葉昌亞，張薄博，許贛榮

(江南大學(xué)，工業(yè)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

?

液態(tài)發(fā)酵條件對(duì)紅曲菌菌體形態(tài)及產(chǎn)物Monacolin K的影響

葉昌亞，張薄博，許贛榮*

(江南大學(xué)，工業(yè)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

紅曲菌是一種重要的食藥雙用絲狀真菌，紅曲菌9901種子擴(kuò)大培養(yǎng)及液態(tài)發(fā)酵過程中，發(fā)酵條件、菌體形態(tài)與代謝產(chǎn)物Monacolin K(MK)之間有著緊密的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，斜面菌種的種齡和孢子接種量對(duì)紅曲菌種子液的菌球直徑、菌球外菌絲長(zhǎng)度和菌體量等有明顯的影響；在30 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲菌菌體形態(tài)、生物量和代謝產(chǎn)物MK的產(chǎn)量有較明顯的影響。當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速較低時(shí)(150～350 r/min)，紅曲菌菌球直徑和菌球比例隨著轉(zhuǎn)速的加大而逐漸增加，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為350 r/min時(shí)，發(fā)酵液的中菌體為均勻的、較大的、表面光滑的菌絲球，其液態(tài)發(fā)酵合成MK 產(chǎn)量較高；當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min，初始直徑為1 500 μm的菌球減小至最終大小穩(wěn)定為900 μm的菌絲球，這些分散的、較小的、表面有較長(zhǎng)菌絲的菌絲球，液態(tài)發(fā)酵合成MK產(chǎn)量較低。最后選擇種子液初始菌球大小為1 500 μm，設(shè)攪拌轉(zhuǎn)速為350 r/min時(shí)，30 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵384 h時(shí)MK的產(chǎn)量為1 308 mg/L，進(jìn)而為更大規(guī)模的發(fā)酵罐以至工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。

紅曲菌；液態(tài)發(fā)酵罐發(fā)酵；菌體形態(tài)；菌絲球；Monacolin K

莫納可林K(Monacolin K，簡(jiǎn)稱為MK)[1]也稱為洛伐他汀(lovastatin)，是一種能夠抑制膽固醇生物合成途徑中的限速酶(HMG-CoA還原酶)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可有效降低體內(nèi)總膽固醇以及甘油三酯、低密度脂蛋白水平，從而有效降低冠心病和心肌梗塞的病發(fā)率和死亡率[2-5]。MK主要用土曲霉(Aspergillusterreus)和紅曲霉(Monascusruber)經(jīng)發(fā)酵制取。紅曲菌液態(tài)生產(chǎn)得到的MK多為酸式，其空間結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)HMG-CoA更為接近，其活性較內(nèi)酯式高約1倍，無需水解直接發(fā)揮抑制體內(nèi)膽固醇合成的作用[6-9]。采用紅曲菌液態(tài)發(fā)酵代替固態(tài)發(fā)酵，可實(shí)現(xiàn)大罐發(fā)酵，因而生產(chǎn)規(guī)模大，可節(jié)省大量人力，發(fā)酵水平較為穩(wěn)定，因而發(fā)展前景十分可觀[10-11]。

