楊洛淼，孫　健，趙宏偉，王敬國(guó)，劉化龍，鄒德堂

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻研究所，哈爾濱 150030）

不同年份冷水脅迫下水稻抽穗期和產(chǎn)量性狀的QTL分析

楊洛淼，孫健，趙宏偉，王敬國(guó)，劉化龍，鄒德堂

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻研究所，哈爾濱 150030）

【目的】水稻抽穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重跟產(chǎn)量密切相關(guān)，且受低溫影響較大。在冷水脅迫下檢測(cè)控制水稻抽穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重的QTL，為水稻孕穗期耐冷遺傳機(jī)制及分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳跃緝?yōu)質(zhì)品種東農(nóng)422和耐冷品種空育131為親本構(gòu)建的190個(gè)重組自交系解析表型變異，構(gòu)建了覆蓋12條染色體，155個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖。連續(xù)3年在水稻孕穗期進(jìn)行冷水灌溉處理，考察始穗期、齊穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重5個(gè)性狀，利用SPSS18.0和GGEbiplot進(jìn)行表型分析，利用QTLnetwork2.0，采用逐步聯(lián)合分析法定位和性狀相關(guān)的QTL，用超幾何函數(shù)評(píng)價(jià)QTL間的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】冷水脅迫下，親本和RIL群體抽穗期推遲，結(jié)實(shí)率明顯降低，千粒重和單株粒重相繼降低。始穗期、齊穗期和結(jié)實(shí)率互為正相關(guān)，結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重也互為正相關(guān)。共有71個(gè)加性QTL被檢測(cè)到，37個(gè)跟耐冷性有關(guān)，其中單環(huán)境分析檢測(cè)到28個(gè)，貢獻(xiàn)率大于10%以上的QTL有11個(gè)，單處理聯(lián)合分析共檢測(cè)到10個(gè)和耐冷有關(guān)的QTL，貢獻(xiàn)率大于10%的QTL有6個(gè)。這17個(gè)貢獻(xiàn)率大于10%且和耐冷性有關(guān)的QTL對(duì)性狀具有增效作用。多環(huán)境聯(lián)合分析檢測(cè)到12個(gè)QTL，平均貢獻(xiàn)率僅為3.56%，其中5個(gè)QTL參與了環(huán)境互作。檢測(cè)到的20對(duì)上位性QTL中，有2個(gè)主效QTL區(qū)間參與了上位性互作，對(duì)性狀的遺傳起到重要作用。QTL相關(guān)性分析表明，控制始穗期，齊穗期和結(jié)實(shí)率的QTL具有相關(guān)性，結(jié)實(shí)率的QTL也同千粒重、單株粒重的QTL相關(guān)。經(jīng)圖譜比較分析，研究發(fā)現(xiàn)的部分QTL與前人研究處于相同染色體片段上，其中，qIHD7-2、qFHD7-2、qFHD7-1和qIHD7-1是在多環(huán)境下檢測(cè)到的穩(wěn)定存在的QTL，同時(shí)，qIHD7-1、qIHD7-2、qFHD7-1、qSSR7-1和qSSR7-2和耐冷性有關(guān)，這些QTL位點(diǎn)可為水稻抗冷分子育種提供依據(jù)?！窘Y(jié)論】冷水脅迫下，結(jié)實(shí)率分別同抽穗期、千粒重和單株粒重存在相似的遺傳機(jī)制，而抽穗期和千粒重、單株穗重的遺傳相互獨(dú)立。相比而言，冷水脅迫下選擇結(jié)實(shí)率高的品種要比選擇其余3個(gè)性狀困難。

