劉　旭，岳興華，鄭燕萍

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室，天津　300193）

生理及病理狀態(tài)下大鼠海馬θ節(jié)律振蕩與空間學(xué)習(xí)記憶的相關(guān)性研究

劉旭，岳興華，鄭燕萍

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室，天津300193）

［目的］探討生理及病理狀態(tài)下，麻醉大鼠感覺刺激誘導(dǎo)的海馬膽堿能θ（theta）節(jié)律振蕩與其空間學(xué)習(xí)記憶行為的相關(guān)性，分析海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩在空間學(xué)習(xí)記憶中的作用，同時(shí)為其用作評估大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的電生理指標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。［方法］使用同一批大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測試和在體海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩的自身相關(guān)比較實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)主要指標(biāo)包括：大鼠在水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期、空間探索實(shí)驗(yàn)中在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間百分比、可見平臺實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期、游泳速度以及由夾尾刺激誘導(dǎo)θ節(jié)律振蕩的功率峰值（Ppeak）及其對應(yīng)的頻率值（Fpeak）。［結(jié)果］雙側(cè)海馬注射全長的淀粉樣β蛋白（Aβ）明顯的損害了大鼠在水迷宮中的學(xué)習(xí)（P＜0.05）及記憶（P＜0.01）能力，同時(shí)壓抑了感覺刺激誘導(dǎo)的膽堿能θ節(jié)律振蕩的Ppeak（P＜0.01）。正常對照組（生理組）及Aβ海馬注射組（病理組）大鼠膽堿能θ節(jié)律振蕩的Ppeak均與定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期呈明顯負(fù)相關(guān)（正常對照組：r=-0.803，P＜0.05；Aβ海馬注射組：r=-0.764，P＜0.05），且與空間探索實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限游泳實(shí)驗(yàn)百分比呈明顯正相關(guān)（正常對照組：r=0.762，P＜0.05；Aβ海馬注射組：r=0.771，P＜0.05）。將兩組數(shù)據(jù)合并后，膽堿能θ節(jié)律振蕩Ppeak與逃避潛伏期和目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比的相關(guān)性更高，分別為：r=-0.896（P＜0.01）和r=0.888（P＜0.01）。［結(jié)論］感覺刺激誘導(dǎo)的大鼠海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩的功率值與其空間學(xué)習(xí)記憶能力存在良好的相關(guān)性，提示海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩作為一種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)同步化電活動(dòng)可能參與學(xué)習(xí)記憶行為，而其功率大小可用于間接評估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力，為中醫(yī)治療阿爾茨海默?。ˋD）的實(shí)驗(yàn)研究提供動(dòng)物模型的基礎(chǔ)。

海馬θ節(jié)律振蕩；空間學(xué)習(xí)記憶；淀粉樣β蛋白；阿爾茨海默病

近年來，隨著人口老齡化的進(jìn)程加速，老年癡呆的發(fā)病率逐年升高，已成為繼心臟病、腫瘤、中風(fēng)后的第四大死亡病因。從歷史研究看中醫(yī)對該病認(rèn)識及治療的發(fā)展脈絡(luò)清晰，中醫(yī)雖沒有關(guān)于老年癡呆病名的直接記載，但是綜合其臨床表現(xiàn)，屬于中醫(yī)癡呆、呆病、善忘等范疇。中醫(yī)認(rèn)為老年癡呆病位在腦，與腎、心、脾、肝等功能密切相關(guān)，其關(guān)鍵在于腎。多屬本虛標(biāo)實(shí)證，本虛主因在于腎精不足，髓海虧虛；標(biāo)實(shí)在于肝氣瘀滯所致痰濁與瘀血相互作用蒙蔽腦竅，令清空失靈神識迷蒙。因此在辨證施治中，主要以補(bǔ)益腎虛為主，輔以活血化瘀、同時(shí)重視疏肝解郁和化痰逐痰等。而中醫(yī)藥手段包括：針灸、電針等對阿爾茨海默病（AD）診療的實(shí)驗(yàn)研究就是中醫(yī)治療發(fā)展的前提，而實(shí)驗(yàn)研究的學(xué)習(xí)認(rèn)知記憶動(dòng)物模型的設(shè)立是之前一系列工作的基礎(chǔ)。位于顳葉的大鼠海馬體作為“空間認(rèn)知地圖”與空間記憶、情景記憶密切相關(guān)，諸如AD等具有海馬損傷的神經(jīng)病變常表現(xiàn)有空間學(xué)習(xí)記憶功能障礙。依據(jù)“淀粉樣β蛋白級聯(lián)假說”，AD患者海馬的損傷極可能是由具有神經(jīng)毒性的淀粉樣β蛋白（Aβ）在海馬中異常沉積所致［1］。大量相關(guān)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，在淀粉樣β蛋白前體蛋白（APP）轉(zhuǎn)基因小鼠模型［2］及Aβ注射的嚙齒動(dòng)物模型［3］中，均存在與AD相關(guān)表現(xiàn)，包括老年斑沉積、神經(jīng)炎性反應(yīng)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)同步化活動(dòng)異常、突觸可塑性減低及學(xué)習(xí)記憶功能減退等［4］。

