李樂賽，李梅花，張 弦，陳亦樂

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤一科，長(zhǎng)沙 410013）

HPV16 E6對(duì)宮頸癌E-cadherin表達(dá)水平和基因甲基化的影響

李樂賽，李梅花，張 弦，陳亦樂

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤一科，長(zhǎng)沙 410013）

目的：探討HPV 16 E6對(duì)宮頸癌組織和細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平及基因甲基化狀態(tài)的影響。方法：檢測(cè)20例宮頸鱗癌組織及12例正常宮頸組織中HPV16 E6、 E-cadherin蛋白表達(dá)水平及E-cadherin甲基化率。采用Siha細(xì)胞構(gòu)建HPV16 E6沉默細(xì)胞株，檢測(cè)siRNA E6對(duì)細(xì)胞E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)影響，以及E-cadherin甲基化狀態(tài)。結(jié)果：HPV16 E6蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)高于正常宮頸組織，E-cadherin蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)低于正常宮頸組織。正常宮頸組織均未擴(kuò)增出E-cadherin基因甲基化條帶；宮頸鱗癌組織中，E-cadherin基因甲基化檢出率為65.0%。篩選得到HPV16 E6穩(wěn)定下調(diào)的Siha細(xì)胞系。E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)在siRNA E6 組均顯著高于空載體組和空白對(duì)照組。E-cadherin基因甲基化擴(kuò)增條帶在siRNA E6 組呈弱陽(yáng)性，而在空載體組及空白對(duì)照組呈強(qiáng)陽(yáng)性。結(jié)論：HPV 16 E6可引起宮頸癌組織和細(xì)胞中E-cadherin基因甲基化，并可導(dǎo)致E-cadherin mRNA及蛋白的表達(dá)水平下調(diào)。

子宮頸癌；人乳頭狀瘤病毒16 E6；E-鈣黏蛋白；甲基化

宮頸癌是女性常見惡性生殖系統(tǒng)腫瘤，全世界每年約50萬新發(fā)病例［1］。高危型人乳頭瘤（human papillomavirus，HPV）病毒16型的持續(xù)感染可導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，其中，致癌基因E6是病情進(jìn)展的關(guān)鍵因素［2］。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是鱗狀上皮細(xì)胞所表達(dá)的鈣依賴性黏附分子。E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)甲基化與E-cadherin的表達(dá)下調(diào)或缺失相關(guān)［3］，而E-cadherin的表達(dá)下調(diào)或缺失又與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)［4］。雖然有研究涉及E-cadherin與宮頸癌發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，但缺乏HPV 16 E6對(duì)宮頸癌E-cadherin基因甲基化影響的研究，本研究旨在探索HPV 16 E6對(duì)宮頸癌組織和細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平及基因甲基化狀態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本與細(xì)胞處理 宮頸組織標(biāo)本選取2012年1月～2013年6月間湖南省腫瘤醫(yī)院收治的HPV16陽(yáng)性宮頸鱗癌患者20例，同期因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)且宮頸正常的宮頸組織12例作為對(duì)照組，所有標(biāo)本術(shù)前均未予以任何抗腫瘤治療。標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

宮頸鱗癌Siha細(xì)胞系由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。用含10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司），37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物公司，siRNA靶點(diǎn)序列選自GenBank（NC-001526），設(shè)計(jì)靶點(diǎn)為：5'-GTTATGCA CAGAGCTGCAA-3'。細(xì)胞分組為：siRNA E6組，空載體組及空白對(duì)照組。

1.2 試劑 兔抗人HPV16E6一抗購(gòu)自BIOSS（bs-1719R），E-cadherin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，β-actin抗體購(gòu)自長(zhǎng)沙艾佳生物公司，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自長(zhǎng)沙艾佳生物公司，甲基化PCR引物由上海生工生物公司合成。

