胡靜，張勁松，樊華

1(江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(國家食用菌工程技術(shù)研究中心，國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海，201403)3(柏林自由大學(xué)夏洛特醫(yī)學(xué)院，德國 柏林，13353)

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天然提取物對γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的作用篩選

胡靜1*，張勁松2，樊華3

1(江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(國家食用菌工程技術(shù)研究中心，國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海，201403)3(柏林自由大學(xué)夏洛特醫(yī)學(xué)院，德國 柏林，13353)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GABA transporters, GATs)通過攝取釋放的GABA有效控制其在突觸間隙的濃度，從而成為控制GABA能的信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵因素。大量研究表明：靈芝、虎杖等傳統(tǒng)中草藥的提取成分具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)心血管系統(tǒng)等藥理作用。該研究以穩(wěn)定表達(dá)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GAT1)的CHO細(xì)胞為模型，利用GABA攝取的定量分析測試來初步研究靈芝粗提物和虎杖主要有效成分白藜蘆醇對GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的影響。白藜蘆醇通過典型的非競爭性抑制的方式影響GAT1蛋白攝取GABA的功能。

γ-氨基丁酸；GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；靈芝；白藜蘆醇

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是廣泛分布于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1-3]。當(dāng)GABA神經(jīng)元興奮時(shí)，GABA被神經(jīng)末梢釋放到突觸間隙。終止遞質(zhì)的作用主要依賴突觸前神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞攝取GABA。研究證明，許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇、抑郁、阿爾茲海默癥等與GABA介導(dǎo)的抑制性突觸傳遞作用的降低有密切關(guān)系[4-6]。GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GABA transporters, GATs)位于突觸前膜或膠質(zhì)細(xì)胞膜上，是一種依賴于Na+/Cl-調(diào)節(jié)GABA跨膜運(yùn)輸?shù)闹匾堑鞍追肿覽7]。通過攝取已釋放的GABA，GATs能有效控制GABA在突觸間隙的濃度，從而調(diào)控GABA能的信號傳導(dǎo)。GATs共有4種亞型(GAT1-4)[8]，其中GAT1是分布最廣、研究最主要的一種[9-10]。對轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白功能的調(diào)節(jié)可能作為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的切入口。

傳統(tǒng)中藥中如靈芝、虎杖等作為中醫(yī)藥寶庫中的珍品，在我國已有悠久的應(yīng)用歷史。研究表明，靈芝、虎杖的提取成分具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)心血管系統(tǒng)等作用[11-12]，而近年也有一些其對神經(jīng)系統(tǒng)的作用的報(bào)道，包括對帕金森癥、癲癇等疾病治療的作用[13-16]。本文以已轉(zhuǎn)染了GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GAT1)的CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)為模型，利用3H同位素標(biāo)記的GABA攝取定量分析測試來初步研究了靈芝提取物(LZ acid, LZ-2, LZ-3)和虎杖有效成分白藜蘆醇對CHO細(xì)胞攝取抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的影響，即對GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的影響作用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

靈芝粗提物(LZ-2, LZ-3和LZ acid)，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌所深加工技術(shù)和發(fā)酵工程研究室提供；DEME培養(yǎng)基，德國Biochrom公司；胎牛血清，德國Perbio公司；G418硫酸鹽，PAA公司；L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素-鏈霉素，均購于德國PAN Biotech公司；轉(zhuǎn)染試劑Superfect，購于Qiagen公司；[3H] GABA，[14C] sucrose，均購于Perkin Elmer公司；白藜蘆醇，購于美國Merck公司；Anti-GAT1抗體，購于德國Alpha Diagnostic公司；HRP anti-rabbit(IgG)，購于DakoCytomation公司；Western blot顯色體系A(chǔ)EC及緩沖液，購于Calbiochem公司；Anti-GFP Ig抗體、超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器

液體閃爍計(jì)數(shù)器(Liquid Scintillation Counter Tri-Carb 1900 CA)，購于美國Packard公司；Axioobserver熒光顯微鏡，購于Carl Zeiss公司；HERAsafe生物安全柜，購于德國Thermo Scientific公司；超純水器Milli-Q，購于Millipore公司。