海馬對空間記憶的編碼主要依賴一種頻率在3～12 Hz的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)同步化振蕩活動(dòng)，即“θ節(jié)律振蕩”。研究發(fā)現(xiàn)大鼠在不同的行為狀態(tài)下可表現(xiàn)出兩種不同頻率的θ節(jié)律振蕩—膽堿能θ節(jié)律振蕩（cholinergic theta rhythm）與非膽堿能θ節(jié)律振蕩（noncholinergic theta rhythm）。當(dāng)大鼠處于警覺性靜止?fàn)顟B(tài)、烏拉坦麻醉狀態(tài)或被動(dòng)全身旋轉(zhuǎn)狀態(tài)時(shí)，可記錄到頻率在3～7 Hz的θ節(jié)律振蕩，這種θ節(jié)律振蕩可被阿托品所壓抑，為膽堿能θ節(jié)律振蕩；當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于跑動(dòng)、行走、攀爬等主觀運(yùn)動(dòng)狀態(tài)時(shí)，可記錄到頻率在7～12 Hz的θ節(jié)律振蕩，這種θ節(jié)律振蕩不受阿托品影響，為非膽堿能θ節(jié)律振蕩［5］。另具研究表明，海馬非膽堿能θ節(jié)律振蕩通過與gamma節(jié)律振蕩（30～100 Hz）嵌套生成更為復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)同步化電活動(dòng)直接參與了空間學(xué)習(xí)記憶的編碼及突觸可塑性的調(diào)節(jié)［6］。除此之外，筆者之前的一項(xiàng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究也表明海馬損傷可導(dǎo)致膽堿能θ節(jié)律振蕩的壓抑及空間學(xué)習(xí)記憶能力的損傷，初步提示膽堿能θ節(jié)律振蕩與空間學(xué)習(xí)記憶也可能存在一定的相關(guān)性［7］。故本研究旨在通過自身相關(guān)比較實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討證明生理及病理兩種不同狀態(tài)下，大鼠海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩活動(dòng)與空間學(xué)習(xí)記憶能力的相關(guān)性，為膽堿能θ節(jié)律振蕩活動(dòng)作為評估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的電生理指標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)選擇運(yùn)動(dòng)能力及視覺正常的成年健康雄性SD大鼠（體質(zhì)量180～200 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。全長淀粉樣β蛋白（Aβ1-42）購自美國Abcam公司，使用微量二甲基亞砜（DMSO）將其充分溶解并加生理鹽水稀釋至最終濃度2.5 g/L，37℃孵育36 h，孵育期間保持間斷性振蕩，使其最終老化成寡聚體。溶劑中DMSO終濃度低于0.1%，經(jīng)證實(shí)為生理無效濃度［8］，對學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)均無影響。