1.3 Western Blot 組織及細(xì)胞分別提取總蛋白，計(jì)算樣品濃度。取30ug蛋白在10%SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜1h30min，5%脫脂牛奶室溫封閉2h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育1h，TBST洗膜5次，ECL法（BioInd公司）處理后顯影觀察條帶，GIS軟件進(jìn)行光密度值結(jié)果分析。以Beta-actin作為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.4 甲基化特異PCR（methylation-specific PCR， MSP） 分別提取組織及細(xì)胞中DNA后，根據(jù)EZ DNA Methylation-Gold Kit試劑盒（ZYMO公司）說明，置于PCR儀（GeneAmp PCR System 9700）中反應(yīng)進(jìn)行DNA重亞硫酸鹽修飾及純化，所得產(chǎn)物隨即進(jìn)行甲基化PCR擴(kuò)增。甲基化特異性上游引物為5’-ATTTTAGGTTAG AGGGTTATCGC-3’，下游引物為5’-ACAAATACTTTA CAATTCCGACG-3’，擴(kuò)增片段為172bp。非甲基化上游引物為5’-TCACAAATACTTTACAATTCCAACA-3’，下游引物為5’-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT-3’，擴(kuò)增片段為172bp，反應(yīng)體系預(yù)變性95°C 10min，變性94°C 30s，退火51°C 30s，延伸72°C 60s，經(jīng)延伸72°C 5min，共35個(gè)循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用SPSS 16.0系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，P值＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 組織標(biāo)本中HPV16E6、E-cadherin蛋白表達(dá)及E-cadherin基因甲基化 HPV16 E6蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)高于正常宮頸組織（P＜0.05）（圖1 A）。E-cadherin蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)低于正常宮頸組織（P＜0.05）（圖1 B）。12例正常宮頸組織均未擴(kuò)增出E-cadherin基因甲基化條帶；在20例宮頸鱗癌組織中，有13例檢測(cè)到E-cadherin基因異常甲基化，檢出率為65.0%（圖1 C）。

圖1 組織標(biāo)本中HPV16E6、E-cadherin蛋白表達(dá)及E-cadherin甲基化

2.2 HPV16 E6沉默穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選和鑒定 篩選得到HPV16 E6穩(wěn)定下調(diào)的Siha細(xì)胞系（圖2 A），HPV16 E6 mRNA相對(duì)表達(dá)量siRNA E6組相較空載體組及空白對(duì)照組明顯降低（P＜0.05）（圖2 B），抑制率約為75%。

圖2 HPV16 E6沉默穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選和鑒定

2.3 siRNA HPV16E6對(duì)Siha細(xì)胞E-cadherin 表達(dá)及基因甲基化的影響 E-cadherin mRNA表達(dá)在siRNA E6 組顯著高于空載體組和空白對(duì)照組（P＜0.05），空載體組和空白對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05）（圖3 A）。E-cadherin 蛋白表達(dá)水平在siRNA E6 組顯著高于空載體組和空白對(duì)照組（P＜0.05），空載體組和空白對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05）（圖3 B）。E-cadherin基因甲基化擴(kuò)增條帶在siRNA E6 組呈弱陽(yáng)性，而在空載體組及空白對(duì)照組呈強(qiáng)陽(yáng)性，即表明siRNA E6可導(dǎo)致Siha細(xì)胞中E-cadherin基因的甲基化（圖3 C）。

3 討論

大量的流行病學(xué)和分子病理學(xué)證據(jù)表明，宮頸癌患者HPV感染的亞型以HPV16型最為多見，約65.2%［5］。E6是高危型HPV病毒的重要編碼蛋白之一，E6的持續(xù)表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞惡變［6］。本研究顯示，宮頸癌 HPV16 E6蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)高于正常宮頸組織，符合上述觀點(diǎn)。E-cadherin是一種與癌細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和分化密切相關(guān)的細(xì)胞黏附分子，E-cadherin表達(dá)下調(diào)將使惡性腫瘤細(xì)胞極性喪失，呈現(xiàn)惡性細(xì)胞形態(tài)并具備侵襲性生長(zhǎng)特征。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤中均存在E-cadherin的表達(dá)降低或缺失，如胃癌、乳腺癌等［7］，啟動(dòng)子5'端CpG島甲基化是引起E-cadherin基因失活的重要途徑［8］。我們的數(shù)據(jù)顯示E-cadherin蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)低于正常宮頸組織，提示E-cadherin蛋白的低表達(dá)可能與宮頸癌的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)。在正常宮頸組織標(biāo)本中均未擴(kuò)增出E-cadherin基因甲基化條帶；在20例宮頸鱗癌組織中，有13例檢測(cè)到E-cadherin基因異常甲基化，檢出率為65.0%。提示，在宮頸癌組織中，HPV16 E6高表達(dá)與E-cadherin蛋白的表達(dá)下降有關(guān)，而E-cadherin蛋白的表達(dá)下降可能與E-cadherin基因異常甲基化相關(guān)。

為探索HPV16 E6對(duì)宮頸癌細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)及甲基化水平的影響，選擇Siha細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該細(xì)胞是HPV16陽(yáng)性表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞。篩選得到HPV16 E6穩(wěn)定下調(diào)的Siha細(xì)胞系，經(jīng)驗(yàn)證HPV16 E6 mRNA抑制率約為75%。