大罐液態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)MK的關(guān)鍵之一是如何在大容積的通風(fēng)機(jī)械攪拌或氣升式發(fā)酵罐中保持正常的、有活力的絲狀菌菌體形態(tài)。通常來說，絲狀真菌的形態(tài)可以分為絮狀菌絲(Dispersed mycelia)、團(tuán)塊狀成簇(Clumps)、結(jié)實(shí)的菌球(Dense pellets) 3類[12-14]。絲狀真菌的液體發(fā)酵過程中，菌體形態(tài)會(huì)不斷發(fā)生變化，其中菌體形態(tài)的變化不僅僅較難檢測(cè)及控制，并且會(huì)伴隨著攪拌器類型、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵液流變特性、傳質(zhì)特性及混合特性而發(fā)生變化[15]。微生物代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的高低，與發(fā)酵液中的菌體形態(tài)有密切關(guān)系[16-17]。CHEN[18]等研究發(fā)現(xiàn)阿魏蘑液體發(fā)酵過程中，漆酶產(chǎn)量在球狀菌體條件下高于絲狀、絮狀菌絲，直徑分布在0.2～0.4 mm范圍的菌球?qū)ζ崦傅暮铣删哂忻黠@的促進(jìn)作用。江潔[19]研究發(fā)現(xiàn)在5 L通風(fēng)攪拌發(fā)酵罐中進(jìn)行里氏木霉306生產(chǎn)組織型纖溶酶原激活劑，斜面孢子接種量越小，菌球個(gè)數(shù)越少，菌球越大，接入的種子液以菌絲球?yàn)橹鲿r(shí)，發(fā)酵液中菌體將以菌絲球形態(tài)繼續(xù)生長(zhǎng)。王莉衡[20]研究發(fā)現(xiàn)Aspergillusterreus液態(tài)發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀時(shí)，菌球直徑越小，游離菌絲越短，菌球外毛發(fā)長(zhǎng)度在短區(qū)域分度越均勻，洛伐他汀的產(chǎn)量越高。作者在研究搖瓶發(fā)酵和5 L發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)，在紅曲菌的斜面菌種培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵及發(fā)酵罐發(fā)酵的不同階段，菌體形態(tài)有大變化，有初始接種孢子、絲狀菌絲、絮狀菌絲、菌球等各種形態(tài)。且當(dāng)發(fā)酵液中出現(xiàn)較多菌球時(shí)，紅曲菌產(chǎn)MK的能力大大提高。而采用機(jī)械攪拌發(fā)酵罐發(fā)酵，因?yàn)閿嚢枰环矫婵梢猿浞值厥範(fàn)I養(yǎng)物質(zhì)與菌體接觸，加快傳質(zhì)，提高發(fā)酵液中溶解氧，另一方面機(jī)械攪拌也會(huì)產(chǎn)生剪切力，剪切力會(huì)減弱菌絲球生長(zhǎng)，甚至切斷菌絲體，從而間接地影響代謝產(chǎn)物MK的合成。故研究發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)各種條件與菌體形態(tài)及MK產(chǎn)量的關(guān)系非常有必要。

本課題在前人[21]研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紅曲菌菌體形態(tài)的變化對(duì)產(chǎn)MK有很大影響，在搖瓶發(fā)酵中，形成較大菌球的實(shí)驗(yàn)組比不形成菌球的實(shí)驗(yàn)組，其菌體量比后者少1倍的時(shí)候，但是其產(chǎn)MK的量還比后者高，故進(jìn)一步研究如何通過優(yōu)化培養(yǎng)條件控制搖瓶培養(yǎng)種子液中的菌球大小以及搖瓶種子接種發(fā)酵罐后，菌球大小和比例對(duì)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵罐發(fā)酵的影響，為紅曲菌液態(tài)發(fā)酵的工程放大提供更為扎實(shí)的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌株

紅色紅曲菌(Monascusruber9901)，由江南大學(xué)生物工程學(xué)院固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2培養(yǎng)基

PDA瓊脂斜面培養(yǎng)基：200 g土豆去皮，切成塊，加水煮沸30 min，經(jīng)紗布過濾后的濾液中加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂，融化后加水定容到1 000 mL。115 ℃滅菌15 min，滅菌后放置斜面。

一級(jí)種子培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，蛋白胨25 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，玉米漿 10 mL/L，pH 5.0。115 ℃滅菌15 min。

二級(jí)種子培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，大豆水解液50 mL/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，玉米漿 10 mL/L，pH 5.0。115 ℃滅菌15 min。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油100 g/L，大豆水解液200 mL/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，ZnSO4·7H2O 2 g/L，玉米漿 10 mL/L，pH 4.5。121 ℃滅菌20 min。

大豆水解液的制備：稱取100 g大豆加水浸泡24 h，然后用豆?jié){機(jī)粉碎磨漿定容到1 000 mL，再加0.1%的中性蛋白酶，50 ℃水浴水解4 h。

1.3培養(yǎng)方法

1.3.1斜面菌種培養(yǎng)

在30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)8～12 d，作為實(shí)驗(yàn)用種子。

1.3.2搖瓶種子培養(yǎng)

在無菌室中，把無菌水注入培養(yǎng)成熟的試管斜面中，將孢子從斜面洗脫下來，制成一定濃度的孢子懸液，然后接種到裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL的三角瓶中，在30 ℃，170 r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)3 d。

1.3.3二級(jí)種子培養(yǎng)

在無菌室中將培養(yǎng)好的一級(jí)種子液以10%的接種量，接種到裝有100 mL二級(jí)種子液培養(yǎng)基的500 mL的三角瓶中，然后放入30 ℃，170 r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)24～48 h。

1.3.4發(fā)酵罐發(fā)酵

30 L發(fā)酵罐裝液量20 L，罐體高度(H)42 cm，內(nèi)部直徑(D)21 cm，高徑比(H/D)為2，攪拌槳直徑(d)9 cm，攪拌槳高度(h)2.5 cm，d/D為0.47，h/d為0.28。將培養(yǎng)好的二級(jí)種子以5%～10%的接種量接入30 L發(fā)酵罐中，設(shè)置通風(fēng)量為1.0 v/v/m，轉(zhuǎn)速為150 r/min，30 ℃培養(yǎng)48 h，然后降溫為25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)14～16 d。

