馬 琦，李 坤，張素芳，宋金萍,，郭 永，董 川

(1.山西大同大學化學與環(huán)境工程學院，應用化學研究所，山西大同 037009;2.山西大學環(huán)境科學研究所，山西太原 030006)

核黃素又稱維生素B2，它是異咯嗪的一種衍生物，在生物體內通過與三磷酸腺苷(ATP)反應生成腺嘌呤二核苷酸(FAD)，從而參與生物體內的重要代謝活動[1]。當體內核黃素缺乏時，將造成機體代謝障礙，產生口角炎、唇炎、舌炎、結膜炎及陰囊炎等炎癥，因而高效靈敏的檢測體內的核黃素對于疾病的預防和監(jiān)測具有重要的意義。目前，常用于檢測核黃素的手段主要包括：紫外-可見分光光度法[2]、熒光法[3]、高效液相色譜法[4]及電化學法[5]。其中，電化學方法因高靈敏性、操作方便、價廉等優(yōu)點已受到研究人員的廣泛關注。例如，唐平等[6]研究了核黃素在裸金電極及分子自組裝膜電極上的電化學行為，檢出限可達10-7mol數量級。同時一些研究結果已經顯示：納米材料的引入會極好地提高核黃素檢測的靈敏度。例如Fe2O3/MWCNTs/AuNPs復合材料可以檢測nmol數量級的核黃素[7]。

作為繼富勒烯和碳納米管之后的另一個新型碳材料，石墨烯因其優(yōu)良的電子傳輸性能、超大比表面積、高機械強度等特性已吸引了廣大研究者的關注，并在電催化領域中顯示了其獨特的魅力。孫紅力等[8]采用水合肼還原氧化石墨烯的方法制得石墨烯材料，隨后用石墨烯/Nafion膜修飾電極測定了核黃素，但檢出限只能達到1.0×10-6mol·L-1。倪永年等[9]利用聚脫氧腺苷酸將石墨烯固定在金電極表面，其對核黃素檢測的檢出限可達1.5×10-8mol·L-1。本文主要研究電化學還原石墨烯和Nafion復合材料修飾的玻碳電極上核黃素的電化學性質。與水合肼還原石墨烯相比[8]，電化學還原石墨烯能夠極大增強核黃素的電化學響應信號，使分析檢出能力提高。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電化學測量在CHI660 E電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)上進行，以玻碳電極(直徑為3 mm)為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑柱電極為對電極組成三電極系統(tǒng)。

石墨粉購自Alfa Aesar，采用Hummers方法[10]制備氧化石墨烯(GO)，用水分散成1 mg/mL懸浮液備用。5%Nafion乙醇溶液購自Fluka。核黃素、維生素B1、維生素B6、煙酸、煙酰胺、尿酸、維生素C、色氨酸、多巴胺等均購自阿拉丁試劑公司，使用時配成1.0×10-3mol·L-1的儲備液并保存于暗處。其它試劑均購自北京化工廠。所用試劑均為分析純，使用前未被純化。實驗用水皆為二次蒸餾水。

1.2 修飾電極的制備

玻碳電極在使用前依次用粒徑為1.0、0.3、0.05 μm 的Al2O3水糊打磨成鏡面，經超聲波清洗，再經乙醇洗滌后，備用。準確移取2 mL 500 μg/mL GO水溶液，加入200 μL 5%Nafion乙醇溶液，超聲分散5 min，得GO/Nafion修飾液。用微量進樣器均勻滴加6 μL上述GO/Nafion修飾液于預處理過的玻碳電極表面，用紅外燈烤干得GO/Nafion修飾電極。把修飾好的電極放到pH=5.0的HAc-NaAc緩沖溶液中，在-1.0～1.0 V之間循環(huán)掃描5圈，即得電化學還原石墨烯(ECGO)/Nafion修飾電極，備用。

1.3 電化學測量

將核黃素用pH=5.0的HAc-NaAc 緩沖溶液稀釋至所需濃度，以裸玻碳電極或修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極及鉑柱對電極組成三電極系統(tǒng)，在-1.0～1.0 V電位范圍內，50 mV·s-1掃描速度下記錄循環(huán)伏安曲線。差示脈沖伏安曲線掃描范圍為-1.0～0 V，靜置時間180 s。

2 結果與討論

2.1 核黃素在不同電極上的循環(huán)伏安行為

圖1顯示了1.0×10-4mol·L-1核黃素在裸玻碳電極、GO/Nafion和ECGO/Nafion修飾電極上的循環(huán)伏安行為。結果表明，核黃素在裸玻碳電極上的電化學信號較弱，但在GO/Nafion修飾電極上電信號明顯改善，其中還原峰電流增大更加明顯。將GO/Nafion修飾電極在HAc-NaAc(pH=5.0) 緩沖溶液中掃描5圈后，GO被部分還原成ECGO，核黃素在ECGO/Nafion修飾電極上分別在Epa=-301 mV(Epc=-394 mV) 處出現一對氧化還原峰，且氧化還原峰電流明顯強于GO/Nafion修飾電極，這說明GO經電化學作用后，所得ECGO對核黃素的電催化能力更強。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1緩沖溶液的選擇圖2顯示了核黃素在Na2HPO4-NaH2PO4(pH=7.0) 緩沖溶液和HAc-NaAc(pH=5.0) 緩沖溶液中的循環(huán)伏安行為。結果顯示：核黃素在以上兩種底液中均顯示出相應的氧化還原峰，其中在HAc-NaAc緩沖溶液中峰形較好，峰電流較強，而在Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液中，峰電流明顯較低，且峰形不對稱，故隨后的實驗均選擇HAc-NaAc緩沖溶液作為底液。