圖3 siRNA HPV16E6對(duì)Siha細(xì)胞E-cadherin 表達(dá)及基因甲基化的影響

在Siha細(xì)胞中沉默HPV16 E6后，E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，提示HPV16 E6可以下調(diào)宮頸癌Siha細(xì)胞內(nèi)E-cadherin mRNA及蛋白的表達(dá)。沉默HPV16 E6導(dǎo)致E-cadherin基因甲基化擴(kuò)增條帶呈弱陽(yáng)性，而E-cadherin基因甲基化擴(kuò)增條帶在空載體組及空白對(duì)照組呈強(qiáng)陽(yáng)性，表明HPV16 E6可導(dǎo)致Siha細(xì)胞中E-cadherin基因的甲基化，并降低宮頸癌細(xì)胞中E-cadherin mRNA及蛋白的表達(dá)水平。國(guó)外有研究表明，在Siha細(xì)胞中沉默E6可導(dǎo)致DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）蛋白表達(dá)水平下降60%［9］。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是表觀遺傳學(xué)中催化并維持 DNA甲基化的重要酶家族。DNMT1是DNA進(jìn)行復(fù)制修復(fù)并維持其正常甲基化的關(guān)鍵酶，與 DNA異常甲基化有關(guān)，并且二者與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也有密切關(guān)系。我們的研究與之相符，推測(cè)在Siha細(xì)胞中，有可能HPV16 E6通過誘導(dǎo)DNMT1表達(dá)水平上調(diào)，導(dǎo)致E-cadherin基因發(fā)生甲基化，進(jìn)而E-cadherin mRNA及蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，細(xì)胞間的黏附減弱，極性喪失，具備侵襲性生長(zhǎng)特征。

另有研究顯示，采用5-雜氮-2'-脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-dC）處理表達(dá)HPV16 E6的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞，可導(dǎo)致E-cadherin的轉(zhuǎn)錄增加［10］。5-Aza-dC是一種甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，通過共價(jià)鍵與甲基轉(zhuǎn)移酶形成不可逆的復(fù)合物從而抑制其活性，使甲基化隨細(xì)胞分裂進(jìn)行性丟失，能部分去除腫瘤細(xì)胞的甲基化，重新激活甲基化的基因。最早用于骨髓增生異常綜合征等白血病的治療，可以誘導(dǎo)或提高多種腫瘤抑癌基因的表達(dá)［11］。推測(cè)，對(duì)于宮頸癌細(xì)胞中HPV16 E6誘導(dǎo)的E-cadherin甲基化和蛋白水平下調(diào)，5-Aza-dC可能會(huì)是種有效的干預(yù)手段。

綜上，本研究揭示：HPV 16 E6可引起宮頸癌組織和細(xì)胞中E-cadherin基因甲基化，并可導(dǎo)致E-cadherin mRNA及蛋白的表達(dá)水平下調(diào)。今后需要有進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究來證實(shí)HPV 16 E6陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞中組蛋白甲基化對(duì)E-cadherin轉(zhuǎn)錄的直接抑制作用，并通過體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尋找有效的干預(yù)手段。

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The Effect of the Humann Papillomavirus Type 16 E6 on the Expression and Methylation of E-cadherin in Cervical Cancer

Li Le-sai， Li Mei-hua， Zhang Xian， Chen Yi-lei
（Department of Gynecologic Oncology， Tumor Hospital Xiangya School of Medidine of Central South University， Changsha 410013， China）

Objective To explore the effect of papillomavirus type 16 E6 on gene expression and Methylation of E-cadherin in cervical cancer. Methods We examined protein expression of HPV 16 E6， E-cadherin and E-cadherin methylation rate in 20 cervical squamous cell carcinoma tissues and 12 normal cervical tissues. HPV16 E6 specific silenced Siha cells were constructed by virus transduction. We examined mRNA and protein expression of E-cadherin and E-cadherin methylation in Siha cells and HPV16 E6-siRNA-transfected Siha cells. Results We found that the expression of HPV16 E6 protein in cervical cancer tissues was higher than that in normal cervical tissues. The expression of E-cadherin protein in cervical cancer tissues was lower than that in normal cervical tissues. Hypermethylation of E-cadherin was not found in normal cervical tissues， while 65% in cervical cancer tissues. E6 siRNA cells showed significantly increased expression of E-cadherin mRNA and protein in comparison with the siRNA vector cells and control cells. E-cadherin gene methylation were weakly positive in E6 siRNA cells，while which were strongly positive in siRNA vector cells and control cells. Conclusion We concluded that perhaps HPV16 E6 down-regulate the expression of E-cadherin mRNA and protein and up-regulate the hypermethylation of E-cadherin in cervical cancer.

cervical cancer； HPV16 E6； E-cadherin； methylation

R711.74

A

1673-016X（2016）04-0001-04

2016-04-08

湖南省自然科學(xué)基金聯(lián)合項(xiàng)目（14JJ7090）；湖南省腫瘤醫(yī)院院內(nèi)青年基金

陳亦樂，E-mail：1658948099@qq.com