莊 倩， 曲寶涵， 李 彥， 吳 燕， 穆阿麗， 李 輝

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島 266109；2.青島市飼料獸藥檢測站，山東青島 266071)

霉菌毒素是真菌在谷物或飼料上生長繁殖過程中產(chǎn)生的有毒二次代謝產(chǎn)物，其種類繁多，在收獲、存儲或加工過程中只要條件適宜都有可能產(chǎn)生。霉菌毒素的物理性質(zhì)非常穩(wěn)定，它可長時(shí)間留存在飼料、糧食等作物中，動物攝入含有霉菌毒素的飼料后可使其組織器官受損，甚至誘發(fā)癌變，而受其污染的食物也嚴(yán)重影響著人體健康乃至危及生命[1，2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上大約有25%的谷物遭受各種霉菌污染，而且隨著全球飼料谷物貿(mào)易的增加，動物飼料中不同產(chǎn)地谷物混合的機(jī)會增加，進(jìn)而導(dǎo)致飼料中同時(shí)含有多種霉菌毒素的幾率大大提高。因此，研究霉菌毒素的檢測方法日益受到人們的重視。近年來，霉菌毒素檢測有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、高效液相法和液質(zhì)聯(lián)用法等方法[3 - 6]。傳統(tǒng)的薄層色譜法檢測種類單一而且前處理步驟繁瑣，酶聯(lián)免疫法雖簡便快速但是易受雜質(zhì)干擾影響定量結(jié)果。

高效液相色譜法和液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是目前常用的霉菌毒素的分析檢測方法，其中液-質(zhì)聯(lián)用法具有選擇性高、靈敏度好、可同時(shí)完成多組分檢測的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)建立了一種對飼料中9種霉菌毒素及其代謝物同時(shí)檢測的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)方法，為霉菌毒素檢測提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1200 Series液相色譜儀，6410 Triple Quad LC/MS串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)；Agilent C18柱(150×2.1 mm,3.5 μm)；Techcomp CT15RT型臺式高速冷凍離心機(jī)；IKAMS 3 Basic微型振蕩器；HY-6雙層調(diào)速振蕩器；KQ-250B超聲波清洗器；Organomation Associates 5085型氮吹儀。

甲醇、乙腈、正己烷(色譜純，美國Sigma-Alorich公司)；乙酸銨(色譜純，英國Alfa Aesar公司)；甲酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；NaCl(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2均購自Supelco公司。T-2毒素、HT-2毒素、玉米赤霉烯酮均購自Pribolab公司，β-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉醇購自Sigma公司。標(biāo)準(zhǔn)品儲備液：黃曲霉毒素B1、B2為液體標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為3 μg/mL。黃曲霉毒素G1、G2、T-2毒素、HT-2毒素、玉米赤霉烯酮、β-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉醇為固體標(biāo)準(zhǔn)品，將其分別用乙腈溶解定容，濃度為10 mg/L,于-20 ℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品中間液：分別移取黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、T-2毒素、HT-2毒素、玉米赤霉烯酮、β-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉醇適量，用甲醇稀釋，配成1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品中間液，備用。

1.2 樣品前處理

稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入1 g NaCl和25 mL乙腈-水(85∶15)，振蕩20 min后渦旋混勻30 s，在10 000 r/min下離心5 min。移取5 mL上清液以穩(wěn)定流速過TC-M160多功能凈化柱(時(shí)間不少于60 s)，抽干，流出液收集于刻度試管中，于60 ℃下氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)? mL乙腈-水(1∶1)，渦混30 s溶解，過0.22 μm濾膜后，上機(jī)待測。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：Agilen C18柱(150×2.1 mm,3.5 μm);流動相：A：水(0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨)，B：甲醇(0.1%甲酸)；梯度洗脫程序?yàn)?0～0.5 min，10%B；0.5～3.0 min，10%～40%B；3.0～6.0 min，40%～45%B；6.0～12.0 min，45%～95%B；12.0～14.0 min，95%B；14.0～14.1 min，95%～10%B；14.1～20.0 min，10%B。柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：離子源：ESI；掃描方式：采用正負(fù)離子同時(shí)掃描，黃曲霉毒素類、T-2毒素和HT-2毒素為正離子監(jiān)測模式，玉米赤霉烯酮及其代謝物為負(fù)離子監(jiān)測模式；霧化氣：氮?dú)?；離子噴霧電壓：3 500 V(+)/3 500 V(-)；霧化氣溫度及流量：350 ℃、9 L/min；噴霧器壓力：35 psi；鞘流氣溫度及流量：350 ℃、11 L/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑及溶劑比例的選擇