1.4分析檢測(cè)方法

1.4.1菌體形態(tài)的觀察[14]

取一定量發(fā)酵液，稀釋5倍，混勻，取5 mL較純凈的菌球樣品加入平皿中。然后對(duì)整個(gè)平皿拍照或者用具有拍照功能的倒置顯微鏡拍攝，最后使用Image Pro Plus V 6.0軟件分析，得出菌球直徑D和菌球外菌絲長(zhǎng)度。而菌球比例是菌球面積的總和占整個(gè)視野總面積的百分?jǐn)?shù)。

其中,D為菌絲球直徑，μm；A為菌絲球平均面積，μm2。

1.4.2菌體量的測(cè)定(干重法)

取發(fā)酵液30 mL用已經(jīng)烘干至恒重的濾紙過濾，濾渣用蒸餾水充分洗滌3次后，置于80 ℃烘箱中烘干至恒重。

1.4.3Monacolin K的檢測(cè)[20]

液態(tài)發(fā)酵樣品的處理：取勻漿后發(fā)酵液10 mL置于50 mL的比色管中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇定容至50 mL，55 ℃水浴1 h，冷卻至室溫后取上清液經(jīng)0.22 μm的濾膜微濾，用HPLC儀器對(duì)濾液進(jìn)行Monacolin K含量分析檢測(cè)。

HPLC檢測(cè)條件：儀器：Waters；色譜柱：ZORBAX SB-C18，150 mm×4.6 mm×5 μm；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(水)=55∶45，用磷酸調(diào)pH至2.5；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 μm。

2　結(jié)果與分析

2.1斜面菌種培養(yǎng)與搖瓶液態(tài)種子菌球形態(tài)的關(guān)系

通過優(yōu)化斜面種子培養(yǎng)條件控制搖瓶種子液的菌體形態(tài)，以期獲得生產(chǎn)活力較好的菌球種子液。

2.1.1斜面種子種齡對(duì)搖瓶液態(tài)種子液菌體形態(tài)、生物量的影響

用于接種的斜面菌種的種齡是影響微生物生長(zhǎng)重要參數(shù)，對(duì)搖瓶種子的菌體形態(tài)及生物量的變化有重要的影響。紅曲菌9901液態(tài)搖瓶培養(yǎng)的菌體形態(tài)和生物量的變化隨著孢子種齡的增加而呈一定的變化(如表1)。

表1　紅曲菌斜面種子種齡對(duì)種子液菌體形態(tài)、生物量的影響

注：培養(yǎng)條件：選擇不同種齡的斜面種子(PDA培養(yǎng)基)，用無菌水制成孢子懸浮液，然后每100 mL種子培養(yǎng)基中接種3.0×107個(gè)孢子，放置在30 ℃，170 r/min旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床培養(yǎng)72 h。

由表1可以看出，隨著斜面種子種齡的增加，菌球直徑先增大后減小，當(dāng)種齡為8 d時(shí)，菌球直徑達(dá)到最大，最大值為1 200 μm，菌球外菌絲長(zhǎng)度較小，生物量達(dá)到9.10 mg/L。當(dāng)斜面種子種齡為10 d或以上時(shí)，形成菌球直徑變小，菌球外菌絲長(zhǎng)度加長(zhǎng)，可能斜面菌種菌絲和孢子活力下降，不利于菌球的形成。因此選擇斜面種子培養(yǎng)第8 d用于接種。

2.1.2種子液初始孢子濃度對(duì)種子液菌體形態(tài)、生物量的影響

為了進(jìn)一步研究初始孢子濃度對(duì)種子液菌體形態(tài)、生物量的影響，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2　種子液初始孢子濃度對(duì)種子液菌體形態(tài)、生物量的影響

注：培養(yǎng)條件：選擇不同種齡的斜面種子(PDA培養(yǎng)基)，用無菌水制成孢子懸浮液，然后每100 mL種子液接種一定數(shù)量的孢子，在30 ℃，170 r/min旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d。

由表2可知，搖瓶種子液初始孢子濃度與菌球直徑大小、菌球外菌絲長(zhǎng)度成負(fù)相關(guān)，當(dāng)孢子濃度較低時(shí)，種子液形成的菌球較大，菌球外菌絲長(zhǎng)度較長(zhǎng)。同時(shí)，初始孢子濃度與生物量成正相關(guān)，孢子濃度越高，種子液中菌體量越大，可能較高的孢子濃度形成菌球能力更強(qiáng)，更早形成菌球，最終形成菌球數(shù)更多。為了獲得更多、較大的菌球，且菌球外菌絲長(zhǎng)度較短，最終選擇種子培養(yǎng)液中初始孢子濃度為3.0×107個(gè)/100 mL。

