

A：愈傷組織的形成；B：誘導不定根；C：生出不定根；D：轉基因植株

利用的ORF全長擴增引物RvdORF-F和RvdORF-R對T2代轉基因（OE）植株做進一步的檢測，部分PCR擴增檢測結果如圖4所示：10個轉基因株系均能擴增獲得約3 000 bp大小的目的條帶（ORF測序全長2 928 bp），而野生型（WT）植株未有目的帶擴增出現(xiàn)。此外，半定量RT-PCR檢測結果顯示，相對于野生型，僅在轉基因植株中轉錄（圖5）。由此表明，成功整合進煙草染色體并正常轉錄，獲得轉基因煙草植株。

M：DNA maker DL5000；1—3：陽性植株；4：陰性對照；5：野生型

OE：過表達；WT：野生型 OE: Over-expression; WT: Wild type

2.3 轉基因煙草的抗病性鑒定

通過對其中的3個轉基因株系做進一步的抗黃萎病功能分析。野生型和轉煙草植株接菌處理12 d后出現(xiàn)發(fā)病植株，20 d后野生型比轉基因型葉片更加黃化、萎蔫（圖6-A）。統(tǒng)計分析結果顯示，超表達的煙草植株病情指數(shù)顯著低于野生型對照（圖6-B）。由此可見，過表達可以有效提高煙草植株對黃萎病的抗性。

3 討論

面對病原菌的侵染，植物先天免疫系統(tǒng)（innate immune system）通常調用兩道防御反應：依賴于細胞表面受體識別而啟動的PTI（pathogen associated molecular patterns triggered immunity）和由NB-LRR等免疫受體（immune receptor）識別病菌效應子后的ETI（effector triggered immunity）[22]。為了更加有效地識別和啟動ETI，NB-LRR等必須存在于植物細胞中更有利于發(fā)揮作用的位置。因此，亞細胞定位研究對于解析NB-LRR的抗病功能至關重要[23]。NB-LRR在植物免疫反應中發(fā)揮著識別病菌效應子和啟動植物免疫的雙重作用[24]，因而，對于不同的NB-LRR在不同的功能時期其在植物細胞中的發(fā)生位置可能會明顯不同。目前，已經有一些通過熒光蛋白標記對NB-LRR進行亞細胞定位的研究。一個蛋白序列中無標準核定位信號（nuclear localization signal，NLS）的煙草蛋白N，熒光標記顯示其位于植物細胞核和細胞質中[25]。同樣無NLS的大麥（）蛋白MLA10，其也定位于細胞核和細胞質[26]。擬南芥RRS1-R有NLS和WRKY轉錄因子結構域，定位于細胞核[16]。另一個擬南芥NB-LRR蛋白RPS4，其含有NLS，定位于細胞核和細胞質。通過蔗糖梯度離心等分離技術，NS-LRR的其他亞細胞定位被發(fā)現(xiàn)，如RPS4、RPP1A、RPM1等，它們可能還存在于細胞膜、內質網和高爾基體等位置[27-29]。由此可見，NB-LRR家族蛋白在植物細胞中的分布與它們的蛋白功能域之間存在著不一致。NB-LRR在細胞中的位置較多樣，可能與其識別不同病菌效應子和啟動不同的免疫通路相關，亦或受不同的伴侶蛋白所調控，如WRKY[30]、SRFR1（Suppressor of）[31]等。GbRvd擁有NLS[11]，但在本研究中其僅定位于細胞膜和細胞質，而未能在細胞核中發(fā)現(xiàn)。因此，推測GbRvd可能負責病原菌識別和向胞內傳遞免疫信號的功能，而進一步的激活植物免疫反應可能還需要其他蛋白輔助完成。

A：黃萎病菌侵染20 d后的煙草發(fā)病現(xiàn)象；B：病指統(tǒng)計分析。OE：超表達植株；WT：野生型；**表示OE組和WT組之間有顯著差異（P＜0.01，Student’s t-test）。圖中數(shù)值為平均值±SE（n=3）

