邸萬山

（遼寧石化職業(yè)技術學院應用化學系，遼寧錦州121001）

高效液相色譜內標法測定動物飼料中鹽酸克倫特羅

邸萬山

（遼寧石化職業(yè)技術學院應用化學系，遼寧錦州121001）

以茶堿為內標物，建立高效液相色譜內標法測定禽畜飼料中鹽酸克倫特羅的檢測方法。樣品經三氯乙酸溶液提取，經過Oasia HLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg）處理，再用體積分數為5%的甲醇溶液沖洗后，采用Nova-Pak C18色譜柱（3.9 mm×150 mm×5 μm）分離，以乙腈-28 g/L磷酸二氫鈉緩沖溶液（25：75，V/V）為流動相進行洗脫，流速0.8 mL/min，檢測波長210 nm。結果表明，茶堿在該條件下能夠與鹽酸克倫特羅分離完全，可以作為測定鹽酸克倫特羅的內標物。鹽酸克倫特羅的加標回收率為97.8%～99.2%，精密度試驗結果的相對標準偏差（RSD）為0.13%，表明該方法操作簡單、準確度高、精密度良好，可用于飼料中鹽酸克倫特羅含量分析。

高效液相色譜法；內標法；茶堿；鹽酸克倫特羅；飼料

鹽酸克倫特羅（clenbuterol hydrochloride）又稱咳喘素、瘦肉精，是β-腎上腺素興奮劑，其作用機理和腎上腺素相同。當其用于家畜飼養(yǎng)超過治療劑量幾倍時，可以產生瘦肉含量更高的酮體，加快肉用家畜的生長速度。1990年歐洲發(fā)生了食用殘留β-興奮劑的牛肝引起的食物中毒事件后，歐盟頒布了法規(guī)禁止β-興奮劑作為生長促進劑使用［1］。我國農業(yè)部已明令禁止在家畜飼料中使用鹽酸克倫特羅。關于飼料中β-興奮劑的檢驗方法報道較多，其中液相色譜法主要以外標法測定鹽酸克倫特羅［2-3］，而用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法內標法測定飼料中鹽酸克倫特羅國內外報道較少。

目前國內外對鹽酸克倫特羅的有效檢測方法主要集中在膠體金快速檢測卡法、酶聯免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法、高效液相色譜（HPLC）法和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法等。其中高效液相色譜法具有檢出限低、動態(tài)線性范圍寬、精密度高、準確度高、基體效應小、分析速度快等優(yōu)點，已廣泛應用于食品成分分析［4］。本研究目的在于建立高效液相色譜內標法測定飼料中鹽酸克倫特羅分析檢測方法。樣品經三氯乙酸、甲醇提取后，采用Nova-Pak C18色譜柱（3.9 mm×150 mm×5 μm）分離，以乙腈-磷酸二氫鈉為流動相進行洗脫，紫外檢測波長210 nm，以茶堿為內標物對飼料中鹽酸克倫特羅進行了測定，以期為飼料的質量評價提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

飼料：市售；乙腈、甲醇（均為色譜純），磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）、三氯乙酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸克倫特羅、茶堿對照品（純度為99.99%）：中國藥品生物制品檢定所；超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm，0.45 μm膜過濾）：實驗室自制。

1.2儀器與設備

810型高效液相色譜儀：美國Waters公司；KQ-700DB數控超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水系統：美國Millipore公司；AUW120D電子分析天平：日本島津公司；Oasia HLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg）：上海禾工科學儀器有限公司；TG16B臺式高速離心機：鹽城市凱特實驗儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1色譜檢測條件

色譜柱：Nova-Pak C18（3.9 mm×150 mm×5 μm）；流動相：乙腈-28 g/L磷酸二氫鈉緩沖溶液（25∶75，V/V）；流速：0.8 mL/min；進樣體積：10 μL；靈敏度：0.2 AUFS；柱溫：30℃；檢測波長：210 nm。