2.2.2修飾劑用量的選擇進一步考察了GO/Nafion修飾液用量對電化學信號的影響。結果顯示，隨著GO/Nafion修飾液用量的不斷增加，陽極峰電流明顯增大，當修飾液體積為6 μL時，陽極峰電流達最大，隨后隨著修飾液用量的不斷增加，陽極峰電流有所降低。故隨后所有實驗都選用6 μL修飾液進行修飾。

2.2.3還原圈數的影響眾所周知，在較負的起始電位下，氧化石墨烯或石墨烯上未被還原的含氧官能團易被活化甚至還原，且隨著掃描圈數的增加，還原程度越徹底。為此我們考察了電化學還原圈數的影響，結果顯示：在HAc-NaAc緩沖溶液(pH=5.0)中，當掃描圈數為5圈時，氧化還原峰電流均達到最大，繼續(xù)增加掃描圈數，峰電流反而有所減小。根據文獻，氧化石墨烯上的羰基很容易被還原，然而羥基及環(huán)氧基則相對較為穩(wěn)定，只有在更負的電位下(-1.5 V)才能被徹底還原[11]。因此在-1.0～1.0 V掃描范圍內，氧化石墨烯的還原并不是很徹底，殘留的羥基及環(huán)氧基很容易與核黃素分子中的多個羥基形成氫鍵，使核黃素更容易到達電極表面，顯示增強的電化學信號。

2.2.4pH的影響圖3顯示了核黃素在不同pH值的HAc-NaAc緩沖溶液中，陽極峰電流值與pH的關系曲線。由圖可知，隨著pH值的增大，陽極峰電流逐漸增強，在pH=5.0時達最大，隨后pH值繼續(xù)增大，峰電流反而減小，故隨后的實驗均以pH=5.0的0.2 mol·L-1HAc-NaAc緩沖溶液作為底液。

2.2.5初始電位的影響圖4顯示了在不同電位范圍內掃描的循環(huán)伏安曲線。結果顯示：隨著初始電位的不斷降低，峰電流逐漸增加，同時氧化峰電位發(fā)生一定程度的正移，還原峰電位發(fā)生一定程度的負移，當掃描范圍是-1.0～0.8 V時，峰電流達最大，隨后峰電流有所降低。因此，在隨后進行的實驗中，都選-1.0～0.8 V。

2.2.6靜態(tài)時間的影響以HAc-NaAc緩沖溶液作為支持電解質，用差分脈沖伏安法(DPV)對最佳靜態(tài)時間進行了考察。結果表明，當靜態(tài)時間為180 s時，峰電流值達最大，隨后趨于穩(wěn)定，故本實驗選擇靜態(tài)時間為180 s。

2.3 線性范圍及電極性能

圖5顯示了不同濃度的核黃素在最佳條件下的DPV曲線，可以看出核黃素的陽極峰電流與其濃度在一定范圍成正比關系，實驗結果表明：線性范圍為：7.5×10-8～1.0×10-5mol·L-1，其線性方程為：ip=7.2126c+1.7037×10-5(r=0.9947)。檢出限(S/N=3)可達2.5×10-8mol·L-1。

平行制作5支修飾電極，對1.0×10-5mol·L-1的核黃素溶液進行平行測定，峰電流相對標準偏差(RSD，n=5)為4.7%。此外，ECGO/Nafion修飾電極在干燥環(huán)境中放置3 d，修飾電極的催化性能仍為原來的96.3%。這些結果表明：ECGO/Nafion修飾電極具有良好的重現性和穩(wěn)定性。

2.4 干擾研究

實驗考察了常見的幾種干擾物質對核黃素測定的干擾，結果顯示：50倍的維生素B1、維生素B6、煙酸、煙酰胺、尿酸、維生素C、色氨酸、多巴胺對核黃素的檢測幾乎不干擾。而人體常見的金屬離子如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe3+對核黃素的檢測基本沒有影響。

2.5 實際樣品分析

取市售維生素B2片(海南制藥廠有限公司)進行實際樣品含量測定。樣品預處理過程如下：取20片藥片，稱重，研磨成粉末，備用。準確稱取一片劑量的粉末，用二次蒸餾水超聲溶解，定容至50 mL，靜置1 d后備用。取400 μL黃色上層液，用11.6 mL HAc-NaAc(0.2 mol/L，pH=5.0) 緩沖溶液稀釋，在最佳實驗條件下進行測定，計算核黃素含量，同時與藥典所描述的紫外-可見方法進行對比，具體結果見表1。結果顯示，該測定方法所得結果與藥典法檢測結果很接近，表明該方法是精確可行的，可以用于實際樣品中核黃素含量的測定。

表1 實際藥片中核黃素含量的測定(n=3)

3 結論

本文利用電化學還原石墨烯/Nafion修飾電極研究了核黃素的電化學行為，發(fā)展了一種檢測核黃素的電化學傳感器。該傳感器具有較高的靈敏度，檢測限可達2.5×10-8mol·L-1，在實際樣品分析中，與藥典法所得檢測結果很接近，可用于實際樣品中核黃素含量的測定。