尚永輝, 劉 彬，古元梓

(咸陽(yáng)師范學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院,陜西咸陽(yáng) 712000)

蘆丁是一種自然界中常見(jiàn)的黃酮醇類(lèi)化合物，多存在于煙葉、棗、杏、橙皮、番茄、蕎麥花等植物中，具有抗炎、抗病毒、抗衰老、抗癌等多種功效[1,2]。目前文獻(xiàn)報(bào)道蘆丁的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[3]、毛細(xì)管電泳法[4]、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[5]等。脫氧核糖核酸(DNA)是生物體遺傳信息的重要載體，與生物體的生長(zhǎng),發(fā)育以及病變過(guò)程息息相關(guān)，深入研究藥物小分子與DNA的相互作用信息有助于從分子水平上了解生命現(xiàn)象的本質(zhì)[6]。

本文探討了蘆丁在多壁碳納米管修飾碳糊電極(MWCNTs/CPE)上的電化學(xué)行為，在此基礎(chǔ)上研究了蘆丁與DNA的相互作用信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；RF5301型熒光光譜儀(日本，島津公司)；CH2250型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ520DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；三電極系統(tǒng)：MWCNTs/CPE為工作電極，Hg/Hg2Cl2電極為參比電極，鉑電極為輔助電極。

1.0×10-3mol/L蘆丁溶液：稱(chēng)取0.0305 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)用乙醇在50 mL燒杯里攪拌至完全溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容備用。604 μg/mL DNA溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0151 g鯡魚(yú)精DNA(fsDNA,美國(guó)Sigma公司)用蒸餾水完全溶解，定量轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，0～4 ℃保存?zhèn)溆谩?.0×10-3mol/L中性紅溶液：稱(chēng)取0.0144 g中性紅(純度大于99%，上海試劑三廠)，用蒸餾水溶解，定量轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，備用。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1修飾電極的制備稱(chēng)取適量石墨粉于研缽中，滴加液體石蠟并充分研磨，至呈有一定韌性的小片狀，填入0.5 mL注射器中，壓實(shí)，從另一端插入一根打磨過(guò)的銅絲作為導(dǎo)線，即制得碳糊電極(CPE)，將電極在稱(chēng)量紙上打磨拋光，備用。稱(chēng)取5 mg經(jīng)混酸處理過(guò)的MWCNTs粉末(>98%,成都有機(jī)研究所)，加入5 mL DMF并置于試管中，用數(shù)控超聲波清洗器進(jìn)行超聲分散2 h，使其均勻分散。取適量滴至拋光好的CPE上，紅外燈烘干，備用。

1.2.2電化學(xué)測(cè)定準(zhǔn)確移取一定量蘆丁儲(chǔ)備液于10 mL比色管中，加入pH=3.21的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液3.0 mL，用去離子水定容，以MWCNTs/CPE為工作電極，用三電極系統(tǒng)測(cè)定，記錄循環(huán)伏安曲線和微分脈沖伏安曲線。

1.2.3光化學(xué)測(cè)定準(zhǔn)確移取一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，移取pH=3.21的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液3.0 mL，加入一定量DNA溶液，定容到10 mL，搖勻，放置1 h后，用熒光光譜儀以306 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，狹縫寬度均為5.0 nm，測(cè)定350～750 nm的發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁在MWCNTs/CPE上的電化學(xué)行為

實(shí)驗(yàn)考察了蘆丁分別在CPE和MWCNTs/CPE上的電化學(xué)行為，結(jié)果見(jiàn)圖1。2.0×10-4mol/L蘆丁在CPE以及MWCNTs/CPE兩個(gè)電極上的氧化峰、還原峰電位均在0.508 V和0.438 V，峰電位無(wú)明顯移動(dòng)；但在修飾電極上的電流信號(hào)明顯強(qiáng)于CPE，其中在修飾電極上的氧化峰電流信號(hào)是CPE上的2.15倍，還原峰電流信號(hào)是CPE上的1.95倍，表明對(duì)蘆丁具有明顯的催化作用。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.2.1最佳pH值實(shí)驗(yàn)考察了蘆丁在不同pH的B -R緩沖溶液中的電化學(xué)行為，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知：隨著pH的增加，蘆丁的氧化峰、還原峰峰電位均線性負(fù)移，其中氧化峰電位與pH的線性關(guān)系為:Epa=-0.0648pH+0.6997(r=0.9980)，表明蘆丁在MWCNTs/CPE上的電極反應(yīng)過(guò)程有質(zhì)子參與，依據(jù)Epa=E0-0.059(m/n)pH，計(jì)算得到：m/n=1，即m=n，可知該電極反應(yīng)過(guò)程為等質(zhì)子等電子反應(yīng)過(guò)程[7]。實(shí)驗(yàn)中pH=3.21時(shí)峰電流最大，且峰形最佳，實(shí)驗(yàn)選擇pH為3.21。