1.3.2溶液的配制

緩沖溶液的配制：稱取2.8 g NaH2PO4，加水定容至100 mL；稱取2.1 g檸檬酸，加水定容至100 mL；向NaH2PO4溶液中加入檸檬酸溶液，并調節(jié)溶液pH=4.0，再將6.1 gEDTA加入上述緩沖溶液中至完全溶解。

流動相緩沖溶液的配制：稱取1.6 g NaH2PO4加水溶解至1 000 mL，加入磷酸調節(jié)至溶液pH=2.5，再加入0.4 g EDTA，溶解后過0.45 μm濾膜過濾。

1.0000 mg/mL茶堿、鹽酸克倫特羅混合標準儲備溶液的配制：準確稱取茶堿、鹽酸克倫特羅對照品各0.100 00 g，加適量甲醇溶解，轉移至100 mL容量瓶中加甲醇定容，搖勻，超聲波脫氣。

10 μg/mL茶堿、鹽酸克倫特羅混合標準使用溶液的配制：用移液管準確移取1.00 mL標準儲備溶液于100 mL容量瓶中，加甲醇定容，超聲波脫氣。

1.3.3試樣的處理

準確稱取5.000 0 g試樣，粉碎后置于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入25 mL緩沖溶液，2 mL 50%三氯乙酸溶液，混勻后，7 500 r/min離心10 min，上清液用濾紙過濾，向殘渣中加入10 mL緩沖溶液，經超聲波振蕩提取10 min，7 500 r/min離心10 min，過濾，重復一次，合并濾液。將濾液通過預先處理好的OasiaHLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg），再用20 mL 5%甲醇溶液沖洗，最后用5 mL甲醇洗脫，收集解析液加入0.001 0 mg茶堿，定容至100 mL。經0.45 μm濾膜過濾，超聲波脫氣后供HPLC分析。

1.3.4鹽酸克倫特羅的定性分析

將茶堿、鹽酸克倫特羅混合標準使用溶液及試樣處理液10 μL在相同的色譜條件下分別注入高效液相色譜儀進行分析，以標準溶液色譜峰的保留時間為依據對試樣處理液中的成分進行定性分析。

1.3.5試樣中鹽酸克倫特羅的定量分析［5-6］

取茶堿、鹽酸克倫特羅混合標準使用溶液10 μL注入高效液相色譜儀進行分析，得到茶堿、鹽酸克倫特羅的峰面積，計算鹽酸克倫特羅對茶堿的相應對響應值。鹽酸克倫特羅對茶堿的相對響應值計算公式如下：

式中：Sa1表示鹽酸克倫特羅對茶堿的相對響應值；Aa1、As分別為混合標準使用溶液中鹽酸克倫特羅、茶堿的峰面積；Wa1、Ws分別為混合標準使用溶液中鹽酸克倫特羅、茶堿的質量，g。

取試樣處理液10 μL，注入高效液相色譜儀進行分析，得到鹽酸克倫特羅、茶堿的峰面積，根據相對響應值計算試樣中鹽酸克倫特羅的質量。試樣中鹽酸克倫特羅含量的計算公式如下：

式中：W樣.鹽酸克倫特羅表示試樣中鹽酸克倫特羅的質量，g；A樣.鹽酸克倫特羅表示試樣中鹽酸克倫特羅的峰面積；W樣.茶堿表示試樣中茶堿的質量，g；A樣.茶堿表示試樣中茶堿的峰面積；Sa1表示鹽酸克倫特羅對茶堿的相對響應值；W樣表示試樣的質量，g；10-3表示單位換算系數。

2　結果與分析

2.1檢測波長的確定

根據參考文獻［7-10］，茶堿、鹽酸克倫特羅分別在波長204 nm、210 nm處有較大紫外吸收，在此基礎上，在波長200～400 nm進行紫外光譜掃描，結果如圖1所示。

圖1　茶堿、鹽酸克倫特羅紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of theophylline and clenbuterol hydrochloride