水稻；冷水脅迫；抽穗期；產(chǎn)量性狀；QTL

0　引言

【研究意義】冷害是制約水稻（Oryza sativa L.）生長(zhǎng)的因素之一［1］，且對(duì)水稻的形態(tài)指標(biāo)造成一定影響［2］。水稻產(chǎn)量除了受粒重、分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)影響之外，還受開花時(shí)間的影響［3］。抽穗期是水稻品種區(qū)域和季節(jié)適應(yīng)性的主要決定因素［4］，冷害的發(fā)生會(huì)造成抽穗和開花時(shí)間的延遲［5］，使千粒重和結(jié)實(shí)率降低，從而造成產(chǎn)量損失［6-7］。因此，掌握低溫條件下水稻農(nóng)藝性狀的遺傳基礎(chǔ)對(duì)水稻高效育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】抽穗時(shí)間被認(rèn)為是孕穗期低溫冷害研究中的重要性狀［8］，穗伸出度和單株結(jié)實(shí)率是孕穗開花期自然低溫脅迫反應(yīng)最敏感的性狀指標(biāo)［9］，穗長(zhǎng)、實(shí)粒數(shù)、癟粒數(shù)、總粒數(shù)、穗長(zhǎng)、小穗育性和千粒重在孕穗期遭受低溫冷害時(shí)，呈現(xiàn)出性狀差異顯著［10-13］。但孕穗期低溫冷害下的QTL研究常以結(jié)實(shí)率或空殼率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，KUROKI等［14］將和結(jié)實(shí)率相關(guān)的耐冷QTL定位到第8染色體198 kb范圍內(nèi)。SAITO等［15］將Ctb1定位于56 kb內(nèi)，包含7個(gè)候選基因。而TAKEUCHI等［16］在評(píng)價(jià)結(jié)實(shí)率的同時(shí)，分析了抽穗期和莖稈長(zhǎng)度與耐冷的相關(guān)性，并做了QTL分析。韓龍植等［17］在低溫環(huán)境下定位到5個(gè)主效QTL，對(duì)稈長(zhǎng)、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)和穗抽出度有增效作用，且與水稻耐冷性有一定的相關(guān)性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】水稻孕穗期耐冷性具有復(fù)雜的遺傳機(jī)理，前人利用不同作圖群體和鑒定方法對(duì)水稻孕穗期耐冷性進(jìn)行了QTL研究，但多數(shù)研究?jī)H以結(jié)實(shí)率作為研究對(duì)象，缺乏對(duì)冷水脅迫下與水稻產(chǎn)量相關(guān)農(nóng)藝性狀的QTL報(bào)道。同時(shí)，自花作物有較高程度的基因和環(huán)境互作［18］，而數(shù)量性狀又極易受環(huán)境影響［19］。徐福榮等［9］指出，在水稻孕穗開花期耐冷性自然鑒定評(píng)價(jià)中，必須進(jìn)行多年多點(diǎn)的鑒定評(píng)價(jià)。因?yàn)槎喹h(huán)境的驗(yàn)證能夠提高數(shù)據(jù)分析和QTL定位的精確度和可信性。但有關(guān)多環(huán)境QTL研究報(bào)道中并未明確指出環(huán)境因子與性狀之間的關(guān)系，而GGEbipiolt軟件［20］可以反映各性狀在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性，解決QTL與環(huán)境互作手段單一的問題，同時(shí)能評(píng)價(jià)不同性狀間的相關(guān)程度。超幾何函數(shù)的應(yīng)用能夠從不同性狀QTL之間的角度揭示性狀間的遺傳相關(guān)性［21-22］。從而能很好地反應(yīng)冷水脅迫下性狀的表型變異和遺傳基礎(chǔ)。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用東農(nóng)422和空育131構(gòu)建的190個(gè)重組自交系材料，在連續(xù)3年的環(huán)境條件下，設(shè)置對(duì)照和冷水脅迫2個(gè)處理，在孕穗期進(jìn)行冷水灌溉，對(duì)水稻的始穗期、齊穗期及成熟后的結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重進(jìn)行考察，利用GGEbipiolt評(píng)價(jià)不同環(huán)境對(duì)各性狀的影響及性狀間的相關(guān)性。同時(shí)從單環(huán)境、單處理和多環(huán)境聯(lián)合分析的角度檢測(cè)控制性狀表達(dá)的加性QTL、上位性QTL及QTL與環(huán)境的互作，探明孕穗期冷水脅迫下農(nóng)藝性狀的耐冷性，并探討QTL之間的相關(guān)程度，為水稻孕穗期耐冷性的分子育種提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

