粟有志， 馬曉雯， 孟 茹*， 李 芳， 李艷美， 雷紅琴

(1.伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆伊寧 835000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

黃色合成色素多數(shù)屬于偶氮類染料，主要用于紡織、制鞋、造紙等工業(yè)領(lǐng)域，具有致畸、致癌性、致突變等毒性作用。檸檬黃、日落黃、喹啉黃等屬于食品添加劑，可在特定食品中添加，但大部分黃色合成色素不允許用于食品。酵母抽提物是一種以酵母為原料經(jīng)自溶、精制等工藝而制得的營養(yǎng)豐富的天然調(diào)味料，在調(diào)味品、方便面等食品行業(yè)中具有廣泛的用途[1]。為防止以非法添加黃色合成色素的方式偽造或以次充好酵母抽提物，建立酵母抽提物中黃色合成色素的檢測方法十分必要。

目前，國內(nèi)外對黃色合成色素的檢測主要有酶聯(lián)免疫法[2]、分光光度法[3]、毛細(xì)管電泳法[4]、液相色譜法[5 - 8]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9 - 12]，常見于豆制品、飲料、化妝品等樣品，而酵母抽提物中黃色合成色素的檢測方法未見報道。目前，文獻(xiàn)報道黃色色素的前處理方法主要為固相萃取法，而本文采用簡便、快捷的QuEChERS方法[13]前處理樣品，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)分析，建立了酵母抽提物中9種黃色合成色素的測定方法。該方法與文獻(xiàn)報道方法相比，簡化了前處理步驟，其靈敏度和檢出限能夠滿足合成色素的殘留限量要求及檢測確證要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260-6460A液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)，配有電噴霧離子源(ESI)；Sigma3-18K型臺式冷凍離心機(jī)(德國，Sigma公司)；T18基本型均質(zhì)器和MS3型渦旋振蕩器(德國，IKA)；N-EVAP-112型水浴氮吹儀(美國，Organomation公司)；Strata-X-AW固相萃取小柱(60 mg/3mL，美國Phenomenex公司)；Oasis WAX固相萃取小柱(規(guī)格均為60 mg/3mL，美國Waters公司)。

日落黃、酸性橙Ⅱ、橙黃G、酸性黃11、酸性黃36均購自Dr.Ehrenstorfer公司；酸性黃151購自Sigma公司；酸性橙56、酸性黃73、酸性黃79購自TCI公司，所有標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品1 g(精確至0.01 mg)，用水溶解并定容至1 L，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃冰箱中儲存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液：用水稀釋配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各色素的最終濃度為：酸性黃151為1.0 mg/L，酸性黃36、酸性黃73、酸性橙Ⅱ為1.5 mg/L，酸性黃79、酸性橙56為15 mg/L，橙黃G為25.0 mg/L，日落黃為50 mg/L，酸性黃11為150 mg/L。乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、甲酸、正己烷均為色譜純；N-丙基乙二胺(PSA)。C18粉、磺酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)、酸性氧化鋁(ALA)、氨基(NH2)、石墨化炭黑(GCB)7種吸附劑，均購自Agela公司。實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 樣品前處理

稱取1 g樣品(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管，加入10 mL乙腈-甲醇(5∶5，V/V)，10 000 r/min均質(zhì)1 min，超聲30 min，10 000 r/min離心5 min，取上層清液7 mL于15 mL具塞離心管，加入乙腈飽和的正己烷5 mL渦旋30 s，靜置5 min，棄去正己烷層。加入吸附劑C18和PEP粉各0.1 g，搖勻，10 000 r/min離心5 min，取上清液5 mL于10 mL試管中，40 ℃水浴氮吹至干，用1 mL乙腈-水(1∶9,V/V)復(fù)溶。將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，15 000 r/min離心10 min，上清液供HPLC-MS/MS測定。

1.3 HPLC-MS/MS條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18柱(100×3.0 mm,1.8 μm)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10.0 μL；流動相：A相為乙腈，B相為10 mmol/L NH4Ac溶液，流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序如下：0～3.5 min，10%～50%A；3.5～8.5 min，50%～70%A；8.5～9.0 min，70%～90%A；9.0～10.5 min，90%A；10.51～14.5 min，10%A。電離模式：電噴霧負(fù)離子源模式(ESI-)；多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：9.0 L/min；鞘氣溫度：300 ℃；鞘氣流速：11.0 L/min，毛細(xì)管電壓:3.5 kV；監(jiān)測離子對、碰撞能量、碎裂電壓等參數(shù)見表1。

表1 9種黃色合成色素的質(zhì)譜分析參數(shù)

*quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

本文所檢測的9種黃色合成色素均為含有磺酸基的酸性化合物。在不接色譜柱的條件下對9種色素單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定準(zhǔn)分子離子峰。利用Optimizer軟件對9種色素的子離子、碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的儀器條件。參照歐盟指令657/2002/EEC決議中有關(guān)規(guī)定，本文選擇離子豐度最高、本底干擾最小的兩個離子對作為定性離子對，其中信號較大的離子對作為定量離子。通過比較不同無機(jī)相與有機(jī)相的組合比較分析發(fā)現(xiàn)，以乙腈-10 mmol/L NH4Ac溶液為流動相時，9種色素的離子化效益較好。通過優(yōu)化的1.3中的梯度洗脫程序，9種目標(biāo)色素均可獲得較好的分離度和響應(yīng)信號。

2.2 提取溶劑的選擇

9種黃色合成色素極性均較強(qiáng)，易溶于水。實驗比較了極性溶劑丙酮、水、乙醇、乙腈、甲醇、乙腈-甲醇(5∶5,V/V)、丙酮-甲醇(5∶5,V/V)對9種色素的提取效果。結(jié)果表明：水和甲醇提取時，酵母抽提物完全溶于提取劑，樣品易形成糊狀，給后續(xù)凈化帶來困難；乙腈、丙酮、乙醇、丙酮-甲醇(5∶5,V/V)提取時，部分色素的回收率達(dá)不到檢測要求；乙腈-甲醇(5∶5,V/V)提取時，9種色素提取的回收率為84%～101%，可滿足分析的要求。不同提取溶劑對酵母抽提物樣品中9種色素的提取效果見圖1。

2.3 凈化條件的選擇

本文比較了PSA、C18、PCX、PEP、NH2、ALA、GCB 7種吸附劑對樣品的凈化效果。結(jié)果表明：PCX、PSA、GCB、NH2、ALA凈化，部分色素的回收率達(dá)不到檢測要求，而采用C18和PEP，9種色素的回收率均可滿足檢測要求。7種吸附劑對9種合成色素的凈化效果見圖2。

同時本文還考察了Oasis WAX和Strata-X-AW兩款陰離子固相萃取小柱對9種色素的凈化效果。結(jié)果表明，兩款固相萃取小柱的回收率均可滿足檢測要求，但凈化后的9種色素的基質(zhì)效應(yīng)與C18和PEP共同凈化時無明顯差別。故本文最終選擇C18和PEP兩種吸附劑共同凈化樣品?？瞻捉湍赋樘嵛飿悠泛吞砑?種黃色合成色素的空白樣品，經(jīng)提取和凈化后的MRM色譜圖見圖3。

2.4 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限

實驗發(fā)現(xiàn)，樣品基質(zhì)對9種黃色合成色素均有一定的抑制作用，本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線以消除樣品基質(zhì)效應(yīng)。準(zhǔn)確稱取1 g樣品(精確到0.01 g)按照1.2和1.3前處理及儀器分析，當(dāng)各色素定性定量離子信噪比均小于3時，樣品確定為空白基質(zhì)；空白基質(zhì)按照1.2前處理，最后分別用1、1/2、1/5、1/10、1/20、1/50倍的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL溶解殘渣，配成基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。以峰面積(y)對合成色素的質(zhì)量濃度(x)作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，9種色素在酵母抽提物基質(zhì)中的相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.994。方法的檢出限(S/N>3)為0.01～0.09 mg/kg，定量限(S/N>10)為0.02～3.00 mg/kg。9種黃色合成色素的線性方程、檢出限和定量限詳見表2。

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

選擇酵母抽提物空白樣品，以1、2、10 倍LOQ為加標(biāo)水平進(jìn)行回收率實驗。按照1.2方法和1.3條件進(jìn)行前處理和測定，每個水平重復(fù)6次。回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。從表3可以看出，9種合成色素的回收率在75.5%～115.1%范圍，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.7%～17.6%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度均較好。

表2 9種黃色合成色素的線性方程、檢出限和定量限

表3 9種黃色合成色素的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.6 樣品測定

利用本方法對實驗室送檢的20種酵母抽提物進(jìn)行檢測，均未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)分析物。

3 結(jié)論

本文建立了以甲醇-乙腈(5∶5,V/V)為提取劑，經(jīng)PEP和C18凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定酵母抽提物中日落黃、橙黃G、酸性黃73、酸性橙Ⅱ、酸性橙56、酸性黃11、酸性黃36、酸性黃79和酸性黃151共計9種黃色合成色素的檢測方法。該方法操作簡便、精密度好、回收率高，可為酵母抽提物中此類物質(zhì)的風(fēng)險監(jiān)控提供技術(shù)支持。