1.3細(xì)胞系和培養(yǎng)條件

中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)來自ATCC。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞用含10% 滅活胎牛血清、1 mmol/L 丙酮酸鈉、2 mmol/LL-谷氨酰胺、50 000U青霉素-鏈霉素(細(xì)胞培養(yǎng)用)的DMEM培養(yǎng)基；穩(wěn)定表達(dá)GAT1的CHO細(xì)胞用含400 mg/L G418的生長培養(yǎng)基，均在37 ℃，5 %CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。每3～4 d傳代1次。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1建立GAT1穩(wěn)定表達(dá)CHO細(xì)胞系

取CHO細(xì)胞，以每孔2 ×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，并培養(yǎng)過夜使其密度達(dá)到40%～50%，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑Superfect用戶指南轉(zhuǎn)染5～10 μg 本實(shí)驗(yàn)組已構(gòu)建好的pEGFP-N1-GAT1 DNA。方法大致如下：細(xì)胞經(jīng)洗滌后，加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物并在室溫下保持10 min。加入無血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞在37 ℃，5 %CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)5 h后，再更換生長培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。之后，細(xì)胞在含600 mg/L G418的選擇性培養(yǎng)基中生長1～3周。繼續(xù)進(jìn)行單克隆篩選，細(xì)胞被稀釋到10～30個(gè)細(xì)胞/mL并以每孔100μL接種于96孔板。僅含單細(xì)胞的孔被標(biāo)記并通過熒光顯微鏡觀察。待篩選到GAT1穩(wěn)定表達(dá)的CHO細(xì)胞克隆后，用含400 mg/L G418的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4.2免疫沉淀和Western Blot

約收集107個(gè)CHO細(xì)胞，用PBS緩沖液洗1～2次，然后加入含有1% n-dodecyl-β-D-maltoside的TBS緩沖液溶解，在4 ℃來回振蕩至少4 h。溶解液離心18 000 g，4 ℃，1 h。上清液與結(jié)合有anti-GFP (IgG)單抗的protein-G-Sepharose在4 ℃孵育12 h。經(jīng)過徹底洗滌，免疫沉淀在SDS樣品緩沖液中加熱至95 ℃，3 min。上清液可用于SDS/PAGE電泳，再通過Western blot將分離的蛋白轉(zhuǎn)移硝化纖維素膜上。分別用anti-GAT1多抗和anti-GFP多抗抗體進(jìn)行免疫染色，再與HRP anti-rabbit (IgG)孵育，最后用AEC體系顯色。

1.4.3GABA攝取定量分析測試

[3H] GABA攝取定量分析測試依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]，方法大致如下：以每孔5 ×104個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種于96孔板中，使細(xì)胞貼壁3～4 h。用洗液(128 mol/L NaCl, 5.2 mol/L KCl, 2.1 mol/L CaCl2, 2.9 mol/L MgSO4, 5 mol/L dextrose和10 mol/L Hepes, pH 7.4)洗細(xì)胞3次，然后在空白對照組加入200 μL反應(yīng)液(含3.7×104Bq [3H] GABA, 10 μmol/L GABA,3.7×104Bq [14C] sucrose以及100 μmol/L sucrose的洗液)，實(shí)驗(yàn)組所測樣品LZ-2、LZ-3、LZ acid以及白藜蘆醇均按照文中所標(biāo)注濃度加入反應(yīng)液，每組設(shè)3復(fù)孔，在室溫下保持15min。唾液酸酶經(jīng)報(bào)道可抑制GAT1蛋白的活性[13]，此處作為抑制劑對照。攝取過程的終止通過用冰浴的洗液洗細(xì)胞3次，然后將細(xì)胞用100 μL5 g/L的SDS溶液4 ℃裂解。裂解液用于測定細(xì)胞內(nèi)[3H] GABA、[14C] sucrose含量以及總蛋白量。GABA攝取活性單位為pmol/(μg蛋白·min)。

1.4.4數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)平行3次以上，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示，差異顯著性采用student’s t檢測分析。