以優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的粳稻品種東農(nóng)422（DN422）為母本，耐冷性強(qiáng)的粳稻品種空育131（KY131）為父本配置雜交組合，通過“單粒傳”得到包含190個(gè)家系的F6代重組自交系群體作為作圖群體，表型考察分別為F6、F7和F8群體。

1.2田間試驗(yàn)與性狀調(diào)查

2013—2015年連續(xù)3年在哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地（北緯47°98′，東經(jīng)128°08′，海拔128 m）分別進(jìn)行正常灌溉（命名為E1、E3和E5）和3個(gè)孕穗期冷水灌溉（命名為E2、E4和E6）處理。播種期分別為4月17日、20日和25日，移栽期分別為5月21日、25日和29日。3年的平均氣溫、降雨量和日照時(shí)數(shù)均與正常年份相同。試驗(yàn)地土壤全氮0.23%，堿解氮216.4 mg·kg-1、全鉀2.32%、速效鉀167.4 mg·kg-1、總磷0.16%和磷27 mg·kg-1。小區(qū)行長(zhǎng)3 m，雙行區(qū)，行距30 cm，穴距10 cm，重復(fù)2次。冷水灌溉參考MATSUNAGA［23］的方法，略有改動(dòng)。從早熟株系開始出現(xiàn)幼穗分化，便用17℃恒溫冷水均勻地灌溉，直到晚熟株系全部出穗為止停止灌溉，水深20 cm。17℃水源用地下井水（8—10℃）和曬水池水（22—24℃）混合而成，采用流動(dòng)灌溉，以維持田間整體水溫。正常灌溉用曬水池水，3年孕穗期空氣溫度均在24℃左右。記錄10%抽穗的始穗期（initial heading date，IHD）和80%抽穗的齊穗期（full heading date，F(xiàn)HD），成熟時(shí)每個(gè)株系取中間10株，考察單株結(jié)實(shí)率（seed setting rate，SSR）、千粒重（thousand grain weight，TGW）和單株粒重（grain weight per plant，PGW）。并計(jì)算對(duì)應(yīng)指標(biāo)的冷水反應(yīng)指數(shù)（cold-water response index，CRI），CRI=冷水處理下的性狀值/正常灌溉下的性狀值。

1.3數(shù)據(jù)分析

親本間差異用t檢驗(yàn)判別，利用SPSS18.0對(duì)RIL群體進(jìn)行均值（Mean）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的分析，利用一般線性模型（GLM）進(jìn)行方差分析（ANOVA），環(huán)境和基因型作為固定因子，各性狀值作為因變量，用于方差分析的數(shù)據(jù)輸入。

用GGEbiplot評(píng)價(jià)環(huán)境和性狀間的相關(guān)性，進(jìn)行雙標(biāo)圖分析，用圖中指標(biāo)向量和相鄰指標(biāo)間的夾角余弦值判斷指標(biāo)間的相關(guān)性。該軟件主要用于研究基因型（性狀）與環(huán)境互作的關(guān)系，主要基于以下計(jì)算模型：

其中，Yij是i基因型（性狀）在j環(huán)境下的均值，yi是在j環(huán)境下所有基因型（性狀）的平均值，λ1ξi1ηj1和λ2ξi2ηj2中，λ1和λ2分別稱為第一主成分和第二主成分的顯著性，ξi1和ξi2分別為對(duì)i基因型（性狀）第一主成分和第二主成分的值，ηj1和ηj2分別為對(duì)j環(huán)境第一主成分和第二主成分的值，ξij是對(duì)j環(huán)境的i基因型（性狀）的模型剩余值［20］。