由圖1可知，茶堿、鹽酸克倫特羅2種物質在波長210 nm處都有明顯吸收。因此，選擇210 nm作為檢測波長。

2.2標準品及樣品HPLC色譜圖及內標物的選擇［11-15］

采用高效液相色譜法對混合標準溶液及待測樣品按照色譜工作條件的要求進行檢測，所得到的茶堿、鹽酸克倫特羅的色譜圖如圖2所示。

圖2　茶堿、鹽酸克倫特羅混合標準溶液（A）、樣品（B）及加標樣品（C）HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of theophylline and clenbuterol hydrochloride mixed standard solution（A），samples（B）and samples with standard（C）

由圖2可知，在相同色譜條件下同一物質具有相同的保留值。圖2A是混合標準品鹽酸克倫特羅、茶堿色譜圖，兩種物質能夠完全分離，茶堿的產生的峰面積與鹽酸克倫特羅的峰面積匹配性＞75%。圖2B是樣品色譜圖，只有一個鹽酸克倫特羅色譜峰，說明樣品中不含有內標物茶堿。圖2C是樣品加標色譜圖，鹽酸克倫特羅、茶堿兩個色譜峰的分離效果較好。因此，茶堿可以作為測定鹽酸克倫特羅的內標物。

2.3精密度的測定

取茶堿、鹽酸克倫特羅混合標準使用溶液，平行進樣5次，檢測到鹽酸克倫特羅對茶堿的相對響應值分別為1.326、1.314、1.313、1.315、1.312，平均值為1.316，測定結果的相對標準偏差（relativestandarddeviation，RSD）為0.13%。結果顯示，該方法的精密度良好，能滿足飼料中鹽酸克倫特羅的分析要求。

2.4方法的加標回收率試驗

在已知含量的飼料樣品處理液中分別加入鹽酸克侖特羅0.050 mg/kg、0.100 mg/kg、0.150 mg/kg 3個質量濃度添加水平，進行加標回收率試驗，每個樣品平行測定3次，已知含量的試樣中分別加入不同質量濃度的的茶堿、鹽酸克倫特羅標準溶液進行回收率試驗，結果見表1。由表1可知，鹽酸克倫特羅的回收率為97.8%～99.2%，RSD為0.16%，結果表明，該方法準確度高，可用于飼料中鹽酸克倫特羅的檢測。

表1　加標回收率試驗結果Table 1 Results of adding standard recovery rate tests

2.5方法檢出限

將茶堿、鹽酸克倫特羅標準溶液逐步稀釋，并在相同色譜條件下對其進行測定，以各物質的色譜峰峰面積相當于基線噪聲的3倍信噪比為標準，計算檢出限（S/N=3），結果見表2。由表2可知，茶堿、鹽酸克倫特羅檢出限分別為0.33 μg/kg和0.25 μg/kg，能夠滿足飼料中鹽酸克倫特羅的測定要求。

表2　茶堿、鹽酸克倫特羅檢出限Table 2 Detection limit of theophylline and clenbuterol hydrochloride

3　結論

本研究以茶堿作內標物，采用高效液相色譜內標法測定飼料中鹽酸克倫特羅，由于待測液中鹽酸克倫特羅與內標物茶堿組成恒定，避免了由于進樣體積、檢測器靈敏度、流速以及流動相組成發(fā)生變化對測定結果的影響。因此，內標法較外標法具有準確度高、重現性好的優(yōu)點。結果表明，樣品經三氯乙酸溶液提取、Oasia HLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg）處理和甲醇溶液沖洗后，采用Nova-Pak C18色譜柱（3.9 mm×150 mm×5 μm）分離，以流速0.8 mL/min的流動相乙腈-28 g/L磷酸二氫鈉緩沖溶液（25∶75，V/V）洗脫后，在檢測波長210 nm處檢測，茶堿和鹽酸克侖特羅的分離效果較好，鹽酸克倫特羅加標回收率為97.8%～99.2%，相對標準偏差（RSD）為0.16%，精密度試驗結果RSD值為0.13%，鹽酸克倫特羅的檢出限為0.25 μg/kg。說明該方法精密度良好、準確度高、檢出限低，可實現飼料中鹽酸克倫特羅的測定。為進一步研究鹽酸克倫特羅安全性評價提供理論依據。

［1］國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.歐盟食品衛(wèi)生法規(guī)匯編［M］.青島：中國海洋大學出版社，2003：773-777.

