葉茂友，嚴蘋方，孫水裕, 2，韓大建，莊圣煒，鄭 莉，黃紹松

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銅離子濃度對嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌生長特性和生長動力學的影響

葉茂友1，嚴蘋方1，孫水裕1, 2，韓大建1，莊圣煒1，鄭 莉1，黃紹松1

(1. 廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院，廣州 510006；2. 廣東環(huán)境保護工程職業(yè)學院，佛山 528216)

通過研究Cu2+濃度對嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌()生長特性的影響，得到在不同Cu2+濃度下菌的生長曲線，探究不同Cu2+濃度對培養(yǎng)液中細菌濃度、pH、亞鐵濃度和氧化還原電位的影響。結(jié)果表明：菌對Cu2+具有一定的耐受能力；當培養(yǎng)液中(Cu2+)≤0.5 g/L時，Cu2+對菌的生長活性影響較小；當(Cu2+)在1.0~2.0 g/L之間變化時，菌的生長活性開始受到Cu2+的影響，出現(xiàn)明顯的延遲效應(yīng)，Cu2+開始抑制細菌生長繁殖；當(Cu2+)≥3.5 g/L 時，菌生長完全受到抑制，幾乎停止生長。隨著培養(yǎng)液中Cu2+濃度的增加，菌生長活性受到的抑制作用也增大。依據(jù)Monod方程推導并建立了菌在不同Cu2+濃度下的生長動力學方程，各動力學曲線的相關(guān)性較好，表明動力學方程能較好地描述不同Cu2+濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長的影響。

嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌；銅離子；生長特性；生長動力學

隨著社會的發(fā)展，礦物資源日漸貧乏，在富礦、易處理礦資源日漸減少、環(huán)保要求不斷提高、現(xiàn)代工業(yè)和科技發(fā)展對金屬的需求與日俱增的條件下，低品位礦的開發(fā)利用，越來越受到國內(nèi)外的廣泛重視[1?4]。利用傳統(tǒng)的物理和化學方法來提取低品位的硫化礦中的金屬是比較困難和昂貴的[5]。生物浸出方法具有操作簡單、能耗低、環(huán)境友好等特點[6]，逐漸成為研究的熱點[7?9]。目前，生物浸出技術(shù)主要應(yīng)用于低品位的銅礦的開采[10?12]。

生物浸出是通過微生物從礦石上提取有用金屬的選礦方法，利用微生物在生命活動中自身的氧化和還原特性，使資源中的有用成分氧化或還原，以水溶液中離子態(tài)或沉淀的形式與原物質(zhì)分離。在生物浸出過程中，礦石中金屬被細菌氧化浸出，溶解進入溶液，一定量的金屬離子對于細菌生長是必需的，但是當溶液中的金屬濃度超過細菌生長耐受范圍時，過高的滲透壓以及金屬離子與細菌的作用等因素會抑制細菌的生長，甚至導致細菌的死亡。大量研究表明過量的金屬離子對浸礦細菌—氧化亞鐵硫桿菌(，)一般都具有一定的毒性，溶液中的重金屬離子會抑制細菌的生長[13?14]，從而抑制生物浸出。金屬離子和其他影響因素對氧化亞鐵硫桿菌的生長動力學的影響已有報道[15?17]，但從動力學方面考察Cu2+濃度對嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌生長動力學的影響卻鮮見報道。

本文作者通過研究不同Cu2+濃度培養(yǎng)條件下的菌生長過程，考察Cu2+對細菌生長活性的影響；利用存在非競爭性抑制的Monod模型，獲得不同Cu2+濃度培養(yǎng)條件下的菌生長動力學方程，為生物浸出含銅硫化礦的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和指導作用。

1 實驗

1.1 實驗材料和儀器

實驗菌種：實驗所用的嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(，)菌株來源于廣東省某礦山的酸性礦坑廢水，采用9K培養(yǎng)基進行分離，利用9K固體培養(yǎng)基進行純化，實驗室保存，用于試驗。經(jīng)檢測菌株與ATCC23270同源性為99%。

實驗儀器：北京瑞利UV?2100 型紫外分光光度計；上海一恒?THZ?98C型恒溫振蕩器；島津(Shimadzu)AUY120型電子分析天平；梅特勒?托利多(Mettler Toledo)DELTA320型酸度(pH)計及雷磁PHS?25型氧化還原電位計；奧林巴斯(Olympus)CX41型相差顯微鏡。

