孫凱，魏霜，劉玉莉，許如蘇，劉中勇，鄞杰平，袁俊杰，吳希陽(yáng)*

1(暨南大學(xué) 理工學(xué)院, 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)2(汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 汕頭，515041)3(湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 湛江，524000)

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植物乳桿菌的DPO引物實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

孫凱1，魏霜2，劉玉莉2，許如蘇2，劉中勇2，鄞杰平2，袁俊杰3，吳希陽(yáng)1*

1(暨南大學(xué) 理工學(xué)院, 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)2(汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 汕頭，515041)3(湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 湛江，524000)

根據(jù)已報(bào)道的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的23S rRNA基因保守序列，設(shè)計(jì)用于檢測(cè)植物乳桿菌的特異性DPO(dual priming oligonucleotide)引物，結(jié)合SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，建立植物乳桿菌的DPO引物實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)其特異性和靈敏度進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并將建立的檢測(cè)方法用于實(shí)際樣品的檢測(cè)中。結(jié)果顯示，該方法對(duì)2株植物乳桿菌能得到陽(yáng)性擴(kuò)增，其余11株乳酸菌及陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增曲線，靈敏度高達(dá)0.001 ng/μL，而且在退火溫度為50～60 ℃范圍內(nèi)不影響其特異性，表明該方法對(duì)退火溫度不敏感；用微生物菌制劑和酸奶共13種益生菌產(chǎn)品進(jìn)行了驗(yàn)證，檢出情況與產(chǎn)品標(biāo)識(shí)一致。因此，該研究建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR能夠快速、準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)微生物菌制劑及其他益生菌產(chǎn)品中的植物乳桿菌。

植物乳桿菌；實(shí)時(shí)熒光PCR；DPO引物；檢測(cè)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是一種廣泛使用的益生菌，具有維持腸道微生態(tài)平衡，提高機(jī)體免疫力等功效，目前已經(jīng)被應(yīng)用于食品、醫(yī)用益生菌制劑、微生物肥料等領(lǐng)域[1]。對(duì)這些產(chǎn)品中微生物的準(zhǔn)確鑒定是產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要依據(jù)，因此建立一種快速、準(zhǔn)確的鑒定方法具有重要意義。

目前乳桿菌屬的檢測(cè)主要依靠傳統(tǒng)生理生化和分子生物學(xué)方法進(jìn)行。前者耗時(shí)耗力，而且由于乳桿菌屬許多種非常相似，生理生化特征也存在許多相似之處，實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中難以判斷，不能滿足實(shí)際檢測(cè)的需要[2]?；谔禺愋砸锏腜CR的方法具備快速、準(zhǔn)確、低成本的優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛用于轉(zhuǎn)基因、食源性微生物、醫(yī)學(xué)病原菌等方面的檢測(cè)[3-5]。目前PCR法已經(jīng)被應(yīng)用于植物乳桿菌的檢測(cè)，KWON等[6]建立用于檢測(cè)植物乳桿菌的普通PCR特異性引物；楊小紅等[7]建立了普通PCR法檢測(cè)植物乳桿菌，并用40株標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證了方法的特異性，并將該特異性引物成功轉(zhuǎn)化成為農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2066—2011[8]。以往報(bào)道的特異性引物檢測(cè)植物乳桿菌全部使用的是普通引物，需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件尤其是退火溫度，退火溫度的變化可能會(huì)影響到引物的特異性，例如農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2066—2011中所使用的植物乳桿菌特異性引物以較高的退火溫度(67℃)來(lái)保證引物的特異性。而不同實(shí)驗(yàn)室之間由于儀器、人員等差異，可能會(huì)無(wú)法精確重復(fù)出試驗(yàn)的各項(xiàng)條件，導(dǎo)致檢測(cè)特異性受到影響，可能造成誤判，而且普通PCR法需要進(jìn)一步凝膠電泳判斷結(jié)果，增加了檢測(cè)時(shí)間。