1.2方法

1.2.1手術(shù)依據(jù)隨機(jī)數(shù)表將20只SD大鼠分成兩組：正常對照組（雙側(cè)海馬注射溶劑）與Aβ海馬注射組（雙側(cè)海馬注射Aβ1-42）。大鼠注射水合氯醛（0.3 g/kg，i.p）進(jìn)行麻醉后，使用雙臂數(shù)顯腦立體定位儀（RWD68004，RWD Life Science，China）加以固定，碘伏消毒備皮后切開頭部皮膚以暴露頭骨，依據(jù)大鼠腦立體圖譜確定給藥點(diǎn)并使用骨鉆鉆孔，借助微量給藥泵（KDS 310 Plus，KDS scientific，USA）將溶劑（2 μL）或藥物（Aβ1-42，2 μL）緩慢推注至大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)（前囟后3.0 mm，旁開2.2 mm，深度3.0 mm，注射速度為0.15 μL/min），注射后留針5 min以保證藥物的充分?jǐn)U散并防止虹吸。使用骨蠟封閉顱骨注射孔并進(jìn)行手術(shù)縫合。術(shù)后置于溫箱中待其蘇醒。術(shù)后恢復(fù)2周后進(jìn)行后續(xù)的行為學(xué)及電生理實(shí)驗(yàn)。

1.2.2Morris水迷宮測試Morris水迷宮測試是評估海馬結(jié)構(gòu)相關(guān)空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)［9］。宮體由一個(gè)圓形金屬水池（直徑150 cm，高50 cm）及一個(gè)圓形逃避平臺（直徑14 cm，高30 cm）構(gòu)成。宮體內(nèi)部被漆成黑色并均勻劃分為4個(gè)象限，通過簾布將宮體與外界環(huán)境隔離，并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保障行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室的安靜，以避免外界環(huán)境因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。簾布內(nèi)側(cè)貼有與4個(gè)象限相對應(yīng)的顏色形狀各異的視覺標(biāo)識。實(shí)驗(yàn)過程中宮體水溫保持在（23±2）℃。

1.2.2.1定位航行實(shí)驗(yàn)定位航行實(shí)驗(yàn)為測試的1～5 d，用以對大鼠的空間學(xué)習(xí)能力加以評估。在本實(shí)驗(yàn)階段，黑色逃避平臺藏匿于水面以下1～2 cm處，固定放置于第一象限中心。每天分4次將大鼠從各個(gè)象限的中點(diǎn)投入到宮體中，投放象限的順序由隨機(jī)數(shù)表產(chǎn)生。出于逃生的本能，大鼠會在宮體內(nèi)做逃避式游泳直至找到平臺，大鼠從入水到找到平臺的時(shí)間為逃避潛伏期。大鼠找到平臺后允許在平臺上休息15 s。如若大鼠未能在120 s內(nèi)找到平臺，需誘導(dǎo)至平臺上并停留15 s。通過行為學(xué)記錄分析系統(tǒng)（Ethovision 3.0，Noldus Information Technology，Wageningen，the Netherlands）捕捉記錄大鼠的游泳軌跡及逃避潛伏期用于分析。

1.2.2.2空間探索實(shí)驗(yàn)定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（第6天）進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，用于檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間記憶能力。在該實(shí)驗(yàn)階段，需移除逃避平臺，大鼠分4次隨機(jī)從其中一個(gè)象限的中點(diǎn)投入宮體中，自由游泳120 s，通過行為學(xué)記錄分析系統(tǒng)記錄大鼠在120 s內(nèi)的游泳軌跡及在目標(biāo)象限（第一象限）的游泳時(shí)間百分比。

1.2.2.3可見平臺實(shí)驗(yàn)空間探索實(shí)驗(yàn)4 h后，進(jìn)行可見平臺實(shí)驗(yàn)，用以排除大鼠視力及運(yùn)動(dòng)能力對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。在該實(shí)驗(yàn)階段，將白色逃避平臺放入第一象限的中心位置，并高出水面1～2 cm以使其可見。大鼠分4次隨機(jī)從其中一個(gè)象限的中點(diǎn)投入宮體中，通過行為學(xué)記錄分析系統(tǒng)記錄大鼠到達(dá)可見平臺的逃避潛伏期及游泳速度。