實驗藥品：硫酸(H2SO4)，硫酸銨[(NH4)2SO4]，氯化鉀(KCl)，磷酸氫二鉀(K2HPO4)，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)，硝酸鈣[Ca(NO3)2]，硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)，硫酸銅(CuSO4·5H2O)，所有的藥品都為分析純，購買于廣州化學試劑廠。實驗用水為二次蒸餾水。

9K培養(yǎng)基[18?19]：3.0 g (NH4)2SO4、0.1 g KCl、0.5 g K2HPO4、0.5 g MgSO4·7H2O、0.01 g Ca(NO3)2溶于去離子水 700 mL中，pH 用 1:1 H2SO4調(diào)為 2.0，在 121 ℃滅菌處理2 0 min；取44.7 g FeSO4·7H2O溶于300 mL無菌水中，用1:1 H2SO4調(diào)節(jié) pH=2.0，用0.22 μm濾膜的針管過濾器過濾除菌，然后與上述培養(yǎng)基混合。

1.2 分析方法

利用酸度(pH)計進行pH的測定；利用氧化還原電位計進行氧化還原電位(Oxidation-reduction potential，ORP)的測定；采用UV?2100型紫外可見分光光度計，通過鄰菲啰啉分光光度法進行Fe2+濃度的測定[20?21]。Fe2+與鄰菲啰啉發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，產(chǎn)生橙紅色的絡(luò)合物，在510nm處測量吸光度，計算Fe2+濃度。細菌活體數(shù)采用血球計數(shù)法進行細菌濃度的測定[22]。

1.3 實驗方案

在250 mL錐形瓶中裝入100 mL 9K培養(yǎng)液中，加入適量Cu2+，將培養(yǎng)后的菌(菌種濃度達1×108mL?1)接入錐形瓶中，置于30℃、160 r/min的恒溫振蕩器內(nèi)培養(yǎng)。定時測定培養(yǎng)液中的pH、ORP、細菌濃度、Fe2+濃度。定期期補加蒸餾水彌補損耗的水分。同時設(shè)置不加Cu2+的空白實驗。具體實驗方案如表1所示。

1.4 生長動力學模型

綜合氧化亞鐵硫桿菌的生長動力學模型，選擇Monod方程[15, 23?24]作為菌的生長動力學模型，該方程表達形式如下：

表1 氧化亞鐵硫桿菌培養(yǎng)的實驗條件

故式(1)可以寫成

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu2+濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長活性的影響

通過改變培養(yǎng)基中Cu2+濃度，研究Cu2+濃度對菌生長過程的影響，實驗過程中細菌濃度及Fe2+濃度((Fe2+))隨時間的變化如圖 1和2 所示。

研究結(jié)果表明，當培養(yǎng)基中Cu2+濃度增加會抑制菌的生長，濃度越大，抑制作用越明顯；當培養(yǎng)液中Cu2+濃度上升時，開始產(chǎn)生延遲效應(yīng)，抑制細菌生長。當培養(yǎng)液中不存在Cu2+時，菌在12 h后開始進入對數(shù)生長期，48 h后開始進入穩(wěn)定期，F(xiàn)e2+的氧化18 h后開始進入快速氧化階段，到54 h時Fe2+基本氧化完全；當(Cu2+)≤0.5g/L時，Cu2+對細菌生長活性影響很小，Cu2+沒有對細菌的生長繁殖造成不良影響，菌出現(xiàn)約3 h的延遲效應(yīng)，培養(yǎng)液中Fe2+的氧化也相應(yīng)地出現(xiàn)了一些延遲效應(yīng)；當(Cu2+)=1.0 g/L時，菌生長受到抑制已經(jīng)比較明顯，停滯期明顯增加，培養(yǎng)30 h后細菌才開始進入對數(shù)生長期，F(xiàn)e2+的氧化也持續(xù)地明顯延遲；當(Cu2+)=2.0g/L時，停滯期延長至54 h，菌對 Fe2+氧化活性顯著降低，細菌經(jīng)過60 h后，才進入Fe2+快速氧化階段,當(Cu2+)≥ 3.5g/L時，菌的生長繁殖受到了極大抑制，細菌的生長繁殖基本處于停止狀態(tài)，部分菌體死亡，培養(yǎng)液中Fe2+的氧化率很低，Cu2+對細菌生長活性影響很大，影響細菌的生長繁殖。Cu2+是細菌蛋白和酶的組成成分，是必需的微量元素，一般以輔基的形式參與細胞內(nèi)的代謝[25]，少量Cu2+對細菌的生長不會造成影響。但是隨著培養(yǎng)液中Cu2+濃度的不斷上升，菌的停滯適應(yīng)期不斷增長，微生物體內(nèi)ATP酶的活性不斷降 低[26]，Cu2+能夠與細胞蛋白質(zhì)結(jié)合，Cu2+進入細胞后與酶上的—SH基結(jié)合而使其活性不斷降低或失去活性，或與代謝中間產(chǎn)物結(jié)合而使代謝受阻，或取代細胞結(jié)構(gòu)上的主要元素，使正常的代謝物變?yōu)闊o效的化合物，細菌的生長變得越來越緩慢，從而抑制細菌的生長，甚至導致細菌死亡[27]。同時隨著 Cu2+質(zhì)量濃度的上升，培養(yǎng)液中的滲透壓也同時增大，進而影響細菌正常的生理功能Cu2+濃度越大，對菌生長的阻礙越大。當細菌生長環(huán)境中存在較高濃度Cu2+時，細菌會經(jīng)過一定的改變和調(diào)整代謝途徑以適應(yīng)新環(huán)境。但是這種適應(yīng)性一般是有限度的、暫時的，也可能是永久性的。