2.2紅曲菌液態(tài)搖瓶發(fā)酵過程中菌體形態(tài)、生物量、MK的變化

紅曲菌液態(tài)發(fā)酵過程中菌體形態(tài)的變化主要表現(xiàn)在菌球形成與否、直徑大小、數(shù)目、菌球所占比例和菌球外菌絲長(zhǎng)度等方面。紅曲菌液態(tài)揺瓶發(fā)酵過程中，紅曲菌菌球直徑、生物量和MK產(chǎn)量的變化如圖1。

圖1　紅曲菌液態(tài)發(fā)酵過程中菌體形態(tài)、生物量和MK產(chǎn)量的變化Fig.1　Time course of mycelial morphology,biomass and total MK yield in submerged fermentation of M. ruber 9901

由圖1中菌體形態(tài)變化曲線可以發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)發(fā)酵過程，0～144 h菌體快速生長(zhǎng)，而在48 h左右出現(xiàn)小菌球，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，菌球直徑持續(xù)加大，到第336 h左右達(dá)到最大，其最大值為1 910 μm，隨后菌體進(jìn)入穩(wěn)定器后期開始出現(xiàn)菌體破碎、pH升高等自溶現(xiàn)象，而使菌球直徑變小。MK的變化規(guī)律表明，MK的合成與菌體生長(zhǎng)、菌體形態(tài)有很大的關(guān)聯(lián)性，在生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期第72 h開始合成，在72～240 h合成速度較慢，隨著發(fā)酵的繼續(xù)，當(dāng)菌體生長(zhǎng)到達(dá)穩(wěn)定期以后MK開始快速合成，直到第384 h達(dá)到產(chǎn)量的最大值1 381 mg/L。

對(duì)該批紅曲菌液態(tài)發(fā)酵過程菌體形態(tài)分析的結(jié)果如圖2。由圖2可以看出，以菌絲接種后在前48 h 主要是以菌絲體生長(zhǎng)，自48 h 以后菌球開始形成，數(shù)目逐漸增多，在192 h菌球比例可到65%，以后趨于穩(wěn)定；菌球形成后，隨著發(fā)酵時(shí)間推移，菌球外菌絲長(zhǎng)度也不斷加長(zhǎng)，在144 h 左右達(dá)到最大值654 μm，以后逐漸減少；菌球直徑隨著發(fā)酵的進(jìn)行漸漸增大，到288 h 左右趨向穩(wěn)定，其最大值可達(dá)1 910 μm。在發(fā)酵的中后期，隨著菌體濃度的升高，菌球總量增加，同時(shí)MK 增加量較大，中后期MK合成速率較快。

圖2　紅曲菌搖瓶發(fā)酵菌球直徑、菌球外菌絲長(zhǎng)度和菌球所占比例的變化Fig.2　Time course of average pellet diameter, filamentous length and pellet ratio in submerged fermentation of M. ruber 9901

2.3液態(tài)種子菌體形態(tài)對(duì)紅曲菌30 L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)MK的影響

在30 L發(fā)酵罐中，通過研究攪拌轉(zhuǎn)速、菌體形態(tài)、菌體量及MK產(chǎn)量之間的關(guān)系，最終實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)MK的目的。

通過控制斜面孢子種齡、初始孢子濃度等條件，可以有效地控制種子液菌絲球直徑大小，又由于種子液的質(zhì)量對(duì)紅曲菌發(fā)酵罐培養(yǎng)的菌體形態(tài)影響很大，故研究了種子液菌體形態(tài)對(duì)發(fā)酵罐中菌體形態(tài)、生物量和產(chǎn)MK的影響，結(jié)果如圖3。

圖3　種子液初始菌球大小的對(duì)紅曲菌30 L罐發(fā)酵菌體形態(tài)、生物量和產(chǎn)MK的影響Fig.3　Effects of seed culture pellets diameter on mycelial morphology, biomass and MK yield in 30 L submerged fermentation of M. ruber 9901

圖3在30 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中，攪拌速度恒定為150 r/min，通氣量為1.5 v/v/m，接種量為5%，前48 h設(shè)置培養(yǎng)溫度30 ℃，48 h以后設(shè)置培養(yǎng)溫度25 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)360 h。測(cè)紅曲菌發(fā)酵液菌球直徑大小、生物量和MK含量。