Zhao等[32]將玉米NB-LRR基因轉入水稻中超表達，且有效地提高了水稻對細菌性條斑?。╬v.）的抗性。Wang等[33]克隆了一個水稻NB-LRR基因，其超表達能夠顯著提高感病水稻品種對細菌性條斑病的抗性。Weaver等[28]將進行超表達，使擬南芥獲得對霜霉病菌和丁香假單胞菌的廣譜抗性。

在中國農業(yè)科學院棉花研究所測序的陸地棉TM-1基因組數(shù)據庫中進行比對，結果顯示與TM-1中同源性最高的基因CotAD_76302（locus: scaffold4990.1:14013:18271）的序列相似度僅為58%。在煙草和擬南芥等模式植物中未比對到的同源基因。本研究將轉入煙草，并獲得穩(wěn)定表達植株。黃萎病菌處理后，超表達的煙草抗病性獲得顯著提高。異源超表達不僅進一步驗證了的抗病功能，還為該類基因在未來農業(yè)中的應用提供了重要依據。

4 結論

棉花NB-LRR蛋白GbRvd主要分布于植物細胞質與細胞膜。獲得轉的煙草植株，其超表達顯著提高了煙草對黃萎病的抗性，進一步證明介導棉花抗黃萎病反應，是一個重要的抗病因子。

References：

[1] 馬存, 簡桂良, 鄭傳臨. 中國棉花抗枯、黃萎病育種50年. 中國農業(yè)科學, 2002, 35(5): 508-513.

Ma C, Jian G L, Zheng C L. The advances in cotton breeding resistance to fusarium and Verticillium wilts in China during past fifty years., 2002, 35(5): 508-513. (in Chinese)

[2] 潘家駒, 張?zhí)煺? 棉花黃萎病抗性遺傳研究. 南京農業(yè)大學學報, 1994, 17(3): 8-18.

Pan J J, Zhang T Z. Studies on the inheritance of resistance to Verticillum dahliae in cotton., 1994, 17(3): 8-18. (in Chinese)

[3] Zhang Y, Wang X F, Yang S, Chi J N, Zhang G Y, Ma Z Y. Cloning and characterization of a Verticillium wilt resistance gene fromand functional analysis in., 2011, 30(11): 2085-2096.

[4] Gao X Q, Wheeler T, Li Z H, Kenerley C M, He P, Shan L B. Silencingandcompromises cotton resistance to Verticillium wilt., 2011, 66(2): 293-305.

[5] Zhang B L, Yang Y W, Chen T Z, Yu W G, Liu T L, Li H J, Fan X H, Ren Y Z, Shen D Y, Liu L, Dou D L, Chang Y H. Island cottongene encoding a receptor-like protein confers resistance to both defoliating and non-defoliating isolates of Verticillium dahliae., 2012, 7(12): e51091.

[6] Gao X Q, Li F L, Li M Y, Kianinejad A S, Dever J K, Wheeler T A, Li Z H, He P, Shan L B. Cottonmediates Verticillium wilt resistance and cell death., 2013, 55(7): 586-596.

[7] Su X F, Qi X L, Cheng H M. Molecular cloning and characterization of enhanced disease susceptibility 1 () from., 2014, 41(6): 3821-3828.

[8] Li C, He X, Luo X Y, Xu L, Liu L L, Min L, Jin L, Zhu L F, Zhang X L. Cotton WRKY1 mediates the plant defense-to- development transition during infection of cotton byby activating JASMONATE ZIM-DOMAIN1 expression., 2014, 166(4): 2179-2194.

[9] Yang J, Ji L L, Wang X F, Zhang Y, Wu L Z, Yang Y N, Ma Z Y. Overexpression of 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase gene fromenhancesresistance to Verticillium wilt., 2015, 34(8): 1429-1441.

[10] 楊君, 張艷, 王偉巧, 吳金華, 王國寧, 馬峙英, 王省芬. 海島棉. 植物遺傳資源學報, 2015(3): 594-602.

Yang J, Zhang Y, Wang W Q, Wu J H, Wang G N, Ma Z Y, Wang X F, Cloning offromand validation of Verticillium wilt resistance in transgenic., 2015(3): 594-602. (in Chinese)

[11] Yang J, Ma Q, Zhang Y, Wang X F, Zhang G Y, Ma Z Y. Molecular cloning and functional analysis of, a gene inthat plays an important role in conferring resistance to Verticillium wilt., 2016, 575(2): 687-694.