1.3在體海馬局部場電位膽堿能θ節(jié)律振蕩的誘導(dǎo)記錄Morris水迷宮測試后，進(jìn)行海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩的誘導(dǎo)及記錄。大鼠經(jīng)烏拉坦（1.3 g/kg，i.p）充分麻醉后固定于雙臂數(shù)顯腦立體定位儀上，體溫通過反饋調(diào)節(jié)溫控裝置（Temperature controller 69000，RWD，China）控制在（37±0.5）℃。消毒備皮并切開顱部皮膚暴露顱骨，依據(jù)大鼠腦立體定位圖譜在顱骨上鉆孔（前囟后3.4 mm，中線旁開2.5 mm），利用微推進(jìn)器（MO-10，Narishige，Japan）將環(huán)氧絕緣固化微電極（A-M systerm，5 MΩ）下至海馬CA1區(qū)（皮質(zhì)表面下2.2 mm左右）。局部場電位信號通過前置放大器放大后，經(jīng)由光纜導(dǎo)入到生物電信號處理放大工作站中（RX7 workstation，TDT，USA），實(shí)驗(yàn)中采樣頻率設(shè)置為500 Hz，濾波參數(shù)設(shè)置為帶通0.1～250 Hz，待波形穩(wěn)定后，記錄基礎(chǔ)局部場電位2 min，隨后給予固定強(qiáng)度的夾尾刺激1 min以誘導(dǎo)θ節(jié)律振蕩，記錄刺激后的局部場電位10 min，選擇夾尾后6～8 min的信號進(jìn)行分析。整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠通過注射過量烏拉坦行安樂死。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)采用定位航行實(shí)驗(yàn)5 d內(nèi)大鼠找到水下平臺的逃避潛伏期、空間探索實(shí)驗(yàn)中大鼠在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間百分比、可見平臺實(shí)驗(yàn)中大鼠找到可見平臺的逃避潛伏期及游泳速度。在體海馬局部場電位膽堿能θ節(jié)律振蕩分析其功率峰值（Ppeak）及其對應(yīng)的頻率值（Fpeak），使用Matlab 7.7進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 18.0進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，組間比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，其他數(shù)據(jù)采用正態(tài)性檢驗(yàn)和兩樣本Pearson相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1雙側(cè)海馬注射Aβ1-42損傷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力如表1所示，定位航行實(shí)驗(yàn)的2～5 d，Aβ海馬注射組大鼠找到水下逃避平臺的潛伏期明顯長于正常對照組（P＜0.05，表1）；在第6天的空間探索實(shí)驗(yàn)中，Aβ海馬注射組大鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比明顯少于正常對照組（P＜0.05，表2）；而在可見平臺實(shí)驗(yàn)中，兩組大鼠到達(dá)可見平臺的逃避潛伏期及平均游泳速度均無顯著差異（P＞0.05，表3）。

2.2雙側(cè)海馬注射Aβ1-42壓抑大鼠海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩如表4所示，對兩組大鼠θ頻率段的功率峰值（Ppeak）以及與其對應(yīng)的頻率值（Fpeak）進(jìn)行了比較。Aβ海馬注射組大鼠θ節(jié)律振蕩Ppeak明顯低于正常對照組（P＜0.001）；而兩組大鼠鼠θ節(jié)律振蕩Fpeak無顯著差異（P＞0.05）。

表1　海馬注射Aβ1-42對大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響（±s）Tab.1　Effect of intrahippocampal injection of Aβ1-42on the escape latency of rats in place navigation test（±s）

表1　海馬注射Aβ1-42對大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響（±s）Tab.1　Effect of intrahippocampal injection of Aβ1-42on the escape latency of rats in place navigation test（±s）

注：與對照組相比，aP＜0.05。

定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期（s）第1天　第2天　第3天　第4天　第5天對照組　10　81.31±8.15 44.11±3.96 32.68±2.42 28.41±2.37 27.52±1.42 Aβ注射組　10　100.5±5.15 76.45±7.04a47.78±3.71a41.52±1.80a40.99±2.01a組別　動(dòng)物數(shù)

表2　海馬注射Aβ1-42對大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)象限游泳時(shí)間百分比的影響（±s）Tab.2　Effect of intrahippocampal injection of Aβ1-42on the percentage of swimming time in the target quadrant of rats in probe trial test（±s）