由圖3可得，紅曲菌發(fā)酵過程中，隨著種子液中菌絲球直徑逐漸增大，發(fā)酵液中菌絲球直徑也是逐漸增大，同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中菌絲球直徑比種子液的菌絲球直徑大，發(fā)酵液中紅曲菌生物量和MK產(chǎn)量也逐漸增加。這一現(xiàn)象與MARIA等[22]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)初始種子液的菌球直徑較大時(shí)，種子液中可能會(huì)有新的“菌核”，會(huì)更有利于發(fā)酵液中形成新的菌球一致，且熊強(qiáng)等[23]認(rèn)為當(dāng)發(fā)酵液中有較多菌球時(shí)，發(fā)酵液黏性會(huì)下降，溶解氧會(huì)增加，更有利于紅曲菌的生長(zhǎng)。當(dāng)種子液菌絲球直徑達(dá)到1 500 μm時(shí)，發(fā)酵液中菌體量達(dá)到最大，最大值為28.1 g/L，紅曲菌產(chǎn)MK也達(dá)到最大，最高值為350 mg/L。且當(dāng)種子液菌絲球直徑超過1 500 μm時(shí)，紅曲菌發(fā)酵液中菌體量和MK產(chǎn)量都出現(xiàn)明顯下降。CASAS等[24]發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌球過大時(shí)，會(huì)導(dǎo)致菌球內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳輸受限，氧氣不能自由通過，造成內(nèi)部細(xì)胞自溶形成菌球中空，從而限制了絲狀真菌生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)物的累積。

2.4攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲菌機(jī)械攪拌罐發(fā)酵時(shí)菌體形態(tài)和產(chǎn)MK的影響

2.4.1攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲菌機(jī)械攪拌罐發(fā)酵菌體量和MK產(chǎn)量的影響

由圖4可知，紅曲菌機(jī)械攪拌罐發(fā)酵產(chǎn)MK其發(fā)酵水平遠(yuǎn)低于搖瓶發(fā)酵水平，且觀察發(fā)酵罐中紅曲菌的發(fā)酵過程時(shí)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中的菌絲球數(shù)量、菌絲球所占比例明顯低于液態(tài)搖瓶。這說明，當(dāng)采用機(jī)械攪拌罐發(fā)酵時(shí)，培養(yǎng)條件對(duì)紅曲菌的菌體形態(tài)產(chǎn)生了顯著的影響。其中菌絲球的形態(tài)與種子液、攪拌轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基組成、供氧狀況及溫度和pH等多種因素有關(guān)，而且不同生產(chǎn)MK的絲狀菌、不同類型的攪拌槳、不同的攪拌直徑下結(jié)果也會(huì)有差異。在這些影響因素中，攪拌轉(zhuǎn)速是影響紅曲菌液態(tài)發(fā)酵罐發(fā)酵的菌體形態(tài)和MK產(chǎn)量的一個(gè)非常重要的因素，因此，對(duì)不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵菌體量和MK產(chǎn)量的影響進(jìn)行進(jìn)一步的研究。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。

圖4　攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生物量和MK產(chǎn)量的影響Fig.4　Effects of agitation speed on biomass and the production of MK in submerged fermentation of M. ruber 9901 in 30 L bioreactor(注：實(shí)心圖例代表MK產(chǎn)量，空心圖例代表菌體量)

攪拌轉(zhuǎn)速大小會(huì)影響紅曲菌菌體形態(tài)的變化，同時(shí)菌體形態(tài)的變化與紅曲菌生物量和MK產(chǎn)量又有緊密的關(guān)系。觀察菌體量的變化曲線可以發(fā)現(xiàn)，在一定的轉(zhuǎn)速范圍(150～350 r/min時(shí))，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加，菌體量逐漸增加。當(dāng)轉(zhuǎn)速為350 r/min時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)360 h菌體量達(dá)到最大值為29.7 g/L, 比當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)的最大值24.8 g/L高出19.7%。這可能是由于攪拌轉(zhuǎn)速的增加，提高了發(fā)酵液中的溶解氧，加快了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞。但當(dāng)轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí)，培養(yǎng)前期菌體生長(zhǎng)正常，到168 h時(shí)菌體量達(dá)到最大值為26.5 g/L，之后菌體量有明顯的減少，這可能是菌體進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力較大，阻礙菌絲體生長(zhǎng)，打破穩(wěn)定期的平衡，導(dǎo)致菌體量下降[25]。