DPO(dual priming oligonucleotide)引物是由CHUN等[9]于2007年第1次提出，其特點(diǎn)在于它包含2個(gè)各自獨(dú)立的特異性引物區(qū)域，5′端序列由18～25個(gè)堿基組成并與靶基因序列配對(duì)，3′端序列由6～12個(gè)堿基組成用來(lái)引導(dǎo)PCR反應(yīng)的特異性延伸，這兩段獨(dú)立的特異性區(qū)域利用寡聚次黃嘌呤(Inosine，I)進(jìn)行連接，由于次黃嘌呤比一般堿基的退火溫度低，在退火時(shí)寡聚次黃嘌呤形成類似泡狀的結(jié)構(gòu)，從而使5′和3′區(qū)域形兩個(gè)獨(dú)立功能的雙特異性引物結(jié)構(gòu)，而且由于其特殊的結(jié)構(gòu)，引物自身以及引物之間很難形成二級(jí)結(jié)構(gòu)且對(duì)退火溫度不敏感，在一定范圍內(nèi)改變退火溫度對(duì)檢測(cè)特異性不產(chǎn)生影響，如圖1所示。而且理論上5′和3′任何一個(gè)區(qū)域超過(guò)3個(gè)堿基不匹配就不能擴(kuò)增，運(yùn)用DPO引物這一特點(diǎn)，已建立了基于DPO引物的SNP的檢測(cè)方法[9]。目前，DPO引物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)病原菌、食源性微生物等[10-11]。本研究擬運(yùn)用DPO引物高特異性、不受退火溫度影響等特征，結(jié)合SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的植物乳桿菌檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1材料

供試材料：植物乳桿菌(ATCC 14917，ATCC 8014)、鼠李糖乳桿菌(ATCC 53103，ATCC 9595)、格氏乳桿菌(ATCC 33323)、約氏乳桿菌(ATCC 33200)、嗜酸乳桿菌(ATCC 314)、德氏乳桿菌(ATCC 4797)、發(fā)酵乳桿菌(ATCC 9338)、沙克乳桿菌(ATCC 15521)、詹氏乳桿菌(ATCC 25258)、副干酪乳桿菌(ATCC 25598)、干酪乳桿菌(ATCC 393)共13株乳桿菌，由暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系提供[12-13]。

試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；SYBR Premix Ex TaqTM購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

儀器：LightCycle Roche 480熒光定量PCR儀，瑞士羅氏公司；VERITI 2.0 PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)AB公司； HE99電泳儀，美國(guó)GE公司；G:BOX EF凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)基因公司；ND-1000生物分光光度計(jì)，美國(guó)Therme公司。

1.2基因組DNA的提取

菌株在MRS液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)24 h后，取1 mL菌液用于DNA的提取，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，參照說(shuō)明書的要求操作，并用生物分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物的設(shè)計(jì)

參考DPO引物設(shè)計(jì)的要求[9]，用植物乳桿菌的23S rRNA基因序列(GenBank ID: AB092638.1)在NCBI上進(jìn)行BLAST，根據(jù)比對(duì)結(jié)果在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)DPO引物，上游引物L(fēng)P-DPO-F：5′- GGGGCAACCCAGCAGTTTTAIIIIICTGTTACCAC -3′，下游引物L(fēng)P-DPO-R：5′- TAATGAGATGTTTCAGTTCACAGCGIIIIICTCCAACTAG -3′，產(chǎn)物大小為91 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及程序

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為20 μL：10 μL SYBR Premix ExTaq、引物終濃度為0.2 μmol/L、DNA模板50 ng、ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的72 ℃階段結(jié)束后收集熒光信號(hào)，在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔融曲線的分析。

1.5實(shí)時(shí)熒光PCR特異性試驗(yàn)

按1.4實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及程序，對(duì)包括1.1所示的13株乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。同時(shí)采用農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2066-2011[8]中植物乳桿菌的特異性引物PlantF/PlantR及反應(yīng)條件對(duì)以上標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行特異性驗(yàn)證。用無(wú)菌純水代替等量模板作為陰性對(duì)照。農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)引物序列為PlantF：5′- GTTGACTCGGTGGCGGCCTT -3′；PlantR：5′- GGAGCGCTTGTGACATCAGCCG -3′，產(chǎn)物大小為100 bp。

1.6實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度試驗(yàn)

利用植物乳桿菌ATCC 14917的DNA為模板，進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到濃度分別為10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001 ng/μL共稀釋6個(gè)梯度，每個(gè)梯度取1 μL做模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度試驗(yàn)。