廣義遺傳力的計(jì)算參考HOSSEINI等［24］的公式。

式中，σG2、σGE2和σE2分別為遺傳方差、基因型與環(huán)境互作的方差和誤差方差，r和n分別為重復(fù)數(shù)和環(huán)境數(shù)。

1.4遺傳連鎖圖的構(gòu)建和QTL定位

采用改良CTAB法［25］提取DNA。從水稻基因組（http//www.gramene.org）中獲得1 000對(duì)SSR引物序列。引物由上海生工生物工程有限公司合成。利用兩親本間有多態(tài)性的173對(duì)引物對(duì)F6代190個(gè)單株DNA的進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終確定多態(tài)性好的SSR標(biāo)記165對(duì)。去除10個(gè)偏分離標(biāo)記，剩余155個(gè)SSR標(biāo)記用于構(gòu)建連鎖圖譜。利用Mapchart 2.2繪制遺傳連鎖圖譜，QTLNetwork2.0的混合線性模型復(fù)合區(qū)間作圖法（mixed composite interval mapping，MICM）進(jìn)行QTL定位，Permutation次數(shù)設(shè)置為1 000次，用Monte carlomrekov chain（MCMC）算法估計(jì)QTL效應(yīng)，Gibbs取樣規(guī)模設(shè)置為20 000，以1 cM的步長(zhǎng)對(duì)全基因組進(jìn)行QTL掃描，用逐步聯(lián)合的QTL檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，分為（1）單環(huán)境檢測(cè)，（2）單處理聯(lián)合檢測(cè)（相同處理聯(lián)合3年數(shù)據(jù)），（3）多環(huán)境的聯(lián)合檢測(cè)。QTL命名遵循MCCOUCH等［26］的原則。

對(duì)性狀的QTL之間的關(guān)系確定使用超幾何概率函數(shù)［21］，該公式由PATERSON等［27］提出。

式中，N為圖譜總長(zhǎng)的2倍除以要比較的2個(gè)性狀QTL置信區(qū)間平均數(shù)之和，M指兩性狀重合的QTL數(shù)目（兩性狀QTL置信區(qū)間大于50%重疊的QTL數(shù)目），L是QTL數(shù)目較多的性狀檢測(cè)到的QTL數(shù)目，S是QTL數(shù)目較少的性狀檢測(cè)到的QTL數(shù)目［22］。

2　結(jié)果

2.1親本和群體各性狀的表型分析

冷水脅迫和正常灌溉下，分別對(duì)親本及重組自交系材料的IHD、FHD、SSR、TGW和PGW進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（表1）表明，冷水處理下，與對(duì)照相比，IHD和FHD均發(fā)生推遲，且FHD延遲程度較大，SSR、TGW和PGW也相繼下降?？傊?，空育131受冷水脅迫程度小于東農(nóng)422，其中IHD和FHD表現(xiàn)較為明顯。在冷水反應(yīng)指數(shù)方面，對(duì)抽穗期來說，CRI越大表示抽穗延遲越嚴(yán)重，對(duì)SSR、TGW和PGW來說，CRI越小表示受冷害影響越嚴(yán)重。對(duì)比兩親本5個(gè)性狀的CRI，可以看到，冷水脅迫下，敏感程度最大的性狀為SSR。t檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩親本在6個(gè)環(huán)境下，各性狀的差異均達(dá)顯著水平。冷水脅迫下，群體均值在5個(gè)性狀上均受到影響，其中，IHD和FHD發(fā)生延遲，SSR、TGW和PGE均降低。表明水稻花期對(duì)水溫較為敏感，從而影響結(jié)實(shí)，導(dǎo)致產(chǎn)量下降。5個(gè)性狀在不同環(huán)境的群體表現(xiàn)均發(fā)生一定程度的超親分離，且變異范圍較大，這對(duì)于等位基因分布在雙親中是有利的。多環(huán)境聯(lián)合分析遺傳力（表2）發(fā)現(xiàn)，IHD為91.45%，F(xiàn)HD遺傳力為98.42%，SSR為89.97%，TGW為20.8%，PGW為87.44%。由此可知，除了SSR，其余性狀的遺傳變異度較大，具有好的選擇潛力，容易取得好的育種效果。

表1　不同環(huán)境始穗期、齊穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重的表型分析Table 1　Performance of IHD， FHD， SSR， TGW and PGW under different environments