表2　海馬注射Aβ1-42對大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)象限游泳時(shí)間百分比的影響（±s）Tab.2　Effect of intrahippocampal injection of Aβ1-42on the percentage of swimming time in the target quadrant of rats in probe trial test（±s）

注：與對照組相比，aP＜0.05。

組別　動(dòng)物數(shù)　空間探索實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)象限游泳時(shí)間百分比（%）對照組　10　42.42±1.54 Aβ注射組　10　28.57±2.07a

表3　海馬注射Aβ1-42對大鼠視力及運(yùn)動(dòng)能力的影響（±s）Tab.3　Effect of intrahippocampal injection of Aβ1-42on visual acuity and motor ability in rats（±s）

表3　海馬注射Aβ1-42對大鼠視力及運(yùn)動(dòng)能力的影響（±s）Tab.3　Effect of intrahippocampal injection of Aβ1-42on visual acuity and motor ability in rats（±s）

組別　動(dòng)物數(shù)　可見平臺逃避潛伏期（s）平均游泳速度（m/s）對照組　10　12.58±0.64　20.08±0.79 Aβ注射組　10　12.47±0.58　21.56±0.88

表4　海馬注射Aβ1-42對大鼠θ節(jié)律振蕩的影響（±s）Tab.4　Effect of intrahippocampal injection of Aβ1-42on θ rhythm in rats（±s）

表4　海馬注射Aβ1-42對大鼠θ節(jié)律振蕩的影響（±s）Tab.4　Effect of intrahippocampal injection of Aβ1-42on θ rhythm in rats（±s）

注：與對照組相比，aP＜0.05。

組別　動(dòng)物數(shù)　θ節(jié)律振蕩功率峰值　θ節(jié)律振蕩頻率對照組　10　29.92±1.11　3.26±0.04 Aβ注射組　10　21.97±0.67a　3.18±0.06

2.3對照組（生理組）大鼠海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩功率與逃避潛伏期及目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比的相關(guān)性分析首先，對正常對照組大鼠海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩的功率峰值Ppeak與其在定位航行實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期（第5天）進(jìn)行了相關(guān)性分析。如圖1A所示，Ppeak與大鼠逃避潛伏期存在明顯的負(fù)相關(guān)性，Pearson相關(guān)系數(shù)r=-0.803（P＜0.05）。繼而對正常對照組大鼠海馬θ節(jié)律振蕩的功率峰值Ppeak與其在空間探索實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限游泳實(shí)驗(yàn)百分比進(jìn)行了相關(guān)性分析，如圖1B所示，Ppeak與大鼠在目標(biāo)象限的游泳實(shí)驗(yàn)百分比呈明顯的正相關(guān)性，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.762（P＜0.05）。

2.4Aβ海馬注射組（病理組）大鼠海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩功率與逃避潛伏期及目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比的相關(guān)性分析與對照組相對應(yīng)，對Aβ海馬注射組大鼠海馬θ節(jié)律振蕩的功率峰值Ppeak與其在定位航行實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期（第5天）進(jìn)行的相關(guān)性分析（圖2A）顯示，Ppeak與大鼠逃避潛伏期存在明顯的負(fù)相關(guān)性，Pearson相關(guān)系數(shù)r=-0.764（P＜0.05）。對Aβ海馬注射組大鼠海馬θ節(jié)律振蕩的功率峰值Ppeak與其在空間探索實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限游泳實(shí)驗(yàn)百分比進(jìn)行的相關(guān)性分析（圖2B）顯示，Ppeak與大鼠在目標(biāo)象限的游泳實(shí)驗(yàn)百分比呈明顯的正相關(guān)性，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.771（P＜0.01）。

圖1　對照組大鼠逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比與θ節(jié)律振蕩峰值的相關(guān)性Fig.1　The correlation between the Ppeakof hippocampal cholinergic θ rhythm and escape latency and swimming time percentage in rats of control group