1.7不同退火溫度下特異性試驗(yàn)

以1.1中13株乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA為模板，運(yùn)用本研究建立的方法，分別在50、55和60 ℃進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，探討在不同退火溫度下DPO引物的特異性。

1.8實(shí)際樣品的檢測(cè)

從市場(chǎng)采購(gòu)13種益生菌制品，其中3種微生物菌制劑、10種酸奶，其產(chǎn)品標(biāo)識(shí)菌種組成見(jiàn)表2。運(yùn)用本研究建立的方法進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)，同時(shí)采用農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行對(duì)比。

2　結(jié)果與分析

2.1基于DPO引物的實(shí)時(shí)熒光PCR的建立

用13株乳桿菌DNA作為模板用于建立基于DPO引物的植物乳桿菌的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，結(jié)果如圖2所示。僅2株植物乳桿菌擴(kuò)增生成“S”形的擴(kuò)增曲線，結(jié)果為陽(yáng)性，且熔解曲線測(cè)試為單一波峰，產(chǎn)物Tm值均一，為75 ℃，無(wú)非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)；另外11株乳桿菌擴(kuò)增無(wú)擴(kuò)增曲線，結(jié)果為陰性。證明本研究設(shè)計(jì)的DPO引物特異性較好，建立的基于DPO引物的實(shí)時(shí)熒光PCR方法能夠準(zhǔn)確對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行檢測(cè)。

A:基于DPO引物的實(shí)時(shí)熒光PCR特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B: 基于DPO引物的實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線1-13：植物乳桿菌(ATCC 14917)、植物乳桿菌(ATCC 8014)、鼠李糖乳桿菌(ATCC 53103)、鼠李糖乳桿菌(ATCC 9595)、格式乳桿菌(ATCC 33323)、約氏乳桿菌(ATCC 33200)、嗜酸乳桿菌(ATCC 314)、德氏乳桿菌(ATCC 4797)、發(fā)酵乳桿菌(ATCC 9338)、沙克乳桿菌(ATCC 15521)、詹氏乳桿菌(ATCC 25258)、副干酪乳桿菌(ATCC 25598)、干酪乳桿菌(ATCC 393)；14：陰性對(duì)照?qǐng)D2　基于DPO引物的實(shí)時(shí)熒光PCR方法的建立Fig.2　Establishment of Real-time PCR on DPO primers method

2.2靈敏度評(píng)價(jià)

利用建立的基于DPO引物的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)含量分別為10、1、0.1、0.01、0.001和0.000 1 ng/μL的植物乳桿菌的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度檢測(cè)，結(jié)果如圖3，模板DNA起始濃度越高，Ct值越小，當(dāng)DNA濃度稀釋到0.001 ng/μL時(shí)，取1 μL DNA做模板仍可以檢測(cè)到熒光信號(hào)的增加，Ct值為31，表現(xiàn)為陽(yáng)性擴(kuò)增；當(dāng)DNA濃度稀釋到0.000 1 ng/μL時(shí)無(wú)擴(kuò)增，檢測(cè)不到熒光信號(hào)的增加，故該方法對(duì)植物乳桿菌的DNA檢測(cè)靈敏度為0.001 ng/μL。10～0.001 ng/μL系列DNA模板的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線均呈現(xiàn)單一且相同的峰值，產(chǎn)物Tm值均一，為75 ℃，無(wú)非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)。

A:基于DPO引物的實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B: 基于DPO引物的實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線1-6: DNA模板濃度依次為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL圖3　基于DPO引物的實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度檢測(cè)Fig.3　Sensitivity test of real-time PCR on DPO primers

2.3不同退火溫度下特異性對(duì)比

本研究還探討了退火溫度在50、55和60 ℃該檢測(cè)體系的特異性，結(jié)果如表1所示。

表1　DPO引物特異性

注：“+”表示陽(yáng)性擴(kuò)增；“-”表示陰性擴(kuò)增。

在較低退火溫度(50 ℃)和較高的退火溫度下(60 ℃)下，利用本研究建立的方法僅植物乳桿菌(ATCC 14917、ATCC 8014)結(jié)果為陽(yáng)性；其他11株乳桿菌均為陰性，檢測(cè)結(jié)果與農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)方法一致。說(shuō)明本研究基于DPO引物建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)退火溫度不敏感，有利于在不同實(shí)驗(yàn)室之間得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，適合該方法的推廣。