觀察紅曲菌液態(tài)發(fā)酵代謝產(chǎn)物MK的變化曲線可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速較低時(shí)(150～350 r/min時(shí))，紅曲菌液態(tài)發(fā)酵合成MK量隨著轉(zhuǎn)速的加大而逐漸增加，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為350 r/min時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)到216 h時(shí)，MK合成速率逐漸加快，發(fā)酵到360 h其MK合成量達(dá)到最大值1 308 mg/L。這可能由于攪拌轉(zhuǎn)速增加，有利于生物量增加，且發(fā)酵中期有大量的菌球的形成，有利于MK的合成與分泌。當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí)，整個(gè)發(fā)酵過程中MK的合成量均低于當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，這可能是由于攪拌轉(zhuǎn)速較大，紅曲菌菌絲體不能正常生長(zhǎng)形成較理想的菌球形態(tài)，從而影響MK的合成。

2.4.2攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲菌菌體形態(tài)及菌球比例的影響

為進(jìn)一步闡明攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生物量和MK產(chǎn)量的影響，在30 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中，觀察不同的攪拌水平的菌球形態(tài)分布情況(圖5)。通過對(duì)大量的菌球樣本分析，可以看到菌絲球形態(tài)與攪拌轉(zhuǎn)速有明顯的相關(guān)性。在較低攪拌轉(zhuǎn)速條件下(150～350 r/min時(shí))，菌絲球在48 h左右形成，之后隨著發(fā)酵時(shí)間加長(zhǎng)而逐漸增大，菌絲球直徑隨著轉(zhuǎn)速增大而增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速為350 r/min時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為360 h左右達(dá)到最大，最大值為2 347 μm左右，并且菌球外菌絲長(zhǎng)度這時(shí)較短387 μm左右，呈現(xiàn)較大的、光滑的菌絲球。當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大到400 r/min時(shí)，發(fā)酵液中的菌絲球初始在48 h左右開始形成，之后逐漸增大，但是到144 h左右時(shí)，菌絲球開始減小，同時(shí)菌絲球外菌絲長(zhǎng)度也達(dá)到最短310 μm左右，說明攪拌轉(zhuǎn)速過大，菌絲無法繼續(xù)生長(zhǎng)，不能保持正常生長(zhǎng)繁殖。

圖5　攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲菌30 L發(fā)酵罐發(fā)酵菌球大小和菌球外菌絲長(zhǎng)度的影響Fig.5　Effects of agitation speed on pellets diameter and filamentous length in submerged fermentation of M. ruber 9901 in 30 L bioreactor(注：空心圖例代表菌球直徑，實(shí)心圖例代表菌球外菌絲長(zhǎng)度)

圖6　攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲菌30 L發(fā)酵罐發(fā)酵菌球比例的影響Fig.6　Effects of agitation speed on pellets ratio in submerged fermentation of M. ruber 9901 in 30 L bioreactor

在發(fā)酵罐中，由于攪拌轉(zhuǎn)速影響了菌體形態(tài)，從而對(duì)菌球比例有很大的影響。比較不同時(shí)間點(diǎn)紅曲菌菌絲球數(shù)量(圖6)，可以發(fā)現(xiàn)菌球比例與轉(zhuǎn)速大小成正相關(guān)的關(guān)系。隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加，菌球比例逐漸增大。當(dāng)轉(zhuǎn)速為350～400 r/min時(shí)，菌絲球比例最高可達(dá)81%，比搖瓶發(fā)酵時(shí)61%的菌球所占比例高出34%。但從圖6可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí)，菌絲直徑在144 h后逐漸減小，而菌球比例卻逐漸變大，可能因?yàn)閿嚢柁D(zhuǎn)速較大時(shí)，較小的菌絲球無法繼續(xù)形成較大的菌球，但是可以促進(jìn)發(fā)酵液中絮狀菌絲形成新的菌核，從而形成新的菌球，也可能是菌絲球外菌絲被切斷以后，可以形成新的菌核，從而形成新的球，增加菌絲球的比例。在不同轉(zhuǎn)速條件下發(fā)酵液中菌球數(shù)量都有較高的比例，說明一定的攪拌對(duì)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵菌球的形成有促進(jìn)作用。

比較菌體形態(tài)的變化與MK產(chǎn)量變化的曲線，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速較低時(shí)(150～350 r/min時(shí))，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加，發(fā)酵液中的菌球數(shù)量和菌球直徑也逐漸增大，其發(fā)酵合成MK的產(chǎn)量隨著轉(zhuǎn)速的加大而逐漸增加。當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為350 r/min時(shí)，發(fā)酵液的中菌體為均勻的、較大的、表面光滑的菌絲球(圖7)，其液態(tài)發(fā)酵合成MK產(chǎn)量最高；當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí)，初始直徑為1 500 μm的菌球減小至最終大小穩(wěn)定為900 μm的菌絲球，這些分散的、較小的、表面有較長(zhǎng)菌絲的菌絲球(圖8)，液態(tài)發(fā)酵合成MK產(chǎn)量較低。

