常 昂， 吳尚榮， 柳 影， 張 鑫， 魏涌標(biāo)， 李松青， 劉祥軍*， 上官棣華

(1.湘潭大學(xué)化學(xué)學(xué)院,湖南湘潭 411100;2.北京分子科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所活體分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190)

熒光傳感具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)時(shí)間短、測(cè)定過(guò)程中所需試樣用量少等優(yōu)點(diǎn)，目前在金屬離子快速檢測(cè)領(lǐng)域得到越來(lái)越多的關(guān)注[1,2]。Cu2+是一種在生物和生態(tài)體系中繼Fe3+和Zn2+后的第三豐富的元素[3,4]，是人體必需的微量元素，存在于血漿銅藍(lán)蛋白、超氧化物歧化酶、細(xì)胞色素C氧化酶，具有多種重要的生理學(xué)功能[5,6]。但是Cu2+過(guò)量攝入會(huì)破壞生物體的酶系統(tǒng)，阻礙生物體正常的生化反應(yīng)和新陳代謝，對(duì)人體具有非常大的危害[7]。Cu2+的污染主要來(lái)源于電鍍、冶金、化工等行業(yè)，而且排放到環(huán)境中的Cu2+的毒性具有持久性和生物累積性等特點(diǎn)[8]，對(duì)人類健康和環(huán)境安全都是一個(gè)極大的威脅。因此，使用高靈敏技術(shù)對(duì)Cu2+進(jìn)行定量和快速檢測(cè)顯得尤為重要。

新銅試劑2，9-二甲基-鄰菲羅啉(NCP)是目前常用的對(duì)Cu2+有選擇性響應(yīng)的顯色劑[9,10]，但紫外-可見吸收光譜法與熒光法相比，其靈敏度較低。本研究基于NCP對(duì)Cu2+的優(yōu)異識(shí)別能力，設(shè)計(jì)合成了Cu2+熒光探針2，9-二苯并噻唑-鄰菲羅啉(PDBT)，與NCP相比，其熒光量子產(chǎn)率大大提高，考察了該熒光探針對(duì)Cu2+的選擇性和靈敏度。該探針具有合成簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4600型熒光分光光度計(jì)，UH5300型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，日立公司)；Avance Ⅲ 400 HD型核磁共振譜儀，APEX Ⅱ型FT-ICR質(zhì)譜儀(美國(guó)，布魯克)。

2，9-二甲基-鄰菲羅啉(NCP)、鄰氨基苯硫酚、SeO2等均購(gòu)自百靈威試劑有限公司；Na2S2O5和實(shí)驗(yàn)室常用試劑均購(gòu)自北京化工廠。PDBT及NCP 標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別準(zhǔn)確稱取一定量的 PDBT和NCP 溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，制成濃度為1.0×10-3mol/L 的貯備液，使用時(shí)根據(jù)需要適當(dāng)稀釋。金屬離子標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取一定量的硝酸鹽溶于蒸餾水中，制成濃度為1.0×10-2mol/L的貯備液，使用時(shí)根據(jù)需要適當(dāng)稀釋。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

PDBT的合成路線如下所示：

1.2.12，9-二醛基鄰菲羅啉中間體的合成參照文獻(xiàn)方法[11]，稱量NCP 1.04 g(5 mmol)和SeO2577 mg(5.2 mmol)加入到100 mL單口瓶中，在二氧六環(huán)-水(95∶5,V/V)的混合溶劑中攪拌回流2 h后，趁熱過(guò)濾，濾液冷卻至室溫后有固體析出，過(guò)濾得到灰色固體1.1 g，得到2，9-二醛基鄰菲羅啉粗品。

1.2.2PDBT的合成稱量2，9-二醛基鄰菲羅啉236 mg(1 mmol)，鄰氨基苯硫酚250 mg(2 mmol)，Na2S2O5400 mg(2.1 mmol)加入到100 mL單口瓶中，加入50 mL乙醇，攪拌回流6 h。薄層層析檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)完全后，粗產(chǎn)品用二氧化硅層析柱純化，二氯甲烷-甲醇(10∶1，V/V)洗脫，得到灰白色固體(300 mg,67.3%)。1H NMR( CDCl3,400 MHz ),δ:8.77～8.79(d，2H),8.42～8.45(d，2H)，8.18～8.20(d，2H)，8.15～8.16(d，2H)，7.91(s，2H)，7.56～7.59(t，2H)，7.49～7.53(t,2H)。MS(ESI):m/z469.1,[M+Na]+。