2.4實(shí)際樣品的檢測(cè)

在3種微生物菌制劑產(chǎn)品中，1種微生物菌制劑產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，另外2種檢測(cè)結(jié)果為陰性；在10中酸奶產(chǎn)品中，1種檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其余9種檢測(cè)結(jié)果為陰性。13株樣品的檢測(cè)結(jié)果與產(chǎn)品標(biāo)識(shí)一致，結(jié)果如表2所示，且本研究的檢測(cè)方法無(wú)需凝膠電泳，與常規(guī)PCR相比大大節(jié)省了時(shí)間，農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)方法與本研究建立的方法檢測(cè)結(jié)果一致，證明本方法特異性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)用性強(qiáng)，可運(yùn)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

表2　實(shí)際樣品的檢測(cè)

注：“+”表示陽(yáng)性擴(kuò)增；“-”表示陰性擴(kuò)增。

3　討論與結(jié)論

植物乳桿菌作為益生菌被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，因此建立這些產(chǎn)品中植物乳桿菌的檢測(cè)方法具有重要意義。在細(xì)菌進(jìn)化過(guò)程中，核糖體RNA(rRNA)基因的進(jìn)化相對(duì)保守，因此被認(rèn)為是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行親緣關(guān)系分析的最理想的基因，該基因序列幾乎可以對(duì)所有細(xì)菌進(jìn)行屬水平的鑒定[14]。然而，由于16S rRNA基因的高度保守性，對(duì)相似性極高的近源種無(wú)法做出進(jìn)一步區(qū)分，很難設(shè)計(jì)出種特異性引物[15]。23S rRNA基因與16S rRNA基因相比，23S rRNA的序列可變性更為明顯，可變區(qū)內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)較多，不同細(xì)菌間差異相對(duì)較大，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于微生物鑒定中[16-17]。本研究針對(duì)植物乳桿菌的23S rRNA基因設(shè)計(jì)特異性DPO引物，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR法，成功實(shí)現(xiàn)了種水平的鑒定。

特異性引物設(shè)計(jì)中，即要保證引物的特異性，又要保證引物的各個(gè)參數(shù)符合PCR反應(yīng)的要求，因此在設(shè)計(jì)過(guò)程中存在一定的難度[18]。DPO引物作為一種新型的引物類型，其引物包含兩個(gè)各自獨(dú)立的特異性引物區(qū)域，5′端序列由18-25個(gè)堿基(Tm>65℃)組成并與靶基因序列配對(duì)，3′端序列包含6～12個(gè)堿基(GC含量40～80%)用來(lái)引導(dǎo)PCR反應(yīng)的特異性延伸，這兩段獨(dú)立的特異性區(qū)域利用寡聚次黃嘌呤(Inosine, I)進(jìn)行連接，在退火過(guò)程中寡聚次黃嘌呤會(huì)形成“泡狀”結(jié)構(gòu)。MA等[10]的研究發(fā)現(xiàn)DPO引物中間的次黃嘌呤為3～8個(gè)時(shí)的效果較好，5個(gè)時(shí)效果最好。根據(jù)以上信息確定DPO引物的設(shè)計(jì)過(guò)程為：在基因序列保守區(qū)域確定3′端位置，向5′端延伸6-12個(gè)堿基保證3′端序列的GC含量在40～80%，緊接著再向5′端延伸5個(gè)次黃嘌呤形成寡聚次黃嘌呤結(jié)構(gòu)，最后再向5′端延伸18-25個(gè)堿基保證5′端序列Tm大于65℃即可。這大大減少了特異性引物設(shè)計(jì)的難度，即能保證引物的特異性，又能保證引物能正常工作。