［2］顧振華，鄭雷軍.上海鹽酸克倫特羅食物中毒事件的分析與思考［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2007，19（1）：10-12.

［3］管健，王立嬡，吳平谷，等.同位素作內標氣質聯機測定動物源食品中4種β-興奮劑的含量［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17（12）：2194-2196.

［4］朱堅，李波，方曉明，等.氣相色譜-質譜法測定肝、腎和肉中11種β-受體激動劑殘留量［J］.質譜學報，2005，26（3）：129-137.

［5］高先娟.熒光分光光度法測定豬肉中的鹽酸克倫特羅的含量［J］.中國釀造，2014，33（9）：156-159.

［6］程弘夏，吳沁林，冉林榮，等.紫外分光光度法測定茶堿緩釋片中茶堿的含量［J］.化學與生物工程，2013，30（12）：75-77.

［7］欒燕，迂君，張玉黔，等.高效液相色譜法測定食品中鹽酸克倫特羅［J］.中國公共衛(wèi)生，2003，19（10）：1257-1258.

［8］王轉莉，段淑娥，王雋.反相高效液相色譜法測定肉制品中殘留的鹽酸克倫特羅［J］.應用化工，2013，42（9）：1718-1722.

［9］遲少云，楊釗.高效液相色譜-電噴霧質譜聯用技術檢測豬肝中克倫特羅殘留的方法研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17（4）：596-597.

［10］魯立良，王遠，郝家勇，等.基質固相分散/高效液相色譜-串聯質譜法分析肉腸中4種β-受體激動劑殘留［J］.分析測試學報，2012，31（5）：535-540.

［11］丁芳林，張朝輝，譚勝國，等.高效液相色譜法測定豬肉中的鹽酸克倫特羅的研究［J］.食品與機械，2007，23（5）：112-113.

［12］康莉，陳春曉，劉紅河，等.LC/MS/MS法測定豬肝中四環(huán)素類抗生素及鹽酸克倫特羅藥物殘留［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17（12）：2144-2146.

［13］趙思俊，鄭增忍，曲志娜，等.“瘦肉精”的危害及監(jiān)管檢測技術［J］.中國動物檢疫，2011，28（4）：1-3.

［14］賈濤.飼料中鹽酸克倫特羅的測定-HPLC法［J］.飼料研究，2011（6）：42-46.

［15］朱曉艾，陳雅君，陳雪香.高效液相色譜法檢測豬肉中鹽酸克倫特羅的前處理方法［J］.食品與機械，2015，31（2）：106-109.

DI Wanshan
（Department of Applied Chemistry，Liaoning Petrochemical Vocational and Technical College，Jinzhou 121001，China）

With the theophylline as internal standard，the detection method of clenbuterol hydrochloride in animal feedstuffs was established by HPLC. Samples were extracted by trichloroacetic acid solution，treated by Oasia HLB solid-phase extraction column（3 ml/60 mg），washed by 5%methanol solution，separated by Nova-Pak C18column（3.9 mm×150 mm×5 μm），eluted by acetonitrile-28 g/L sodium dihydrogen phosphate buffer（25：75，V/V）as mobile phase，with flow rate of 0.8 ml/min，determine wavelength of 210 nm.Results showed that under the conditions，theophylline could was separated with clenbuterol hydrochloride completely，could be used as an internal standard of determination of clenbuterol hydrochloride.The adding standard recovery rate of clenbuterol hydrochloride was 97.8%-99.2%.The relative standard deviation（RSD）of precision tests results was 0.13%.Due to the simple operation，high accuracy and good precision，the method can be used for clenbuterol hydrochloride content analysis in feedstuffs.

HPLC；internal standard method；theophylline；clenbuterol hydrochloride；feedstuffs

TS207.3

0254-5071（2016）06-0170-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.036

2016-03-02

邸萬山（1966-），男，副教授，本科，研究方向為食品分析、工業(yè)分析和環(huán)境分析。