圖1 不同 Cu2+濃度下細菌濃度的變化曲線

圖2 不同 Cu2+濃度下ρ(Fe2+)隨時間的變化曲線

2.2 Cu2+濃度對培養(yǎng)ORP和pH的影響

在不同Cu2+濃度范圍內(nèi)，考察培養(yǎng)液的pH和ORP的變化情況，菌培養(yǎng)液的pH值和ORP隨培養(yǎng)時間的變化如圖3和4所示。

由圖3可知，在不同 Cu2+濃度下，隨著培養(yǎng)時間的延長，pH值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。培養(yǎng)液中不含Cu2+時，培養(yǎng)液中的pH值在30h時達到最大值(pH=2.55)；當培養(yǎng)液中(Cu2+)=0.5g/L時，pH值在36 h達到最高值(pH=2.56)，當培養(yǎng)液中(Cu2+)為1.0 g/L和2.0 g/L時，pH值分別在48和78 h達到最高值(pH=2.55和2.60)；當培養(yǎng)液中(Cu2+)≥3.5 g/L時，pH最高值的出現(xiàn)時間更加延后。隨著溶液中Cu2+濃度的增加，培養(yǎng)液pH達到最大值的時間出現(xiàn)了延遲。

菌生長過程中的主要化學反應(yīng)如下[28?30]：

Fe2++H++1/4O2→Fe3++1/2H2O (4)

Fe3++H2O→FeOH2++H+(5)

FeOH2++H2O→Fe(OH)2++H+(6)

Fe3++H2O→1/2Fe2(OH)42++H+(7)

1/2Fe2(OH)42++2H2O→Fe(OH)3+2H+(8)

Fe(OH)3+4/3SO24?+Fe3++H2O+2/3NH4+→

2/3NH4Fe3(SO4)2(OH)6+H+(9)

3Fe3++2SO42?+6H2O→KFe3(SO4)2(OH)6+6H+(10)

在細菌培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液的 pH開始呈上升趨勢，由于Fe2+氧化成Fe3+過程中會消耗H+(見式(4))，從而在培養(yǎng)開始階段出現(xiàn)pH上升的現(xiàn)象；當培養(yǎng)一段時間后，細菌進入指數(shù)增長期后，F(xiàn)e3+發(fā)生連續(xù)的水解反應(yīng)，培養(yǎng)液中開始出現(xiàn)黃銨鐵礬[NH4Fe3- (SO4)2(OH)6]或者黃鉀鐵礬[KFe3(SO4)2(OH)6]沉淀，釋放出H+(見式(5)~(10))，使pH開始下降，在細菌生長進入穩(wěn)定期后，pH下降到2.20左右。細菌生長活性越強，F(xiàn)e2+氧化成Fe3+的速率越快，pH上升得越快，隨后pH值下降也越快。Cu2+濃度越大，對菌生長的抑制越大，細菌生長活性受到抑制，pH的變化就會出現(xiàn)明顯的延遲現(xiàn)象。