2　結(jié)果與分析

2.1GAT1穩(wěn)定表達(dá)CHO細(xì)胞系的建立及鑒定

轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-GAT1 cDNA后，GAT1穩(wěn)定表達(dá)的CHO細(xì)胞通過單克隆技術(shù)篩選獲得并可用熒光顯微鏡觀察到該細(xì)胞膜帶有綠色熒光，如圖1A所示。GAT1蛋白的表達(dá)進(jìn)一步通過免疫沉淀和Western blot進(jìn)行鑒定，如圖1B和1C所示，CHO細(xì)胞表達(dá)的GAT1/GFP重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，呈現(xiàn)2個(gè)主要條帶，且均可被anti-GFP和anti-GAT1的抗體所識別：在110 kDa位置有一個(gè)主要條帶，應(yīng)為帶有成熟的N-糖鏈的肽鏈；在90 kDa位置的條帶主要為僅含有寡甘露糖鏈的肽鏈。

A. GAT1穩(wěn)定表達(dá)CHO細(xì)胞熒光照片；B.免疫沉淀樣品Western blot結(jié)果，用anti-GFP抗體作為一抗檢測；C.免疫沉淀樣品Western blot結(jié)果，用anti-GAT1抗體作為一抗檢測1-CHO細(xì)胞；2-GAT1穩(wěn)定表達(dá)CHO細(xì)胞圖1　GAT1在CHO細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的鑒定Fig.1　The stable expression of GAT1 in CHO cells

穩(wěn)定表達(dá)的GAT1蛋白功能通過進(jìn)一步的[3H] GABA攝取定量分析測試測定，其結(jié)果如圖2所示。與CHO對照細(xì)胞相比，CHO穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞表現(xiàn)了很強(qiáng)的GABA攝取活性(0.24 pmol[3H] GABA /104cells)。因此，GAT1/GFP重組蛋白的表達(dá)具備功能性，可用于進(jìn)一步的研究。

圖2　穩(wěn)轉(zhuǎn)GAT1/GFP蛋白CHO細(xì)胞的功能測定Fig.2　Functional determination of GFP-tagged GAT1 in CHO cells by GABA uptake assay

2.2靈芝粗提物和白藜蘆醇對GAT1攝取GABA功能的影響

LZ acid, LZ-2和LZ-3都是靈芝子實(shí)體的粗提物，LZ acid的主要成分為三萜類化合物，LZ-2和LZ-3則是多糖和蛋白質(zhì)的混合物，白藜蘆醇是虎杖中提取的有效成分之一，它們對淋巴細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡都有一定的作用，因此在本研究中選取相應(yīng)不影響細(xì)胞生長的最高濃度檢測其對于GAT1蛋白功能的影響，初步結(jié)果如圖3所示。

圖3　靈芝粗提物和白藜蘆醇對GAT1蛋白的GABA攝取功能的作用Fig.3　Effect of G. Lucidum fractions and resveratrol on GABA uptake of GAT1

以空白對照組的測定值為100%，0.2 U/ml唾液酸酶可將GAT1蛋白活性抑制到28%。LZ acid、LZ-3和白藜蘆醇對于GAT1蛋白攝取GABA的功能均有不同程度的影響作用，而LZ-2對GAT1蛋白功能沒有明顯作用。其中LZ acid(100 μg/mL)可使GAT1蛋白的攝取功能提高約50%，LZ-3(200 μg/mL)也可將該功能提高至126%；而白藜蘆醇(40 μmol/L)則可抑制該活性至69%。提高GABA能有抗癲癇、抗焦慮和抗疼痛等效果，而阻斷神經(jīng)突觸間隙內(nèi)GABA的回收是有效手段之一，同時(shí)該途徑不影響GABA的正常生理釋放，因此白藜蘆醇對GAT1蛋白的攝取功能的抑制作用具有潛在的藥用價(jià)值。而LZ acid和LZ-2均為復(fù)合物，它們對GAT1蛋白功能的促進(jìn)作用應(yīng)為一種協(xié)同作用，但其作用成分和機(jī)制尚不明確，對其中的作用成份的進(jìn)一步明確有可能排除其可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的不良反應(yīng)。

白藜蘆醇對GAT1蛋白攝取GABA的功能的抑制作用通過加入不同濃度的白藜蘆醇被進(jìn)一步測定，如圖4所示。

圖4　不同濃度白藜蘆醇對GAT1蛋白的GABA攝取功能的抑制作用Fig.4　Inhibition of GABA uptake of GAT1 protein by resveratrol with different concentrations