續(xù)表1　Continued table 1

由圖1可知，第一主成分效應(yīng)為43.8%，第二主成分效應(yīng)為37.7%，總效應(yīng)為81.5%，反映各環(huán)境81.5%的真實(shí)情況，5個(gè)性狀落在4個(gè)扇形區(qū)的3個(gè)區(qū)域中，在E6條件下，IHD和FHD的值最高，在E2條件下，TGW和PGW的值最高，在E3條件下，結(jié)實(shí)率表現(xiàn)最好。在E1和E5條件下，沒有性狀落入?yún)^(qū)域中，說明這5個(gè)性狀在這兩個(gè)環(huán)境下表現(xiàn)不是最好。由圖2可知，在環(huán)境充分得到反應(yīng)的情況下，IHD、FHD和SSR之間的夾角小于90度，說明3個(gè)指標(biāo)之間表現(xiàn)為正相關(guān)，同時(shí)，SSR和TGW、PGW為正相關(guān)，相關(guān)程度高。而TGW、PGW分別和IHD、FHD的夾角均大于90度，說明TGW、PGW和抽穗期呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.2遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL分析

2.2.1遺傳圖譜的構(gòu)建利用155對(duì)SSR引物對(duì)兩親本衍生的后代進(jìn)行基因型鑒定，最終構(gòu)建了圖譜總長(zhǎng)2 337 cM，覆蓋水稻12條染色體，標(biāo)記間平均距離為15.1 cM的遺傳連鎖圖譜。

2.2.2加性QTL分析5個(gè)性狀共檢測(cè)到44個(gè)QTL（表3，圖3），分布在第1、2、6、7、8和12染色體，有28個(gè)增效等位基因來自DN422，16個(gè)增效等位基因來自KY131，貢獻(xiàn)率變化范圍為4.15%—33.72%，其中，貢獻(xiàn)率大于10%以上的QTL占40.9%，主要來自位于第7染色體的RM1362—RM1306和RM1306—RM70。其中，RM1362—RM1306檢測(cè)到13個(gè)QTL，平均單個(gè)QTL解釋的表型變異為18.21%，RM1360—RM70檢測(cè)到的10個(gè)QTL平均貢獻(xiàn)率為12.33%。RM247—RM27552內(nèi)8個(gè)QTL的平均貢獻(xiàn)率為10.27%。其中，IHD在6個(gè)環(huán)境中均檢測(cè)到1個(gè)QTL，其中3個(gè)QTL位于區(qū)間RM1362—RM1306，分別在E1、E5、E6環(huán)境檢測(cè)到，2個(gè)在RM1306—RM70檢測(cè)到，來自于E2和E4。MALOSETTI等［28］和MESSMER等［29］表明，單一的環(huán)境并不能準(zhǔn)確地描述QTL的效應(yīng)和位置，且缺乏穩(wěn)定性，因此，這些位于同一區(qū)間控制同一性狀且在不同環(huán)境檢測(cè)到的QTL可以認(rèn)為是穩(wěn)定表達(dá)的QTL。其中，有29個(gè)（65.9%）QTL在冷水脅迫和冷水反應(yīng)指數(shù)上檢測(cè)到，SSR僅在冷水處理下檢測(cè)到3個(gè)QTL，其中2個(gè)位于區(qū)間RM1362—RM1306，另一個(gè)位于RM247—RM260，說明冷水處理對(duì)SSR的影響較大，改變了群體間的表型變化程度，增加了變異。TGW的QTL主要位于RM336—RM1362，相對(duì)于PGW來說，遺傳范圍狹窄。其中qIHD7-1、qIHD7-2、qFHD7-1、qSSR7-1和qSSR7-2在冷水處理、正常灌溉和冷水反應(yīng)指數(shù)下同時(shí)被檢測(cè)到，說明這5個(gè)QTL和耐冷性相關(guān)程度密切，另外，IHD、FHD均未在2013年檢測(cè)到冷水反應(yīng)指數(shù)相關(guān)的QTL，SSR在2014年未檢測(cè)到冷水反應(yīng)指數(shù)的QTL，說明冷水反應(yīng)指數(shù)在闡述耐冷性QTL方面還受到年際的影響。