[12] Gururani M A, Venkatesh J, Upadhyaya C P, Nookaraju A, Pandey S K, Park S W. Plant disease resistance genes: Current status and future directions., 2012, 78(51): 51-65.

[13] Flor H H. Current status of the gene-for-gene concept., 1971, 9(1): 275-296.

[14] McHale L, Tan X P, Koehl P, Michelmore R W. Plant NBS-LRR proteins: adaptable guards., 2006, 7(4): 1-11.

[15] Adnane N, Susanna A, Tarone A M, Huang Y S, Keyan Z, Studholme D J, Magnus N, Jones J D G. Genome-wide survey ofnatural variation in downy mildew resistance using combined association and linkage mapping., 2010, 107(22): 10302-10307.

[16] Deslandes L, Olivier J, Peeters N, Feng D X, Khounlotham M, Boucher C, Somssich I, Genin S, Marco Y. Physical interaction between RRS1-R, a protein conferring resistance to bacterial wilt, and PopP2, a type III effector targeted to the plant nucleus., 2003, 100(13): 8024-8029.

[17] Qi D, DeYoung B J, Innes R W. Structure-function analysis of the coiled-coil and leucine-rich repeat domains of the RPS5 disease resistance protein., 2012, 158(4): 1819-1832.

[18] Li F G, Fan G Y, Wang K B, Sun F M, Yuan Y L, Song G L, Li Q, Ma Z Y, Lu C R, Zou C S, Chen W B, Liang X M, Shang H H, Liu W Q, Shi C C, Xiao G H, Gou C Y, Ye W W, Xu X, Zhang X Y, Wei H L, Li Z F, Zhang G Y, Wang J Y, Liu K, Kohel R J, Percy R G, Yu J Z, Zhu Y X, Wang J, Yu S X. Genome sequence of the cultivated cotton., 2014, 46: 567-572.

[19] Horton P, Park K J, Obayashi T, Fujita N, Harada H, Adams-Collier C J, Nakai K. WoLF PSORT: protein localization predictor., 2007, 35(Web Server issue): 585-587.

[20] An G. Binary ti vectors for plant transformation and promoter analysis., 1987, 153(153C): 292-305.

[21] Sparkes I A, Runions J, Kearns A, Hawes C. Rapid, transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants., 2006, 1(4): 2019-2025.

[22] Dodds P N, Rathjen J P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions., 2010, 11(8): 539-548.

[23] Cournoyer P, Dinesh-Kumar S P. Studying NB-LRR immune receptor localization by agroinfiltration transient expression., 2011, 712: 1-8.

[24] Chiang Y H, Coaker G. Effector triggered immunity: NLR immune perception and downstream defense responses., 2015, 11: e0183.

[25] Burch-Smith T M, Schiff M, Caplan J L, Tsao J, Czymmek K, Dinesh-Kumar S P. A novel role for the TIR domain in association with pathogen-derived elicitors., 2007, 5(3): e68.

[26] Shen Q H, Saijo Y, Mauch S, Biskup C, Bieri S, Keller B, Seki H, Ulker B, Somssich I E, Schulze-Lefert P. Nuclear activity of MLA immune receptors links isolate-specific and basal disease-resistance responses., 2007, 315(5815): 1098-1103.

[27] Wirthmueller L, Zhang Y, Jones J D G, Parker J E. Nuclear accumulation of the Arabidopsis immune receptor RPS4 is necessary for triggering EDS1-dependent defense., 2008, 17(23): 2023-2029.

[28] Weaver L M, Swiderski M R, Li Y, Jones J D G. TheTIR-NB-LRR R-protein, RPP1A; protein localization and constitutive activation of defence by truncated alleles in tobacco and., 2006, 47(6): 829-840.

[29] Boyes D C, Nam J, Dangl J L. Thedisease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response., 1998, 95(95): 15849-15854.

[30] Haruhiko I, Nagao H, Akane M, Liu X Q, Akira N, Shoji S, Jiang C J, Hiroshi T. Blast resistance of CC-NB-LRR protein Pb1 is mediated by WRKY45 through protein-protein interaction., 2013, 110(23): 9577-9582.