白藜蘆醇以劑量依賴性方式影響和抑制穩(wěn)定表達(dá)GAT1的CHO細(xì)胞對GABA的相對攝取速率。以空白對照組的相對GABA攝取速率為100%，在0.05、0.1、0.5、1和1.2 mol/L白藜蘆醇存在下，相對GABA攝取速率分別被抑制到61%、54%、38%、20%和18%。白藜蘆醇的IC50約為100 mol/L。

2.3白藜蘆醇對GAT1蛋白功能抑制作用的動力學(xué)研究

GABA攝取過程中的動力學(xué)參數(shù)在空白對照組和100 mol/L白藜蘆醇存在下進(jìn)行測定，其中GABA濃度分別采用200、50、20、10、8、6、4和2 mol/L，結(jié)果如圖5所示，動力學(xué)常數(shù)通過雙倒數(shù)作圖法，根據(jù)Michaelis-Menten方程計(jì)算得到。該結(jié)果顯示，對照組的KmGABA為4.6 μmol/L，VmaxGABA為1.23 pmol/(μg蛋白·min);而100 mol/L白藜蘆醇存在下KmGABA為4.8 μmol/L,VmaxGABA則降低至0.66 pmol/(μg蛋白·min)。因此白藜蘆醇的作用僅降低VmaxGABA，但幾乎不影響KmGABA，表明白藜蘆醇是通過非競爭性抑制的方式來影響GAT1蛋白的GABA攝取作用的。

圖5　白藜蘆醇影響GAT1蛋白的GABA攝取功能的動力學(xué)研究Fig.5　Kinetic study of effect of resveratrol on GABA uptake of GAT1/GFP protein

3　結(jié)論

抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA以及GABA能中間神經(jīng)元在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動中的作用一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。GATs是一種神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體和存在于膜上的重要的糖蛋白。有研究表明，GATs對GABA的攝取作用是突觸間隙中降低GABA濃度的唯一途徑。本研究揭示了靈芝粗提物L(fēng)Z-3、LZ acid和白藜蘆醇對GAT1活性都有影響作用。其中靈芝粗提物L(fēng)Z-3和LZ acid主要增強(qiáng)GAT1蛋白功能。白藜蘆醇主要通過典型的非競爭性抑制的方式影響GAT1蛋白功能，從而在一定程度上可以抑制細(xì)胞對GABA的攝取，這提示白藜蘆醇對神經(jīng)系統(tǒng)有一定的藥用價(jià)值。

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The screening of natural extracts effects on the activity of γ-aminobutyric acid transporters (GATs)

HU Jing1*， ZHANG Jin-song2，F(xiàn)AN Hua3

1(Wuxi Medical School,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(National R&D CenterforEdible Fungi Processing, National Engineering Research Center of Edible Fungi，Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China)3(Free University of Berlin,Charité Medical University of Berlin, Berlin 13353,Germany)

GABA (γ-aminobutyric acid) is the major inhibitory neurotransmitter in the central nervous system (CNS). GABA transporters (GATs) are key elements in the termination of the synaptic actions of GABA by re-uptake GABA, which is one important mechanism in the regulation of GABA concentration in the synaptic cleft. Various studies have showed that extracts from the traditional Chinese medicines such asGanodermalucidumandPolygonumcuspidatumhave certain improved effect on anti-tumor activity, regulation of immune system andcardiovascular systems. In this study, the effect on GABA uptake activity of GAT1 of crude extracts fromGanodermalucidumand resveratrol by the effective component ofPolygonumcuspidatumwere tested in CHO/GAT1 cells by GABA uptake assay. Resveratrol was found as a typical non-competitive inhibition on GABA uptake of GAT1.

γ-aminobutyric acid (GABA); GABA transporters (GATs);Ganodermalucidum; resveratrol

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609015

博士，副教授(本文通訊作者，E-mail：hujing@jiangnan.edu.cn)。

江蘇省自然科學(xué)基金(BK20150140)

2015-07-28，改回日期：2016-04-12