(a)表觀形態(tài);(b)顯微鏡照片(40×)圖7　均勻的較大的表面光滑的菌球形態(tài)Fig.7　The uniform, larger and smoother pellets

(a)表觀形態(tài);(b)顯微鏡照片(40×)圖8　分散的較小的表面有較長(zhǎng)菌絲菌球形態(tài)Fig.8　The scattered, smaller and rougher pellets

3　結(jié)論

液態(tài)發(fā)酵過程中，菌體形態(tài)會(huì)直接影響絲狀真菌代謝產(chǎn)物的形成和積累，因此可以通過改變液態(tài)發(fā)酵條件控制菌體形態(tài)的變化獲得較高產(chǎn)的目的代謝產(chǎn)物。其中斜面菌種的培養(yǎng)時(shí)間和種子液中的初始孢子濃度對(duì)種子液的菌體形態(tài)影響顯著，繼而影響合成MK的產(chǎn)量。在一定培養(yǎng)條件作用下，適當(dāng)增加攪拌轉(zhuǎn)速有利于菌球的形成，且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌球直徑逐漸加大，菌球所占比例也不斷加大，發(fā)酵合成MK產(chǎn)量提高。比較不同攪拌轉(zhuǎn)速條件下紅曲菌菌體形態(tài)與MK產(chǎn)量的關(guān)系，得出均勻的、較大的、表面光滑的菌絲球液態(tài)發(fā)酵合成MK的產(chǎn)量更高，分散的、較小的、表面有較長(zhǎng)菌絲的菌球液態(tài)發(fā)酵合成MK的產(chǎn)量較低的結(jié)論。由于不同的發(fā)酵條件改變了紅曲菌的菌體形態(tài)，從而使發(fā)酵合成代謝產(chǎn)物能力發(fā)生了變化，但菌體形態(tài)對(duì)紅曲菌產(chǎn)物合成的作用機(jī)制還需后續(xù)工作繼續(xù)研究。

[1]ENDO A. Monacolin K: a new hypocholesterolemic agent Produced by aMonascusspecies[J]. The Journal of Antibioties, 1979, 329(8): 552-854.

[2]ALBERTS A W, CHEN J, KURON G,et al.Mevinolin: A highly protein competitive inhibitor of hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase and a cholesterol-lowering agent [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1980, 77(7): 3 957-3 961

[3]ZHAO X J, HAO F H, HUANG C Y, et al. Systems responses of rats tomequindox revealed by metabolic and transcriptomic profiling [J]. Journal of proteome research, 2012, 11(9): 4 712-4 721.

[4]MARON D J, FAZIO S, LINTON M R F. Current perspectives on statins[J]. Circulation, 2000, 101(2): 207-213.

[5]傅劍云，夏勇，孟佳，等. 紅曲對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠體重及血脂水平的影響[J]. 中國(guó)臨床康復(fù),2002,6 (1):57-59.

[6]陳運(yùn)中，陳春艷，張聲華，等. 紅曲有效成分洛伐他汀對(duì)高脂小鼠血脂代謝及脂蛋白脂酶 mRNA 表達(dá)的作用[J]. 中草藥,2005,36 (5):713-717.

[7]朱華，許贛榮，陳蘊(yùn)，等. HPLC 法測(cè)定紅曲中酸型與內(nèi)酯型Monacolin K[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),2003,22(3):46-52.

[8]陳運(yùn)中，陳春艷，張聲華，等. 紅曲有效成分洛伐他汀對(duì)高脂小鼠血脂代謝及脂蛋白脂酶 mRNA 表達(dá)的作用[J]. 中草藥,2005,36(5):713-717.

[9]黃穎穎，楊成龍，陳源. 液態(tài)培養(yǎng)紅曲霉產(chǎn)洛伐他汀開閉環(huán)組分的研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013.8(8):817-822.

[10]陳蘊(yùn)，夏永軍，許贛榮，等. 紅曲液態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素的工藝條件[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(10)10-13.

[11]朱華. 紅曲菌液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)Monacolin K的研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2003.

[12]KAMAKSHI G, MISHRA P K, PRADEEP S, et al. Enhanced continuous production of Lovastatin using pellets and siran supported growth ofAspergillusterreusin all airlift reactor[J]. Biotechnology Bioprocess Engineering, 2009(14): 207-212

[13]METZ B, KOSSEN NWF. The growth of molds in the form of pellets-a literature review[J]. Biotechnology Bioengineering, 1977, 19(6): 781-799.