2.5兩組大鼠海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩功率與逃避潛伏期及目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比的相關(guān)性分析通過對合并后的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在θ節(jié)律振蕩的功率峰值Ppeak和定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期相關(guān)分析圖（圖3A）中，大鼠的Ppeak幅度與逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比存在更明顯的相關(guān)性，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.896（P＜0.01）和r=0.888（P＜0.01）。

3　討論

海馬θ節(jié)律振蕩作為海馬結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)同步化活動(dòng)，在情緒、動(dòng)機(jī)、學(xué)習(xí)記憶等多種高級認(rèn)知功能中起著決定性作用［10-11］。大量研究表明，非膽堿能θ節(jié)律振蕩在海馬位置細(xì)胞編碼空間地圖的過程中起著重要作用。位置細(xì)胞（place cells）在其位置野內(nèi)的動(dòng)作電位發(fā)放時(shí)刻相對于θ節(jié)律振蕩的相位具有進(jìn)動(dòng)特性—θ相移，θ相移可將大鼠單次經(jīng)歷的一系列位置場按順序進(jìn)行壓縮后，在每個(gè)θ周期中重復(fù)一次，這樣在這一運(yùn)動(dòng)過程中，代表每個(gè)位置場的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放便可多次重復(fù)出現(xiàn)，形成間隔約為10 ms（頻率約100 Hz）的序列，而10 ms的間隔正處于最適合增加突觸強(qiáng)度的時(shí)間尺度上，而突觸強(qiáng)度的改變正是學(xué)習(xí)記憶行為的電生理學(xué)基礎(chǔ)［12］。因此，非膽堿能θ節(jié)律振蕩能夠通過增強(qiáng)突觸強(qiáng)度從而促進(jìn)空間記憶的形成。Vincent Villette等也通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，海馬注射Aβ壓抑了非膽堿能θ節(jié)律振蕩并損傷了自發(fā)性視覺空間識別測試中的學(xué)習(xí)記憶行為［13］。相對于非膽堿能θ節(jié)律振蕩，海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩由于出現(xiàn)在動(dòng)物警覺不動(dòng)、異相睡眠［14］或是烏拉坦麻醉狀態(tài)下，而非存在于主觀性的自發(fā)性神經(jīng)活動(dòng)中，因此，對海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩與學(xué)習(xí)記憶的相關(guān)性尚缺乏足夠的研究。

圖2　Aβ海馬注射組大鼠逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比與θ節(jié)律振蕩峰值的相關(guān)性Fig.2　The correlation between the Ppeakof hippocampal cholinergic θ rhythm and escape latency and swimming time percentage in rats in the intrahippocampal injection of Aβ group

本研究通過自身相關(guān)比較實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)海馬局部注射Aβ1-42寡聚體造成大鼠Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶行為障礙和海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩功率壓抑，更重要的是我們還證實(shí)了無論是在正常大鼠還是在海馬損傷的大鼠中，其空間學(xué)習(xí)能力及記憶能力均與海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩呈良好的相關(guān)性。

圖3　兩組大鼠逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比與θ節(jié)律振蕩峰值相關(guān)性的整合分析Fig.3　The integrated analysis of correlation between the Ppeakof hippocampal cholinergic θ rhythm and escape latency and swimming time percentage in rats in two groups

膽堿能θ節(jié)律振蕩多出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物警覺不動(dòng)及異相睡眠過程中，而異相睡眠對記憶的鞏固起著重要的作用，許多AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶功能障礙可能與其異相睡眠減少［15］及θ節(jié)律振蕩減低有關(guān)［2，16］。在異相睡眠階段，包括膽堿能θ節(jié)律振蕩在內(nèi)的海馬θ節(jié)律振蕩活動(dòng)可能對新近記憶的再加工及鞏固（off-line reprocessing of recently acquired memories）起著一定的作用［17-18］。本研究提示：膽堿能θ節(jié)律振蕩功率較高的大鼠其對記憶的加工鞏固較好，故在空間學(xué)習(xí)記憶能力測試中有更為突出的表現(xiàn)；相反，海馬注射Aβ1-42導(dǎo)致海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩的壓抑，故在異相睡眠階段不能有效的鞏固行為測試中形成的空間記憶，而在后續(xù)的學(xué)習(xí)記憶能力測試中表現(xiàn)較差。