[31] Li Z Y, Li S X, Bi D L, Cheng Y T, Li X, Zhang Y L. SRFR1 negatively regulates plant NB-LRR resistance protein accumulation to prevent autoimmunity., 2010, 6(9): 8871-8887.

[32] Zhao B Y, Lin X H, Poland J, Trick H, Leach J, Hulbert S. A maize resistance gene functions against bacterial streak disease in rice., 2005, 102(43): 15383-15388.

[33] Wang X M, Chen J, Yang Y, Zhou J, Qiu Y, Yu C L, Cheng Y, Yan C Q, Chen J P. Characterization of a novelGene Involved in bacterial blight resistance in rice., 2013, 31(3): 649-656.

（責任編輯 李莉）

Subcellular Localization and Verticillium Wilt Resistance Analysis of Cottonin Overexpressed Tobacco

YANG Zhan-wu, YANG Jun, ZHANG Yan, WU Jin-hua, LI Zhi-kun, WANG Xing-fen, WU Li-qiang, ZHANG Gui-yin, MA Zhi-ying

(College of Agronomy, Hebei Agricultural University/North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Ministry of Education, Baoding 071001, Hebei)

【Objective】In order to resolve the mechanism of GbRvd-mediated resistance to Verticillium wilt in cotton, subcellular localization and resistance of-overexpressed tobacco were studied.【Method】Expression vector pJCV52 was modified by insertinggene intoⅠenzyme site and the resulted vector was named as GPJCV52 which can be used for subcellular localization. Gateway-based constructs, made for subcellular localization and overexpression of GbRvd, were transformed intostrain GV3101 for tobacco transformation. Subcellular localization of GbRvd was predicted and observed by bioinformatics analysis and-mediated transient expression in tobacco leaf, respectively. Transformation of tobacco was made by-mediatedmethod, and final transgenic tobacco plants were obtained through tissue culture. PCR and semi-quantitative RT-PCR were used for screening positive transgenic plants and detecting gene expression levels, respectively.conidial suspension was prepared and incubated with T3generation of transgenic tobacco strains through the method of soil drench.The disease severity for plants was graded from 0 to 4 and then the disease index was calculated.【Result】ProtComp, an online analysis software, predicted that GbRvd is an extracellular (secreted) protein. Transmembrane prediction showed that GbRvd contains three transmembrane domains. On-line analysis software WoLF PSORT prediction results showed that GbRvd localization in the cell membrane, endoplasmic reticulum and chloroplast scores were 7, 3 and 1, respectively, indicating that GbRvd mainly existed in the plant cell membrane. In order to further confirm the location of GbRvd in the cell, expression of GbRvd fused with GFP was examined. Fluorescence signal of control GFP protein in tobacco cells was observed in the nucleus, cytoplasm and cell membrane, and fluorescence signals of GbRvd fused with GFP were mainly detected in the plasma membrane and cytoplasm of tobacco epidermal cells. The transgenic tobacco plants were produced by-mediated infection and tissue culture method.PCR detection results showed that the expected size of DNA band could be amplified in positive transgenic tobacco plants, and that could not appear in wild type plants. By semi-quantitative RT-PCR expected band could also be detected in positive transgenic tobacco plants, which indicates thatsuccessfully integrated to the tobacco genome and can be normally transcribed. Three independent T3transgenic tobacco lines were selected toanalyze Verticillium wilt resistance. The results showed that the disease index of transgenic lines was significantly lower than that of wild-type, indicating that overexpression of GbRvd can effectively improve plant resistance to Verticillium wilt. 【Conclusion】GbRvd mainly exist in plant cell plasma and membrane, and its overexpression can significantly increase the resistance of tobacco to Verticillium wilt.

cotton;; subcellular location; transgenic tobacco; Verticillium wilt

2016-04-29；接受日期：2016-08-29

國家“863”計劃（2013AA102601）、國家自然科學基金（31301370）、河北省高等學?？茖W技術研究項目（QN2016009）

聯(lián)系方式：楊占武，Tel：0312-7528415；E-mail：1091748213@qq.com。通信作者馬峙英，Tel：0312-7528401；E-mail：mzhy@hebau.edu.cn