培養(yǎng)液中的ORP值變化規(guī)律如圖4所示。由圖4可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，ORP值呈現(xiàn)上升的趨勢，菌將培養(yǎng)液中的 Fe2+氧化為Fe3+，F(xiàn)e3+濃度增加，(Fe3+)/(Fe2+)比值增加，導致溶液氧化還原電位上升[15]。隨著培養(yǎng)液中Cu2+濃度的升高，ORP值上升出現(xiàn)延滯現(xiàn)象，培養(yǎng)液中Cu2+濃度越低，ORP上升的越快。經(jīng)過一段時間后，ORP值也開始趨于比較穩(wěn)定，穩(wěn)定在540~550 mV左右。當(Cu2+)≥3.5g/L，菌的生長受到很大抑制，ORP值上升的很緩慢，基本處于停滯狀態(tài)。隨著Cu2+濃度增加，Cu2+抑制了菌的生長，導致對Fe2+的氧化能力降低，培養(yǎng)液中(Fe3+)/(Fe2+)比值隨Cu2+濃度的增加而降低。

圖3 不同 Cu2+濃度下pH隨時間的變化曲線

圖4 不同Cu2+濃度下ORP隨時間的變化曲線

2.3 生長動力學參數(shù)的確定

參考相關(guān)的方法求解動力學方程，進行相關(guān)參數(shù)的計算，確定不同Cu2+濃度下細菌的最大比生長速率m、Monod飽和常數(shù)M、Cu2+抑制常數(shù)I。

細菌比生長速率利用兩點法求解，其滿足如下方程：

實驗采用等間隔時間取點分析[15?16]，綜合上面的公式可以簡化為

式中：為培養(yǎng)液中的細菌濃度(L?1)，為培養(yǎng)時間(h)。

對于動力學模型，可以變形為

不同 Cu2+濃度下菌動力學參數(shù)的求解曲線如圖 5 所示。對1/?1/(Fe2+)作圖，曲線的截距為1/′m，的截距為?1/M，從而求出′m和M的值?？梢詮那€求解得到的細菌生長的動力學參數(shù)′m和M?？瞻讓嶒炁囵B(yǎng)液中不含有Cu2+，因此，可認為空白實驗的′m=m=0.2204 h?1。

圖 5 中各動力學曲線的相關(guān)性較好，2都大于0.978，證明所得動力學參數(shù)與實驗結(jié)果比較的吻合。由表2可知，M值基本不變，抑制劑對酶催化反應(yīng)速率的非競爭性抑制中M值是保持恒定的，非競爭性抑制中抑制劑的濃度只影響m的值，而不影響M值，實驗結(jié)果與非競爭性抑制結(jié)論相符。I和m均發(fā)生不同程度的變化，這一結(jié)果與實驗選擇的培養(yǎng)液中Cu2+濃度條件有關(guān)。表2中I的數(shù)值大小表示菌對Cu2+的親和力的大小，隨著培養(yǎng)液中Cu2+濃度的增加，菌對Cu2+的親和力也相應(yīng)增大，導致培養(yǎng)液中Cu2+的非競爭性抑制作用也相應(yīng)增加，I值減小，I值的下降表明其抑制程度增加[15, 23]。隨著培養(yǎng)液中Cu2+濃度的增加，Cu2+抑制作用隨之增加。Cu2+通常能與酶的控制部位中的—SH作用，改變酶的空間結(jié)構(gòu)，引起非競爭性抑制。抑制劑Cu2+濃度越大，形成不能轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的EI(酶—抑制劑復合物)或IES(底物?酶?抑制劑三元復合物)越多，m降低的程度越顯著。由于m降低，酶的反應(yīng)速率也相應(yīng)減小。抑制劑Cu2+的結(jié)合可導致酶活性中心的構(gòu)型發(fā)生改變，削弱了底物(Fe2+)和酶活性中心的結(jié)合，即減小了最大反應(yīng)速率m。非競爭性抑制作用的強弱取決于抑制劑的絕對濃度，因而不能用增大底物濃度的辦法來消除非競爭性抑制作用[23]。

