孔　莉，申鵬飛

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津　300193）

利用神經(jīng)示蹤技術(shù)初步探討針刺人迎穴降血壓的動(dòng)脈壓力反射機(jī)制*

孔莉，申鵬飛

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

［目的］利用神經(jīng)示蹤技術(shù)，從動(dòng)脈壓力反射角度，初步探討針刺人迎穴的降壓機(jī)制。［方法］選取SPF級(jí)雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）45只，隨機(jī)分為:人迎組、人迎加手法組、空白對(duì)照組，每組15只；并選取正常雄性Wistar大鼠15只，作為正?？瞻讓?duì)照組。人迎組針刺人迎后留針30 min；人迎加手法組針刺人迎后行小幅度（小于90°）、高頻率（每分鐘120～160次）的捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法，施術(shù)1 min，留針30 min；其余兩組不進(jìn)行針刺，干預(yù)周期28天。分別于干預(yù)前、后測(cè)定血壓；干預(yù)結(jié)束后在大鼠人迎穴注射PRV-152病毒，鏡下觀察其延髓及下丘腦平面染色情況。［結(jié)果］人迎加手法組的降壓效應(yīng)明顯優(yōu)于其他組。各組大鼠下丘腦、延髓中PRV陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），其中人迎加手法組PRV陽(yáng)性細(xì)胞在下丘腦、延髓中計(jì)數(shù)明顯高于其他組。［結(jié)論］針刺人迎穴，可能通過(guò)增強(qiáng)相關(guān)軸漿運(yùn)輸通路的敏感性，來(lái)實(shí)現(xiàn)降壓效應(yīng)。

人迎穴；針刺；高血壓；神經(jīng)示蹤

高血壓是一種常見病、多發(fā)病，也是造成心、腦、腎等器官病變的重要因素之一。動(dòng)脈壓力反射（ABR）是機(jī)體調(diào)節(jié)血壓的主要機(jī)制之一，其功能受損是在高血壓的形成和維持中起重要作用。本課題組前期臨床觀察表明［1-5］，針刺人迎穴可以起到良好的降壓效應(yīng)，但其療效機(jī)制尚未明確。人迎穴毗鄰頸動(dòng)脈竇，因此其降壓作用應(yīng)與動(dòng)脈壓力反射機(jī)制有關(guān)。本研究就是利用神經(jīng)示蹤技術(shù)，依靠PRV-152病毒逆行跨突觸傳遞的特點(diǎn)，從神經(jīng)傳導(dǎo)路徑角度探討針刺人迎穴的降壓機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組SPF級(jí)12周雄性SHR大鼠45只，雄性正常Wistar大鼠15只，體質(zhì)量為240～280 g，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將SHR大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為：人迎組、人迎加手法組、空白對(duì)照組，每組15只；正常Wistar大鼠為正?？瞻讓?duì)照組。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1針刺處理及血壓測(cè)量針刺均由專人操作，針灸針采用0.25 mm*13 mm型號(hào)（北京中研太和）。人迎組針刺人迎后留針30 min；人迎加手法組針刺人迎后行小幅度（小于90°）、高頻率（每分鐘120～160次）的捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法，施術(shù)1 min，留針30 min。于每日上午10:00-12:00之間進(jìn)行針刺干預(yù)。正?？瞻讓?duì)照組、SHR空白對(duì)照組大鼠按上述方法抓取固定5 min，但不予針刺。干預(yù)周期28 d。

分別于第1次治療前、最后1次治療后30 min測(cè)量血壓。采用大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)定儀（softron BP90-A，日本軟?。y(cè)量大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓，每只大鼠連續(xù)測(cè)量3次，取平均血壓值。