表2　始穗期、齊穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重的方差分析及遺傳力估計(jì)Table 2　Analysis of variance and estimates of heritability for IHD， FHD， SSR， TGW and PGW

圖1　不同環(huán)境與始穗期、齊穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重的關(guān)系圖Fig. 1　Correlation between environment and IHD， FHD， SSR，TGW and PGW

表3　單環(huán)境下水稻始穗期、齊穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重的QTL及其遺傳效應(yīng)Table 3　QTL and their gentic effects of IHD， FHD， SSR， TGW and PGW at the single-environment in rice

圖2　不同環(huán)境下始穗期、齊穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重的相關(guān)系數(shù)Fig. 2　Correlation coefficient among IHD， FHD， SSR，TGW and PGW in different environments

在冷水處理和正常灌溉下共檢測(cè)到15個(gè)QTL（表4，圖3），分布在第1、2、6、7和12染色體，除了TGW和PGW外，其他性狀QTL的等位基因均來自于DN422。其中，冷水處理下檢測(cè)到QTL數(shù)為10個(gè)，單個(gè)QTL貢獻(xiàn)率介于5.19%—21.33%，延遲始穗期和齊穗期的平均天數(shù)分別為1.18和1.57 d，增加結(jié)實(shí)率0.19%，減少千粒重2.06 g，增加單株粒重1.02 g。且RM1362—RM1306同時(shí)檢測(cè)到控制IHD、FHD、SSR和TGW的QTL，說明冷水脅迫對(duì)這4個(gè)性狀的變異具有相似的影響。通過聯(lián)合單處理分析，在冷水灌溉下檢測(cè)到的QTL和耐冷性有關(guān)。

全部環(huán)境聯(lián)合分析結(jié)果詳見表5，共檢測(cè)到12個(gè)QTL（表5，圖3），分布于第2、3和7染色體。66.7%的QTL增效等位基因來自KY131。其中，第2染色體上的RM1211—RM13216控制IHD和FHD的表達(dá)，但二者的等位基因來源卻不同，RM1306—RM70控制IHD和PGW的表達(dá)，等位基因來源相同。對(duì)比單環(huán)境檢測(cè)到的QTL可以發(fā)現(xiàn)，平均貢獻(xiàn)率僅為3.56%。同時(shí)，僅有35.7%的QTL檢測(cè)到顯著的QTL與環(huán)境互作，且僅有RM1306—RM70區(qū)間里的4個(gè)QTL同時(shí)在6個(gè)環(huán)境條件下存在QTL和環(huán)境互作關(guān)系。對(duì)比前面結(jié)果可知，多數(shù)出現(xiàn)在單環(huán)境和單處理下的QTL，也同時(shí)在多環(huán)境聯(lián)合檢測(cè)下定位到。如位于第7染色體上，標(biāo)記區(qū)間RM1362—RM1306和RM1306—RM70檢測(cè)到的QTL穩(wěn)定性很強(qiáng)，這些控制同一性狀，位于同一區(qū)間不同位點(diǎn)的QTL很可能是同一個(gè)QTL，而控制不同性狀且位于該區(qū)間的QTL可能具有QTL的多效性。

表4　單處理下水稻始穗期、齊穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株穗重的QTL及其遺傳效應(yīng)Table 4　QTL and their gentic effects of IHD， FHD， SSR， TGW and PGW at the single-treatment in rice

表5　全部環(huán)境聯(lián)合分析下水稻始穗期、齊穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重的QTL及其遺傳效應(yīng)Table 5　QTL and their gentic effects of IHD， FHD， SSR， TGW and PGW at the Joint QTLs combining data of all environments in rice