2 結(jié)果與討論

2.1 PDBT在不同溶劑中的紫外-可見吸收光譜

圖1A為PDBT在乙酸乙酯、乙醇、乙腈、DMF、二氯甲烷、甲醇、四氫呋喃、水中的紫外-可見吸收光譜。從圖中可以看出，PDBT在上述各種有機(jī)溶劑中的吸收光譜大致相同，在310 nm波長(zhǎng)處有較高的吸收峰，在360、380 nm處有較低的吸收峰。但是在水中，同樣濃度的PDBT的吸光度明顯降低，并且310、360、380 nm處的吸收峰分別紅移到了320、375、395 nm，吸光度的明顯降低和吸收峰的紅移可能是由于PDBT分子在水中聚集引起的。

進(jìn)一步考察了PDBT在不同比例DMF-水中的紫外-可見吸收光譜，從圖1B中可以看到，當(dāng)水含量超過(guò)50%，吸光度明顯降低，超過(guò)70%后，吸光度急劇降低，其紫外-可見吸收光譜幾乎沒(méi)有明顯的吸收峰，說(shuō)明PDBT幾乎全部以聚集體狀態(tài)存在。

圖1 PDBT(5 μmol/L)在不同溶劑(A)和在不同比例的DMF-水(B)中的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of 5 μmol/L PDBT in different solvents(A) and in different ratio of DMF-water(B)

2.2 PDBT在不同DMF-水比例體系中的熒光光譜研究

圖2A為PDBT分子在不同比例DMF-水溶劑中的熒光強(qiáng)度?？梢钥闯?，在DMF中，PDBT具有較強(qiáng)的熒光，隨著水含量的增加，熒光小幅增加，在0.4～0.5之間，熒光幾乎沒(méi)有變化，當(dāng)超過(guò)0.5后，熒光急劇下降，當(dāng)水的比例超過(guò)70%時(shí)，幾乎沒(méi)有熒光，這可能是因?yàn)楫?dāng)水的比例超過(guò)50%后，PDBT分子開始聚集，隨著水含量的增加，其聚集會(huì)越來(lái)越嚴(yán)重，從而導(dǎo)致熒光猝滅，而當(dāng)水超過(guò)70%后，PDBT主要以聚集體存在，熒光幾乎完全猝滅，這與紫外-可見光譜研究的結(jié)果相一致(圖1B)。熒光在水含量0.4～0.5之間基本持平，出現(xiàn)最大值.所以以下的實(shí)驗(yàn)均選擇在DMF-水(1∶1，V/V)的體系中測(cè)試。與PDBT相比，NCP在DMF-水(1∶1，V/V)中幾乎沒(méi)有熒光(圖2B)，經(jīng)計(jì)算NCP的熒光量子產(chǎn)率僅為0.019(L-色氨酸為參比)，低的量子產(chǎn)率使之不宜用于熒光分析；而PDBT的熒光量子產(chǎn)率為0.135，是前者的7倍(標(biāo)準(zhǔn)物為硫酸奎寧[12])，較高的量子產(chǎn)率使之適用于熒光分析。

圖2 (A)PDBT(5 μmol/L)在不同比例DMF-水中的熒光強(qiáng)度(λex:365 nm,λem:416.6 nm);(B)5 μmol/L NCP(λex:360 nm )和PDBT(λex:365 nm) 在 DMF-水(1∶1)中的熒光光譜Fig.2 (A)Fluorescence intensity of 5 μmol/L PDBT in different ratio of DMF-Water(λex:365 nm,λem:416.6 nm);(B)Fluorescence spectra of 5 μmol/L NCP(λex:360 nm ) and PDBT(λex:365 nm) in DMF-water(1∶1)

圖3 不同金屬離子(15 μmol/L)對(duì)PDBT(5 μmol/L)熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of 15 μmol/L of different metal ions on the fluorescence intensity of 5 μmol/L PDBT