[14]CASAS LJ L, SANCHEZ P J A, FERNANDEZ S J M, et al. Pellet morphology, culture rheology and lovastatin production incultures ofAspergillusterreus[J]. Journal of Biotechnology, 2005(116):61-67.

[15]YU L, CHAO Y, WENSEL P, et al. Hydrodynamic andkinetic study of cellulase production byTrichodermareeseiwith pellet morphology[J].Biotechnology Bioengineering, 2012, 109(7): 1 755-1 768.

[16]SAYYAD S A, PANDA B P, JAVED S, et al. Optimization of nutrient parameters for lovastatin production byMonascuspurpureusMTCC 369 under submerged fermentation using response surface methodology [J].Applied Microbiology Biotechnology, 2007, 73: 1 054-1 058.

[17]吳波, 陳長(zhǎng)華, 楊琳, 等. 洛伐他汀發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化及15L罐放大[J]. 中國(guó)抗生素雜志, 2007, 32(7): 409-413.

[18]陳友枝，王璐，彭林，等. 阿魏蘑液體發(fā)酵過程菌體形態(tài)變化對(duì)產(chǎn)漆酶的影響[J]. 生物工程學(xué)報(bào),2013, 29(11): 1 701-1 705.

[19]江潔，杜連祥，路福平，等.培養(yǎng)條件對(duì)里氏木霉 306 菌體形態(tài)和 t-PA 生物合成的影響[J].工業(yè)微生物,2005,35(4):9-14.

[20]王莉衡. 土曲霉發(fā)酵條件對(duì)菌體形態(tài)與產(chǎn)物產(chǎn)量影響的研究[D].西安：西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,2004.

[21]ZHANG J, WANG Y L, XU G R, et al. Enhanced production of Monacolin K by addition of precursors and surfactants in submerged fermentation ofMonascuspurpureus9901[J].Biotechnology and Applied Biochemistry,2014,61(2):202-207.

[22]MARIA P，MURRAY M Y. Protease secretion in glucoamylase producerAspergillusnigercultures fungal morphology and inoculum effects[J]. Process Biochemistry,2002(37):1 271-1 278.

[23]熊強(qiáng)，徐晴，李霜，等. 絲狀真菌形態(tài)控制及其在發(fā)酵過程優(yōu)化中的運(yùn)用[J]. 生物工程學(xué)報(bào),2012,28(2):178-190.

[24]CASAS L J L，SANCHEZ P J A，F(xiàn)ernandez S J M，et al. Pellet morphology, culture rheology and lovastatin production in cultures ofAspergillusterreus[J]. Journal of Biotechnology, 2005(116):61-77.

[25]GIBBS P A，SEVIOUR R J，SCHMID F. Growth of filamentous fungi in submerged culture: problems and possible solutions[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2000, 20(1):17-48.

Effects of the fermentation conditions on mycelial morphology ofMonascusruber9901 and production of Monacolin K through its submerged fermentation

YE Chang-ya, ZHANG Bo-bo, XU Gan-rong*

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Monascusspecies are important medicinal and edible fungi, the effects of the fermentation conditions on its mycelial morphology and the production of MK through submerged fermentation ofMonascusruber9901 were investigated in 30 L stirred bioreactors. The results indicated that the average diameter of pellet, the length of filamentous and the biomass of seed culture were significantly influenced by the spore age and the concentration of spore suspension. Moreover, the pellet diameter of the mycelia and the ratio of pellet were affected by the rotation speed in 30 L stirred bioreactors. The rotation speed could significantly affect the mycelial morphology, the biomass and the production of MK in submerged fermentation ofM.ruber9901 in 30 L stirred bioreactors. The pellet diameter and the ratio of pellet were gradually increased along with the increase of rotation speed of the bioreactor. When rotation speed was 350 r/min, the pellets were uniform, larger and smoother, and MK yield of fermentation broth was higher. When rotation speed was 400 r/min, the pellets were scattered, smaller and rougher, and MK yield of fermentation broth was lower. Finally，the production of MK reached 1 308 mg/L after 384 h of fermentation when the mycelial pellet diameter was 1 500 μm, rotation speed was 350 r/min in 30 L stirred bioreactors. This study laid a good foundation for the subsequent large scale production of MK.

Monascus; submerged of fermentation; mycelium morphology; pellet; Monacolin K

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609005

碩士研究生(許贛榮教授為通訊作者,E-mail：grxu123@126.com)。

國(guó)家“十二五”科學(xué)技術(shù)支撐項(xiàng)目(2011BAD23B02)；“863”項(xiàng)目(2012AA021302)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(JUSRP11219)資助

2016-04-05，改回日期：2016-05-11