圖5 不同Cu2+濃度下A. f菌的動力學曲線

表2 A.f菌生長動力學參數(shù)值

3 結(jié)論

1) 不同 Cu2+濃度下嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌的細菌濃度和(Fe2+)隨時間的變化結(jié)果表明：菌對Cu2+具有一定的耐受能力，隨著培養(yǎng)液中的Cu2+濃度的增加，菌生長繁殖的受到的阻礙越大，Cu2+濃度越大，菌受到的抑制作用越明顯。Cu2+進入細胞后與酶上的—SH基結(jié)合，造成微生物體內(nèi)ATP酶的活性不斷降低，細菌的生長變得越來越緩慢，從而抑制細菌的生長，甚至導致細菌死亡。隨著Cu2+質(zhì)量濃度的上升，培養(yǎng)液中的滲透壓也同時增大，進而影響細菌正常的生理功能。

2) 不同Cu2+濃度下嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌的pH和 ORP隨時間的變化結(jié)果表明：pH值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，F(xiàn)e2+氧化成Fe3+過程中消耗H+使pH上升，然后Fe3+發(fā)生水解反應(yīng)，并釋放出H+使pH開始下降；ORP呈現(xiàn)逐步上升，最后達到平穩(wěn)，F(xiàn)e2+氧化為Fe3+，培養(yǎng)液中(Fe3+)/(Fe2+)比值增加，導致ORP上升。隨著Cu2+濃度的增加，細菌的生長繁殖受到抑制，pH和ORP的變化出現(xiàn)了明顯的延遲現(xiàn)象。

3) 考察了不同Cu2+濃度下，嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌的細菌濃度和(Fe2+)隨時間的變化，利用基于存在非競爭性抑制的Monod方程，建立了菌在不同Cu2+濃度下的生長動力學方程模型，得到4個Cu2+濃度下菌生長的動力學參數(shù)值。結(jié)果表明：隨著 Cu2+濃度的增加，非競爭性抑制作用增加，削弱了底物(Fe2+)與酶活性中心的結(jié)合，I和m逐漸減小，表明在一定Cu2+濃度下(低于2.0 g/L時)，菌才能正常生長。

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(編輯 龍懷中)

Effect of copper ion concentration on growth activity and kinetics of

YE Mao-you1, YAN Ping-fang1, SUN Shui-yu1, 2, HAN Da-jian1, ZHUANG Sheng-wei1, ZHENG Li1, HUANG Shao-song1

(1. School of Environmental Science and Engineering, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China; 2. Guangdong Polytechnic of Environmental Protection Engineering, Foshan 528216, China)

The effect of initial copper ion concentration on the growth activity ofwas investigated, and the bacterial growth curves, bacteria concentration, pH, ferrous concentration and oxidation-reduction potential in the culture solution were obtained at different Cu2+concentrations. The results show that to some extentis tolerant to copper ion. When cultured in 9K medium containing(Cu2+)≤0.5 g/L, little effect on the growth and activity ofis brought to copper ion. When(Cu2+) is 1.0?2.0 g/L, the growth and activity ofare obviously influenced by copper ion and appear delayed effects, and then copper iron begins to inhibit the bacterial growth. When the concentration of copper ion is over 3.5 g/L, the inhibiting effect on activity ofis completely inhibited, bacteria almost stops growing. With the increase of Cu2+concentration in the culture medium, the inhibiting effect on growth activity ofincreases.Based on the model of Monod function, the growth kinetics equation ofat different copper iron concentration is built up. The correlation of kinetic curve is better, which shows that the kinetics equation can well describe the growth ofat different initial copper iron concentrations.

; copper ion; growth activity; growth kinetics

Projects(2015A030308008, 2015A030310143) supported by the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China; Project(2016A040403068) supported by the Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China; Project(2016AG100482) supported by the Science and Technology Innovation Project of Foshan, China

2015-11-10; Accepted date:2016-04-18

SUN Shui-yu; Tel: +86-20-39322037; E-mail: sysun@gdut.edu.cn

1004-0609(2016)-10-2238-08

Q935

A

廣東省自然科學基金資助項目(2015A030308008，2015A030310143)；廣東省科技計劃資助項目(2016A040403068)；佛山市科技創(chuàng)新項目資助(2016AG100482)

2015-11-10；

2016-04-18

孫水裕，教授，博士；電話：020-39322037；E-mail: sysun@gdut.edu.cn