2.3 PDBT對(duì)金屬離子的選擇性考察

實(shí)驗(yàn)考察了PDBT和不同金屬離子作用的熒光光譜。從圖3可以看出，加入Al3+、Ba2+、Mn2+、Co2+、Cr3+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+的熒光強(qiáng)度和空白基本一致，再加入Cu2+都能引起熒光強(qiáng)度的大幅度降低，說(shuō)明這些離子不干擾小分子對(duì)Cu2+的特異性識(shí)別；而Cd2+、Pb2+這兩種離子能引起PDBT熒光強(qiáng)度的小幅度降低，但是再加入Cu2+后，可以發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度再次大幅度降低。結(jié)果表明，PDBT對(duì)Cu2+有良好的選擇性。

圖4 PDBT(5 μmol/L)(A)and NCP (5 μmol/L)(B)對(duì)Cu2+的熒光滴定光譜；PDBT和NCP在加入Cu2+前后的熒光強(qiáng)度比值(C)；PDBT對(duì)Cu2+的熒光滴定曲線和線性曲線(插圖)(D)Fig.4 Fluorescence spectra of 5 μmol/L PDBT (A)and NCP(B) in the presence of different concentrations of Cu2+;Fluorescent intensity ratio of PDBT and NCP before and after addition of 15 μmol/L Cu2+ (C);Fluorescence titration curve of PDBT to Cu2+ and linear curve(inset)(D) (A) and (B):concentration of Cu2+:0,0.1,0.3,0.5,0.7,1.0,2.0,3.0,5.0,7.0,10,15,20,25,30,40,50 μmol/L.

2.4 比較PDBT和NCP對(duì)Cu2+的熒光響應(yīng)

從圖2B可以看出，NCP幾乎沒(méi)有熒光，無(wú)法進(jìn)行Cu2+的熒光滴定，但為了進(jìn)行比較，我們?cè)贜CP的熒光滴定實(shí)驗(yàn)中將狹縫寬度從2.5 nm調(diào)到10 nm。從圖4A可以看到，15 μmol/L的Cu2+能將PDBT的熒光基本完全猝滅，而同濃度下的Cu2+對(duì)NCP的滴定也達(dá)到滴定終點(diǎn)(圖4B)，但是熒光強(qiáng)度只猝滅了不到三分之一。采用PDBT和NCP在加入15 μmol/L的Cu2+前后的熒光強(qiáng)度的比值作圖(圖4C)，可以更清晰的看到，PDBT在加入Cu2+前后的熒光強(qiáng)度比值為11.2，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于后者的1.4，結(jié)果表明PDBT更適于Cu2+的熒光分析。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)而考察了檢測(cè)靈敏度，PDBT對(duì)Cu2+熒光滴定的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程(見圖4D的插圖)為:F=1617-168.43c(μmol/L)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9955，線性范圍為0.1～7.0 μmol/L，計(jì)算得檢測(cè)限為0.079 μmol/L。

圖5 熒光隨PDBT和Cu2+濃度變化的工作曲線Fig.5 Jobs’ plot obtained from fluorimetric analysis of mixtures of PDBT with Cu2+ [Cu2+] + [PDBT] = 10 μmol/L.

2.5 測(cè)定結(jié)合比

采用Job’s plot方法測(cè)定PDBT與Cu2+的結(jié)合比，如圖5所示。由圖中可以看出最大熒光強(qiáng)度的差值(△F)對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)約為0.5。小于0.5時(shí)，可以看出隨著Cu2+的增多，△F越來(lái)越大，直至最大0.5處，大于0.5后，發(fā)現(xiàn)△F值隨著PDBT的減小而減小，說(shuō)明0.5比例處PDBT和Cu2+剛好完全絡(luò)合，即PDBT與Cu2+的結(jié)合比為1∶1。

2.6 樣品分析及加標(biāo)回收試驗(yàn)

取市售的娃哈哈飲用水，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其熒光強(qiáng)度，并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果如表1，回收率在95.2%～99.75%之間，良好的回收率說(shuō)明其有望適用于實(shí)際樣品中Cu2+的檢測(cè)。

表1 回收率試驗(yàn)

3 結(jié)論

基于NCP對(duì)Cu2+的良好識(shí)別能力，設(shè)計(jì)合成了熒光探針PDBT，其熒光量子產(chǎn)率為0.135，是NCP的7倍。該探針對(duì)Cu2+有良好的選擇性和較高的靈敏度，檢測(cè)限低至0.079 μmol/L，Job’s plot研究表明PDBT與Cu2+是1∶1結(jié)合。對(duì)市售飲用水進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得到了良好的回收率，說(shuō)明其有望用于實(shí)際樣品中Cu2+的檢測(cè)。