1.2.2病毒注射本實(shí)驗(yàn)采用的示蹤劑為可表達(dá)綠色熒光蛋白的偽狂犬病毒PRV-152，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，該病毒可以在大鼠體內(nèi)逆行跨突觸傳遞。不同方案干預(yù)28 d后，對(duì)各組大鼠注射病毒。大鼠麻醉后，用膠帶將四肢及頭部固定在泡沫板上，連線下顎角，取中間下行8 mm處向兩側(cè)量取5.5 mm，用胰島素注射器（BD U-40 insulin），在其尖端量取5 mm深度的位置，并用記號(hào)筆做好標(biāo)記，同時(shí)在立體定位儀（型號(hào)RWD68030）上進(jìn)行微調(diào)，使最后深度為5 mm，達(dá)到預(yù)定深度后，在體視顯微鏡（型號(hào)RWD77001）下，用顯微注射泵（型號(hào)Kdscientific78-8103）注射偽狂犬病毒PRV-152，對(duì)側(cè)注射PBS作為對(duì)照。病毒注射速度為200μL/min，共注射6μL，注射后繼續(xù)針刺處理3天。注射結(jié)束后6至7天，動(dòng)物發(fā)病，瘙癢癥狀明顯。

1.2.3切片制備及成像取材當(dāng)天稱取質(zhì)量，經(jīng)復(fù)合麻醉劑（10%水合氯醛和2%氨基甲酸乙酯混合液、3 mg/mL甲苯噻嗪溶液，3:1混合，使用劑量100 g/900 μL）麻醉后，斷頭取腦，放入含20%蔗糖的4%多聚甲醛液中固定24 h，待組織完全下沉后，浸入30%蔗糖磷酸緩沖液中。將其制成35 μm厚的冠狀位連續(xù)冰凍切片（Lecia CM-1900恒冷切片機(jī)），切片部位：孤束核、延髓腹外測(cè)區(qū)、視上核及視上旁核。切片后，90%甘油封片，無(wú)色指甲油封邊。處理后的切片在暗室內(nèi)應(yīng)用全電動(dòng)熒光正置顯微鏡（品牌：奧林巴斯，型號(hào)：BX63，軟件系統(tǒng)：cellsens standard）成像拍照并拼成全腦圖。

1．3統(tǒng)計(jì)方法

1.3.1細(xì)胞計(jì)數(shù)每只大鼠選取5張腦片，每個(gè)腦片隨機(jī)選取5個(gè)視野，，在光鏡下觀察目標(biāo)區(qū)域陽(yáng)性細(xì)胞的分布情況。應(yīng)用ImageJ圖像處理軟件選在下丘腦及延髓腹外側(cè)截取陽(yáng)性染色部位，插入標(biāo)尺distance=50，清除選擇圖像以為的部位，改變亮度對(duì)比度、清除噪點(diǎn)、調(diào)節(jié)色度閾值，圖像分析Size=20-Infinity，所求單位面積下所含的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/區(qū)域面積。

1.3.2計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett's T3法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1針刺前后血壓變化各組大鼠原始血壓值情況見表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得出結(jié)果如下：

表1　各組大鼠針刺前后血壓對(duì)比（±s）Tab.1　Comparison of blood pressure before and after acupuncture in rats（±s）

表1　各組大鼠針刺前后血壓對(duì)比（±s）Tab.1　Comparison of blood pressure before and after acupuncture in rats（±s）

注：干預(yù)前，正?？瞻讓?duì)照組血壓低于其他組（P＜0.05），其余各組血壓無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干預(yù)后，人迎組及人迎加手法組血壓下降（P＜0.05），人迎加手法組降壓效應(yīng)更優(yōu)（P＜0.05）。

針刺前血壓（mmHg）　針刺后血壓（mmHg）舒張壓　收縮壓　舒張壓　收縮壓人迎組　15111.20±6.47164.78±6.26 98.40±5.50150.90±5.88人迎加手法組　15111.43±6.56164.47±6.25 92.19±6.38141.71±5.49空白對(duì)照組　15110.32±9.18163.40±6.30111.42±8.66165.00.12±6.42正?？瞻讓?duì)照組 15　74.58±6.20107.84±7.89 74.63±6.43107.34±7.55組別　動(dòng)物數(shù)

2.2PRV陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)

2.2.1PRV陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)部位在人迎穴注射PRV-152病毒后，PRV染色陽(yáng)性細(xì)胞在下丘腦平面主要分布在扣帶后回、未定帶、下丘腦、杏仁核、梨狀皮質(zhì)、海馬回等。其中，在下丘腦中的分布主要集中在室旁核和視上核（見圖1）。PRV染色陽(yáng)性細(xì)胞在延髓平面主要分布在第三小腦小葉、三叉神經(jīng)中腦束、前庭內(nèi)側(cè)核、延髓腹外側(cè)核、孤束核等（見圖2）。