圖1 三種提取溶劑對待測物的提取率(添加20 μg/kg)Fig.1 Extraction efficiency of the analytes in three extraction solvents(add 20 μg/kg)

現(xiàn)行我國國家標(biāo)準(zhǔn)[7，8]均采用高效液相色譜法對單一種類的霉菌毒素進(jìn)行檢測，前處理用乙腈-水進(jìn)行提取。有一些研究者曾對不同溶劑提取進(jìn)行比較[9 - 12]。本實(shí)驗(yàn)分別采用乙腈-水、甲醇-水和丙酮-水作為提取溶劑對樣品進(jìn)行提取。由圖1可知，乙腈-水的提取率最高，因此采用乙腈-水作為提取溶劑。

分別用體積比95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30的乙腈-水溶液進(jìn)行提取，結(jié)果表明水的比例過大可能導(dǎo)致水溶性雜質(zhì)增多且氮吹時(shí)間過長，而乙腈比例過大則會影響部分目標(biāo)物的提取效果，當(dāng)乙腈-水為85∶15時(shí)對各組分的提取效果最好。

2.2 凈化柱的選擇

黃曲霉毒素類、玉米赤霉烯酮及其代謝物、T-2毒素和HT-2毒素的性質(zhì)結(jié)構(gòu)差異大，但極性較弱，因此本實(shí)驗(yàn)選取了Pribolab的PriboFast?M226多功能凈化柱、Waters的Oasis HLB固相萃取小柱和R-Biopharm的TC-M160多功能凈化柱進(jìn)行比較。結(jié)果表明，HLB柱的凈化效果不是很理想，凈化時(shí)吸附在柱上的部分非極性雜質(zhì)也會被洗脫下來，影響測定結(jié)果。多功能凈化柱的凈化原理是采取多重復(fù)合填料吸附脂肪、蛋白質(zhì)、色素及碳水化合物等干擾物質(zhì)，可同時(shí)凈化多種目標(biāo)組分，經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出經(jīng)M226柱凈化后HT-2毒素、β-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉醇的回收率較低，而TC-M160柱則均能使9種目標(biāo)化合物得到良好的凈化，因此采用TC-M160柱作為凈化柱進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 流動相的選擇

大多數(shù)霉菌毒素易溶于甲醇或乙腈，所以本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇和乙腈作為流動相進(jìn)行比較，為了利于正負(fù)離子模式下各組分的離子化，在流動相中加入0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨。結(jié)果表明，反相色譜中乙腈極性小更易洗脫固定相上吸附的化合物，但是在正負(fù)離子同時(shí)掃描的模式下，出峰過快使得保留時(shí)間相近的組分不易分開，而且采用乙腈作為流動相時(shí)離子化程度比甲醇低，使其離子豐度下降，靈敏度也降低(圖2)，因此本實(shí)驗(yàn)采用甲醇作為流動相。進(jìn)一步優(yōu)化流動相的比例及梯度洗脫條件后，9種待測組分的色譜分離效果良好，而且分析時(shí)間在20 min以內(nèi)(圖3)，可滿足快速檢測的目的。

圖2 不同流動相下待測物的信噪比(S/N)(添加10 μg/kg)Fig.2 Signal to noise ratio(S/N) by using different mobile phases(add 10 μg/kg)

圖3 霉菌毒素及其代謝物的總離子流(TIC)色譜圖Fig.3 TIC chromatograms of mycotoxins and metabolins1.Aflatoxin G2;2.Aflatoxin G1;3.Aflatoxin B2;4.Aflatoxin B1;5,6.HT-2 toxin,β -Zearalanol;7.β -Zearalenol;8.T-2 toxin;9.Zearalenone.

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

黃曲霉毒素類、T-2毒素及HT-2毒素這幾種目標(biāo)化合物在正離子掃描過程中形成加氫準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)而在碰撞時(shí)碎裂生成子離子；而玉米赤霉烯酮類由于結(jié)構(gòu)中的羥基會使其在質(zhì)譜檢測時(shí)容易失去質(zhì)子，產(chǎn)生[M-H]-的分子離子，因此本實(shí)驗(yàn)采用正負(fù)離子同時(shí)掃描的多反應(yīng)檢測模式進(jìn)行檢測。質(zhì)譜檢測時(shí)，通過碎裂電壓(Fragmentor)來控制碰撞誘導(dǎo)解離(CID)，碎裂電壓過低會影響母離子傳輸效率，過高則使母離子在傳輸時(shí)發(fā)生解離降低其靈敏度。另一參數(shù)碰撞能量(CE)則影響碎片離子峰，過低時(shí)離子難以分解；過高又會使離子碎裂過多，干擾檢測。因此，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)全掃描確定母離子的質(zhì)荷比，在單離子檢測模式下優(yōu)化碎裂電壓，確保母離子盡可能多的到達(dá)碰撞池，再由子離子掃描確定最豐富及最穩(wěn)定的子離子，最終在多離子檢測(MRM)模式下找到最大響應(yīng)值時(shí)的碰撞能量。優(yōu)化的各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)見表3。9種霉菌毒素及其代謝物均能得到較好的分離，其結(jié)果符合歐盟2002/657/EC號決議《質(zhì)譜分析方法鑒定點(diǎn)數(shù)》[13]中對待測物定性及定量的要求。