在實(shí)時(shí)熒光PCR中使用TaqMan探針能檢測(cè)PCR中的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，而不受非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的影響，因此被廣泛應(yīng)用于微生物的定性及定量檢測(cè)[19]。但一條有效的探針需要具備很高的保守性、合適的GC含量和長(zhǎng)度以及合適的Tm值等，而且不同乳桿菌之間的差異較小，這使特異性探針設(shè)計(jì)的難度大大增加。另外，探針合成的價(jià)格比較昂貴，因而在一定程度上限制了探針的使用。因此，本研究將SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR和DPO引物檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，吸收了DPO引物高特異性且引物之間難以形成二聚體等優(yōu)點(diǎn)，成功建立了植物乳桿菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。

DPO的另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于它對(duì)退火溫度不敏感。本研究探討了在較低退火溫度(50 ℃)和較高的退火溫度下(60 ℃)下DPO引物的特異性，結(jié)果顯示與農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)方法一致，這大大增強(qiáng)了本方法在不同實(shí)驗(yàn)室之間的通用性，徐義剛等[20-21]的研究也表明DPO引物不受退火溫度的影響，在較寬的退火溫度范圍內(nèi)依然保持較高的特異性。另外，將DPO引物和SYBR Green I的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)合起來(lái)，檢測(cè)結(jié)果易于判斷，無(wú)需凝膠電泳，這也增強(qiáng)了本方法的實(shí)用性。

本研究建立的檢測(cè)方法靈敏度高達(dá)0.001 ng/μL，這與武鑫[22]、謝志勤[23]、苗立中[24]等建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR方法的靈敏度一致，這體現(xiàn)了該方法的高靈敏度。將該方法運(yùn)用于13份實(shí)際樣品的檢測(cè)中，在2份標(biāo)識(shí)中含有植物乳桿菌的樣品中準(zhǔn)確檢出植物乳桿菌，其它樣品結(jié)果均為陰性，檢測(cè)結(jié)果與農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)方法一致，這體現(xiàn)了該方法的準(zhǔn)確性。

本研究采用DPO引物和SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，建立用于檢測(cè)植物乳桿菌的DPO引物實(shí)時(shí)熒光PCR方法。該方法特異性強(qiáng)，只有2株植物乳桿菌擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性，熔解曲線波峰單一，其余11株非植物乳桿菌擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；能檢測(cè)出0.001 ng/μL的DNA模板，靈敏度高；無(wú)需凝膠電泳，相比傳統(tǒng)PCR方法提高了檢測(cè)速度；對(duì)退火溫度不敏感，提高了不同實(shí)驗(yàn)室之間的適用性；對(duì)13份樣品的檢測(cè)結(jié)果與農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果一致，并與產(chǎn)品標(biāo)識(shí)相符合。這表明本研究建立的DPO引物結(jié)合SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的植物乳桿菌檢測(cè)方法具有速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于酸奶、微生物菌制劑等產(chǎn)品的檢測(cè)中。

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Real-time PCR for the detection ofLactobacillusplantarumbased on dual priming oligonucleotide system

SUN Kai1, WEI Shuang2, LIU Yu-li2, XU Ru-su2, LIU Zhong-yong2,YIN Jie-ping2,YUAN Jun-jie3, WU Xi-yang1*

1 (Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China)2 (Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shantou 515041, China)3 (Zhanjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhanjiang 524000, China)

The species-specific DPO (dual priming oligonucleotide) primers were designed basing on the 23S rRNA gene sequences ofLactobacillusplantarum. A SYBR GreenⅠreal-time PCR assay based on DPO primers was developed for the detection ofL.plantarum. The specificity and sensitivity of the assay have been estimated. The results showed that this method was of high specificity at annealing temperature range from 50 to 60 ℃, and only twoL.plantarumstrains could be amplified. The other 10Lactobacillus. spp. strains gave negative results, and the sensitivity of this method reached 0.001 ng/μL. The specificity and sensitivity of the assay was evaluated using 13 probiotics products including microbiological preparation and yogurt, and the results were in consistent with the product identification. Therefore,L.plantarumcan be detected rapidly, accurately and efficiently by this method.

Lactobacillusplantarum; real-time PCR; DPO (dual priming oligonucleotide); detection

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609031

碩士研究生(吳希陽(yáng)教授為通訊作者,E-mail:tkentwu@jnu.edu.cn)。

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015IK078)

2016-03-14，改回日期：2016-05-16