2.2.2底液的選擇實(shí)驗(yàn)考察了蘆丁分別在pH=3.21的B -R、檸檬酸-檸檬酸鈉、Na2HPO4-檸檬酸、鄰苯二甲酸-HCl、HAc-NaAc 5種緩沖溶液中的電化學(xué)行為，結(jié)果見(jiàn)圖3。研究發(fā)現(xiàn)蘆丁在pH=3.21的Na2HPO4-檸檬酸緩沖體系中峰電流最大，峰形最好。實(shí)驗(yàn)選擇pH=3.21 Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液為底液。

2.2.3掃描速率對(duì)電化學(xué)信號(hào)的影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了掃描速率對(duì)蘆丁電化學(xué)信號(hào)的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖可知氧化峰電流、還原峰電流均隨掃描速率的增大而增加，其中氧化峰電流ipa與v呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為：ipa(μA)=-5.731v(V/s)-3.3926(r=0.9985)，表明蘆丁在MWCNTs/CPE上的電化學(xué)氧化過(guò)程是受吸附控制的電極反應(yīng)過(guò)程；氧化峰電位Epa與lnv呈良好的線性關(guān)系，線性方程

2.4 線性關(guān)系

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,采用循環(huán)伏安法測(cè)定，蘆丁濃度在5.0×10-7～2.0×10-4mol/L范圍內(nèi)與其氧化峰電流ipa呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：ipa(μA)= 4.77c蘆丁(10-4mol/L)+1.4563(r=0.9990)，檢出限為2.0×10-7mol/L，應(yīng)用該方法測(cè)定5.0×10-6mol/L的蘆丁溶液20次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.58%。該方法具有靈敏度高，檢出限低，線性范圍寬，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，有望作為蘆丁測(cè)定的新方法。

2.5 蘆丁與DNA相互作用的研究

2.5.1蘆丁與DNA相互作用的電化學(xué)行為在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，固定蘆丁濃度為1.0×10-4mol/L，加入一定量DNA溶液，待兩者充分混合反應(yīng)后，以MWCNTs/CPE為工作電極測(cè)定體系的微分脈沖伏安曲線，見(jiàn)圖5。由圖5可知，蘆丁的氧化峰電流隨DNA的加入明顯降低，峰電位逐漸正移，依據(jù)Bard[10]等人的經(jīng)驗(yàn)，推測(cè)蘆丁與DNA主要以嵌入作用為主；從分子結(jié)構(gòu)上看，蘆丁的主體結(jié)構(gòu)有多個(gè)羥基，為親水基團(tuán)，易于DNA上的堿基發(fā)生相互作用。

2.5.2以中性紅為探針研究蘆丁與DNA相互作用具有平面吩嗪環(huán)特征的中性紅分子能與DNA發(fā)生嵌插作用[11]，為了進(jìn)一步探究蘆丁與DNA的相互作用機(jī)理，實(shí)驗(yàn)以中性紅作為電化學(xué)探針進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)分別取一定量中性紅、中性紅與DNA，以及中性紅、DNA和蘆丁的混合溶液，靜置反應(yīng)30 min后，分別測(cè)定體系的微分脈沖伏安圖(圖6(a))和熒光光譜圖(圖6(b))。

由圖6(a)可知，中性紅在-0.4657 V處具有一靈敏的還原峰(圖6(a)曲線1)，當(dāng)加入DNA后，由于中性紅與DNA的結(jié)合導(dǎo)致游離的中性紅濃度降低，中性紅電流隨之降低(圖6(a)曲線2)，繼續(xù)加入一定量的蘆丁后，中性紅的峰電流又明顯增強(qiáng)(圖6(a)曲線3)；由圖6(b)熒光圖譜得到了類(lèi)似的結(jié)果。這可能是由于蘆丁與DNA的結(jié)合使體系中原來(lái)插進(jìn)DNA雙鏈堿基對(duì)中的中性紅分子再次的游離出來(lái)，體系中游離的中性紅濃度增加而導(dǎo)致其光電化學(xué)信號(hào)增強(qiáng)；蘆丁能取代中性紅與DNA產(chǎn)生相互作用，表明蘆丁和中性紅與DNA的相互作用方式及位點(diǎn)相同，進(jìn)一步表明實(shí)驗(yàn)條件下蘆丁能有效插進(jìn)DNA雙鏈的堿基對(duì)中間與DNA發(fā)生嵌插作用的結(jié)合。應(yīng)用電化學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按照文獻(xiàn)方法[12]計(jì)算了蘆丁與DNA的結(jié)合數(shù)m=1，兩者的結(jié)合常數(shù)β=3.77×105L/mol。

3 結(jié)論

采用循環(huán)伏安法和微分脈沖伏安法研究了蘆丁在多壁碳納米管修飾碳糊電極上的電化學(xué)行為，在此基礎(chǔ)上研究了蘆丁與DNA的相互作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管對(duì)蘆丁具有明顯催化作用，在pH=3.21的Na2HPO4-檸檬酸緩沖體系中蘆丁能產(chǎn)生良好的電化學(xué)信號(hào)，蘆丁在多壁碳納米管修飾電極上的反應(yīng)是受吸附控制的2質(zhì)子，2電子反應(yīng)過(guò)程，在此基礎(chǔ)上研究DNA的加入對(duì)蘆丁氧化峰的影響，發(fā)現(xiàn)蘆丁能通過(guò)嵌入方式與DNA相結(jié)合。