圖1　PRV陽(yáng)性細(xì)胞在各組大鼠下丘腦平面的表達(dá)Fig.1 Expression of PRV positive cells in the hypothalamus of rats in each group

圖2　PRV陽(yáng)性細(xì)胞在各組大鼠延髓平面的表達(dá)Fig.2　Expression of PRV positive cells in the medulla of rats in each group

2.2.2PRV陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)用圖片分析軟件ImageJ截取觀察位置（截取位置見圖3），每組選取一個(gè)血壓值接近平均血壓的樣本對(duì)其下丘腦、延髓分別進(jìn)行PRV陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)（見圖4、圖5）。PRV陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得出結(jié)果如下（見表2）。

3　討論

針刺人迎穴為主治療高血壓病是石學(xué)敏院士重要的學(xué)術(shù)思想之一［6-7］，人迎為氣?！盃I(yíng)運(yùn)之輸”連接頭、胸氣街；交匯膽、胃兩經(jīng)，主司營(yíng)衛(wèi)開合、氣血運(yùn)行，針刺其穴可通調(diào)營(yíng)衛(wèi)、暢達(dá)氣血，使血脈調(diào)和、血壓穩(wěn)定［8］。

從解剖位置來(lái)看，人迎穴的解剖部位恰在頸動(dòng)脈竇附近，頸動(dòng)脈竇血管壁有對(duì)牽張刺激敏感的動(dòng)脈壓力感受器，而動(dòng)脈壓力感受反射（ABR）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)外周心血管功能的主要機(jī)制之一，對(duì)維持機(jī)體動(dòng)脈血壓的穩(wěn)定性起重要作用。目前高血壓病因尚未明確，但已證實(shí)壓力感受器的功能異常在高血壓發(fā)病過(guò)程中有重要作用［9］，高血壓早期交感神經(jīng)緊張性升高，可能是導(dǎo)致壓力反射衰減的中樞因素，壓力感受器受損，對(duì)生理刺激的反應(yīng)性下降，異常血壓的傳入信息導(dǎo)致中樞信息處理機(jī)能變化，不能有效抑制交感神經(jīng)活性而使血壓調(diào)定點(diǎn)上調(diào)，使動(dòng)脈血壓維持在較高的水平［10］。

圖3　實(shí)驗(yàn)截取觀察部位Fig.3　Experimental intercept observation site

圖4　各組大鼠下丘腦PRV陽(yáng)性細(xì)胞Fig.4　PRV positive cells in the hypothalamus of rats in each group

圖5　各組大鼠延髓PRV陽(yáng)性細(xì)胞Fig.5　PRV positive cells in medulla of rats in each group

表2　各組大鼠PRV陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s）Tab.2　Count of PRV positive cells in rats of each group（±s）

表2　各組大鼠PRV陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s）Tab.2　Count of PRV positive cells in rats of each group（±s）

部位　針刺人迎組　針刺人迎加手法組　SHR空白對(duì)照組　正?？瞻讓?duì)照組　P值下丘腦　6.47±1.30　7.17±1.37　4.85±1.56　1.70±0.51?。?.001延髓　19.23±3.59　22.12±4.82　15.19±4.17　7.95±2.00?。?.001