表3 9種霉菌毒素及其代謝物的質(zhì)譜優(yōu)化條件

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

飼料中的基質(zhì)成分復(fù)雜，會對霉菌毒素的分析過程有顯著干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此本研究在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)配制與檢測樣品相同基質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，其濃度為2、5、10、20、50、100 μg/L。然后以9種霉菌毒素定量離子的峰面積(y)對濃度(x，μg/L)梯度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明被測霉菌毒素及其代謝物在2.0～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按照1.2節(jié)的方法對樣品處理后上機(jī)檢測，以3倍信噪比(S/N=3)為檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N=10)為定量限(LOQ)的結(jié)果見表4。

表4 霉菌毒素及其代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限(n=6)

2.6 方法回收率和精密度

飼料的種類多種多樣，其中的成分也有所不同，因此本實(shí)驗(yàn)分別對飼喂時(shí)常用的玉米粉、豬用配合飼料和肉雞肉鴨自配料添加了5、20、50 μg/L 3個(gè)濃度水平混標(biāo)溶液做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，根據(jù)相應(yīng)基質(zhì)外標(biāo)曲線定量，再就其精密度(RSD)進(jìn)行考察。通過表5的計(jì)算結(jié)果可知，其回收率在67.5%～103.5%之間，日內(nèi)和日間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于15%，表明方法精密度良好。

表5 不同種類飼料的加標(biāo)回收率及精密度(n=3)

(續(xù)表5)

CompoundAdded(μg/L)Corn mealCompound feed for pigCompound feed for chicken and duckRecovery(%)Intra-dayRSD(%)Inter-dayRSD(%)Recovery(%)Intra-dayRSD(%)Inter-dayRSD(%)Recovery(%)Intra-dayRSD(%)Inter-dayRSD(%)5074.77.73.785.07.611.277.93.94.6Zearalenone575.34.31.784.03.95.375.35.35.020101.65.52.978.72.38.078.15.94.85083.82.80.895.96.87.482.44.45.7β-Zearalenol567.53.25.370.88.010.969.35.511.42075.62.36.272.02.810.380.07.15.35078.09.32.774.87.97.879.17.18.4β-Zearalanol568.811.98.970.28.914.871.66.710.12069.27.55.867.91.410.877.95.613.95075.16.86.375.22.37.781.75.610.7

2.7 穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取空白豬用配合飼料作為基質(zhì)按1.2節(jié)方法配制10 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0、5、10、15、20、25、30 h內(nèi)分別進(jìn)樣測定，9種霉菌毒素的RSD在3.2%～8.7%之間，說明飼料基質(zhì)對標(biāo)準(zhǔn)品溶液基本沒有干擾，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性好。

再稱取空白飼料樣品5.0 g，平行取樣6份，精密加入中間濃度的9種霉菌毒素混標(biāo)溶液適量，按1.2節(jié)方法處理后進(jìn)樣分析，根據(jù)峰面積計(jì)算得出9種霉菌毒素的RSD為3.9%～10.4%，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 樣品檢測

經(jīng)本實(shí)驗(yàn)建立的方法對實(shí)驗(yàn)室存儲的83份飼料樣本進(jìn)行檢測，每份平行兩次實(shí)驗(yàn)，其中7份樣本測出含有黃曲霉毒素B1 2.6～13.8 μg/L，19份樣本中含有T-2毒素6.9～24.5 μg/L，16份樣本中含有玉米赤霉烯酮5.1～42.7 μg/L。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，采用多功能凈化柱凈化可同時(shí)凈化多種霉菌毒素，前處理步驟簡便快速，再結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用法采用正負(fù)離子同時(shí)掃描，縮短了分析檢測時(shí)間，而且方法穩(wěn)定性好，回收率高。該法還可應(yīng)用于豆粕、濃縮料、魚粉等多種飼料，其檢出限滿足國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)的限量要求，為霉菌毒素的檢測分析提供了技術(shù)支持。