另外，本研究還為海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩活動(dòng)作為評估大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的電生理指標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。使用同一批實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在行為學(xué)測試后開展海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩的記錄一方面可以從行為學(xué)及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電生理兩個(gè)角度闡述分析問題，另一方面也大大減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用數(shù)量，更符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的原則。

當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)未能直接監(jiān)測大鼠在警覺性靜止及異相睡眠狀態(tài)下的海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩，而是在烏拉坦麻醉的狀態(tài)下借助感覺刺激誘導(dǎo)膽堿能θ節(jié)律振蕩來評估生理狀態(tài)下大鼠產(chǎn)生膽堿能θ節(jié)律振蕩，尚不屬于真正意義的行為學(xué)電生理實(shí)驗(yàn)。如果能夠監(jiān)測Morris水迷宮行為學(xué)測試及異相睡眠過程中海馬膽堿能θ節(jié)律振蕩及非膽堿能θ節(jié)律振蕩，可能能夠更加直接的闡述兩種θ節(jié)律振蕩對空間學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)的影響。行為學(xué)電生理實(shí)驗(yàn)是目前研究行為學(xué)腦機(jī)制的一個(gè)前沿的、重要的研究領(lǐng)域，也是本實(shí)驗(yàn)室正在著手準(zhǔn)備開展的研究方向?？梢钥隙ǖ恼f，借助更有力的行為學(xué)電生理手段，能夠更直觀、更全面、更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)靥骄磕X的高級神經(jīng)功能的機(jī)制及諸如AD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機(jī)制；為包括使用電針等手段通過增強(qiáng)氧自由基清除系統(tǒng)的功能，提高機(jī)體抗氧化能力實(shí)現(xiàn)對AD患者改善性治療研究（電針治療方案可能為臨床最佳治療方案）的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)篩選提供最佳行為、認(rèn)知、記憶動(dòng)物模型。

［1］Ferreira ST，Klein WL.The Abeta oligomer hypothesis for synapse failure and memory loss in Alzheimer's disease［J］.Neurobiol Learn Mem，2011，96（4）:529-543.

［2］Scott L，F(xiàn)eng J，Kiss T，et al.Age-dependent disruption in hippocampal theta oscillation in amyloid-beta overproducing transgenic mice［J］. Neurobiol Aging，2012，33（7）:1413-1423.

［3］Epelbaum S，Youssef I，Lacor PN，et al.Acute amnestic encephalopathy in amyloid-beta oligomer-injected mice is due to their widespread diffusion in vivo［J］.Neurobiol Aging，2015，36（6）:2043-2052.

［4］Mucke L，Selkoe DJ.Neurotoxicity of amyloid beta-protein:synaptic and network dysfunction［J］.Cold Spring Harb Perspect Med，2012，2（7）:a006338.

［5］ShinJ，GireeshG，KimSW，etal.PhospholipaseCbeta4 inthemedial septum controls cholinergic theta oscillations and anxiety behaviors ［J］.J Neurosci，2009，29（49）:15375-15385.

［6］Yamaguchi Y.A theory of hippocampal memory based on theta phase precession［J］.Biol Cybern，2003，89（1）:1-9.

［7］Yue XH，Liu XJ，Wu MN，et al.［Amyloid beta protein suppresses hippocampal theta rhythm and induces behavioral disinhibition and spatial memory deficit in rats］［J］.Sheng Li Xue Bao，2014，66（2）: 97-106.

［8］Leung LS，Shen B.Glutamatergic synaptic transmission participates in generating the hippocampal EEG［J］.Hippocampus，2004，14（4）:510-525.

［9］Morris R.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.J Neurosci Methods，1984，11（1）:47-60.

［10］Jutras MJ，Buffalo EA.Synchronous neural activity and memory formation［J］.Curr Opin Neurobiol，2010，20（2）:150-155.

［11］Cornwell BR，Johnson LL，Holroyd T，et al.Human hippocampal and parahippocampal theta during goal-directed spatial navigation predicts performance on a virtual Morris water maze［J］.J Neurosci，2008，28（23）:5983-5990.