人迎穴的特殊斷層解剖特點(diǎn)決定了它的降壓效應(yīng)需要通過(guò)ABR機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)，如何從解剖學(xué)角度，驗(yàn)證針刺人迎穴實(shí)現(xiàn)降壓效應(yīng)的ABR機(jī)制呢？神經(jīng)示蹤技術(shù)的出現(xiàn)，為此提供了手段。軸漿運(yùn)輸是神經(jīng)元的一項(xiàng)基本活動(dòng)，即沿其軸突有從胞體向末梢（順向）及末梢向胞體（逆向）的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，該法為研究神經(jīng)元之間的聯(lián)系提供了一種簡(jiǎn)便可行的方法［11］。偽狂犬病毒（PRV）是一種嗜神經(jīng)的病毒示蹤劑，具有嗜神經(jīng)、跨突觸傳遞、特異性傳遞和不宜衰減的特點(diǎn)，自20世紀(jì)90年代起，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)將該技術(shù)成功用于對(duì)支配周圍組織和器官的中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)示蹤的研究中，并在揭示針刺作用的中樞機(jī)制方面獲得了成功的經(jīng)驗(yàn)［12］。本研究利用SHR大鼠，通過(guò)穴位注射PRV病毒作為示蹤劑，病理形態(tài)學(xué)方法追蹤示蹤劑從穴位注射點(diǎn)沿神經(jīng)脊髓行至下丘腦的針刺人迎穴降壓作用的神經(jīng)通路。研究顯示，在SHR大鼠人迎穴注射PRV病毒后，由穴位部位向中樞跨突觸逆向標(biāo)記其神經(jīng)傳導(dǎo)路線，發(fā)現(xiàn)在延髓孤束核、腹外側(cè)核及下丘腦皆有明顯陽(yáng)性染色，而針刺能提高其陽(yáng)性表達(dá)，使相關(guān)軸漿運(yùn)輸通路敏感性增強(qiáng)，而適宜的針刺手法是影響其效應(yīng)的重要因素。

［1］申鵬飛，王舒.針刺治療難治性高血壓135例療效觀察［J］.天津中醫(yī)藥，2011，29（3）:241-242.

［2］申鵬飛，石學(xué)敏.動(dòng)態(tài)血壓監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)“活血散風(fēng)、平肝降逆”針刺治療原發(fā)性高血壓病的臨床療效分析［J］.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化.2010，12（1）:44-46.

［3］孔莉，宋曉麗.針刺治療原發(fā)性高血壓患者伴焦慮狀態(tài)的臨床觀察［J］.天津中醫(yī)藥，31（8）:456-458.

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［6］申鵬飛.石學(xué)敏教授針刺治療高血壓病的臨證經(jīng)驗(yàn)淺析［J］.天津中醫(yī)藥.2011，28（6）:443-444.

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［8］喬波，張春紅，石學(xué)敏.針刺人迎穴治療高血壓病的近代研究概況［J］.吉林中醫(yī)藥，2011，31（6）:599-600.

［9］Mussalo Hanna.Cardiovascular autonomic regulation in patients with sustained hypertension of different etiology and severity［D］.Medical Science，307，2003:87.

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（本文編輯：張震之，于春泉）

Preliminary researching on the antihypertensive mechanism of acupuncture Renying（ST9）point based on neural tracer technology

KONG Li，SHEN Peng-fei
（The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］Using neural tracer technology，from the perspective of arterial pressure reflection，preliminary research acupuncture Renying（ST9）point antihypertensive mechanism.［Methods］45 SPF grade male 12 W SHR were selected and randomly divided into Renying group，Renying and manipulation group，blank control group，15 rats in each group.15 male normotensive Wistar rats were as normal blank control group.Renying group was acupunctured Renying point and stayed for 30minutes.Renying and manipulation group underwent small amplitude attack（less than 90 degrees）and high frequency（120～160 times/min）twisting as reinforcing method and operated for 1 minutes，stayed for 30minutes.Treatment lasted 28 days.Normotensive Wistar rats control group and SHR control group rats were without acupuncture.Blood pressure was measured before and after treatment.In the rats of Renying injection of PRV-152 virus，observed the medulla and hypothalamus under the plane mirror after intervention.［Results］The difference of hypothalamus and medulla oblongata PRV positive cell counts between two group was statistical significance（P＜0.001）.Acupuncture attack plus massage group PRV positive cells counts in the hypothalamus and medulla oblongata was significantly higher than other groups. ［Conclusion］The antihypertensive effect may be achieved by enhancing the sensitivity of the transport pathway by acupuncture Renying point.

Renyin；acupuncture；hypertension；neural tracer technique

R554.1

A

1672-1519（2016）09-0555-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.09.12

2016-04-12）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81373751）。

孔莉（1975-），女，副主任醫(yī)師，從事心理治療及中藥、針灸治療心身疾病的臨床工作。

申鵬飛，E-mail:13502122793@163.com