［12］沈恩華，王如彬，張志康.θ相移在單次學(xué)習(xí)過程中促進(jìn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對空間位置順序記憶的研究［J］.動(dòng)力學(xué)與控制學(xué)報(bào)，2009，7（2）: 183-187.

［13］Villette V，Poindessous-Jazat F，Simon A，et al.Decreased rhythmic GABAergic septal activity and memory-associated theta oscillations after hippocampal amyloid-beta pathology in the rat［J］.J Neurosci，2010，30（33）:10991-11003.

［14］Robinson TE，Kramis RC，Vanderwolf CH.Two types of cerebral activation during active sleep:relations to behavior［J］.Brain Res，1977， 124（3）:544-549.

［15］Zhang B，Veasey SC，Wood MA，et al.Impaired rapid eye movement sleep in the Tg2576 APP murine model of Alzheimer's disease with injurytopedunculopontinecholinergicneurons［J］.AmJ Pathol，2005，167（5）:1361-1369.

［16］Rubio SE，Vega-Flores G，Martinez A，et al.Accelerated aging of the GABAergic septohippocampal pathway and decreased hippocampal rhythms in a mouse model of Alzheimer's disease［J］. FASEB J 2012，26（11）:4458-4467.

［17］Pace-Schott EF，Spencer RM.Sleep-dependent memory consolidation in healthy aging and mild cognitive impairment［J］.Curr Top Behav Neurosci，2015，25:307-330.

［18］Fogel SM，Smith CT，Beninger RJ.Evidence for 2-stage models of sleep and memory:learning-dependent changes in spindles and theta in rats［J］.Brain Res Bull，2009，79（6）:445-451.

（本文編輯：馬英，張震之）

The correlatation study between hippocampal cholinergic θ rhythm and spatial memory in rats under physiological and pathological conditions

LIU Xu，YUE Xing-hua，ZHENG Yan-ping
（Department of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investigate the correlation between hippocampal cholinergic θ rhythm and spatial learning and memory under physiological and pathological conditions，further clarify the association between the cognitive deficits and the hippocampal θ synchronization disorder.This article also wants to provide the experimental evidence evaluating the ability of spatial learning and memory in rodents by recording the hippocampal cholinergic θ rhythm.［Methods］Tail-pinch induced hippocampal cholinergic θ rhythm was recorded after Morris water maze test on the same SD rats.Main indicators including:the latencies in the hidden platform test，the percentage of swimming time in target quadrant in the probe trial test，the swimming speed and the latencies in the visible platform test，the peak power（Ppeak）and average peak frequency（Fpeak）of θ rhythm.［Results］Bilateral intrahippocampal injection of full length amyloid β peptide（Aβ1-42）significantly impaired spatial learning（P＜0.05）and memory（P＜0.05）of rats in Morris water maze test and reduced the Ppeakof hippocampal cholinergic θ rhythm（P＜0.05）.In control group，there was a significant negative correlation between the Ppeak of hippocampal cholinergic θ rhythm and the escape latency（r=-0.803，P＜0.05）and a significant positive correlation between the Ppeak of hippocampal cholinergic θ rhythm and the percentage of swimming time in target quadrant（r=0.762，P＜0.05）.Similar correlations were found with a correlation coefficient of r=-0.764（P＜0.05）and r=0.771（P＜0.05）respectively in Aβ1-42injection group.Taken these as a whole，the Ppeakof hippocampal cholinergic θ rhythm was more correlated with escape latency（r=-0.896，P＜0.01）and swimming time percentage（r=0.888，P＜0.01）.［Conclusions］There is strong correlation between the hippocampal cholinergic θ rhythm and the spatial learning and memory ability in rats，suggesting the somatosensory stimulation induced hippocampal cholinergic θ rhythm may be involved in the spatial learning and memory consolidation in rats.The power of hippocampal cholinergic θ rhythm may be an indicator to assess the ability of spatial learning and memory in rats.

hippocampal θ rhythm；spatial learning and memory；amyloid β protein；Alzheimer's disease

R749.16

A

1672-1519（2016）09-0549-06

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.09.11

2016-03-20）

劉旭（1974-），男，碩士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)工作。