2.2.3上位性QTL分析單環(huán)境下，對(duì)上位性互作進(jìn)行檢測(cè)（表6），共檢測(cè)到上位性互作位點(diǎn)20對(duì)，其中IHD有4對(duì)，分別在E1、E2、E5和E6條件下檢測(cè)到，平均貢獻(xiàn)率為0.95%，F(xiàn)HD有9對(duì)上位性位點(diǎn)，分別在E1、E3、E5和E6條件下檢測(cè)到，平均貢獻(xiàn)率為0.65%，SSR有2對(duì)，在E4和E5條件下檢測(cè)到，平均貢獻(xiàn)率為0.58%，TGW有2對(duì)，在E4和E5條件下檢測(cè)到，PGW有3對(duì)，在E3、E4和E5條件下檢測(cè)到。其中，位于RM1362—RM1306的QTL是控制IHD、FHD、SSR的主效QTL，在上位性互作中，分別參與了位于第1染色體上的qFHD1和第6染色體上的qFHD6的互作，2個(gè)互作對(duì)控制齊穗期表達(dá)，均表現(xiàn)為延遲齊穗期，延遲天數(shù)分別為1.14和1.37 d，還參與了位于第1染色體的qSSR1的互作，該互作對(duì)參與結(jié)實(shí)率表達(dá)，減少結(jié)實(shí)率2.16%。TGW和PGW也有主效QTL區(qū)間參與互作，這些有主效QTL參與的上位性互作對(duì)產(chǎn)生的上位性效應(yīng)均小于加性效應(yīng)。

圖3　始穗期、齊穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重QTL的連鎖分布圖Fig. 3　Distribution of QTL on linkage map for IHD， FHD， SSR， TGW and PGW

2.2.4基于性狀的QTL間的相關(guān)分析通過單環(huán)境，單處理和多環(huán)境聯(lián)合檢測(cè)，累計(jì)QTL數(shù)為71個(gè)，除了RM1371—RM7、RM517—RM545、RM225—RM276和RM247—RM260檢測(cè)到的QTL沒有多效性之外，其余標(biāo)記區(qū)間均出現(xiàn)多效性。研究利用超幾何函數(shù)來評(píng)價(jià)QTL之間的關(guān)系，結(jié)果表明，始穗期和齊穗期QTL之間的相關(guān)性達(dá)到顯著水平（P=0.01）。結(jié)實(shí)率QTL和始穗期、齊穗期QTL的相關(guān)性水平顯著（P=0.02），和千粒重（P=0.04）和單株粒重（P=0.05）QTL的相關(guān)性均顯著，說明千粒重和單株粒重的的高低和結(jié)實(shí)率在遺傳上有緊密的連鎖關(guān)系，而冷水處理推遲了抽穗時(shí)間，也嚴(yán)重減少了結(jié)實(shí)率，兩者關(guān)系呈正相關(guān)，這從性狀相關(guān)和QTL相關(guān)兩方面得到了驗(yàn)證。

表6　單環(huán)境分析下水稻始穗期、齊穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重的上位性QTL及其遺傳效應(yīng)Table 6　Epistatic QTL and their gentic effects of IHD， FHD， SSR， TGW and PGW at the single-environment in rice

3　討論

3.1表型穩(wěn)定性分析

本研究在連續(xù)3年環(huán)境下對(duì)始穗期、抽穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，其中2015年，始穗期和齊穗期整體延遲，正常灌溉下，始穗期較2013年和2014年分別延遲7和9 d，而齊穗期分別延遲7和5 d；冷水處理下，始穗期延遲分別為8和11 d，齊穗期延遲分別為6和9 d，這可能跟2015年播種移栽時(shí)期氣溫低對(duì)苗期影響有關(guān)。同時(shí)，結(jié)實(shí)率受水溫影響較大，千粒重和單株粒重同結(jié)實(shí)率呈正相關(guān)，也受到冷水脅迫。GGE雙標(biāo)圖對(duì)于二維數(shù)據(jù)的分析應(yīng)用廣泛［20］，研究利用不同環(huán)境和性狀構(gòu)建了二維雙標(biāo)圖，揭示了不同環(huán)境下性狀的穩(wěn)定性，圖1很好地反映了冷水脅迫和對(duì)照條件下性狀的穩(wěn)定性和差異，始穗期和齊穗期在E6環(huán)境下表現(xiàn)出整體推遲嚴(yán)重的現(xiàn)象，結(jié)實(shí)率在E3年值較高，而千粒重和單株粒重則在E2下表現(xiàn)最好，整體來看，5個(gè)性狀在冷水脅迫下的值均低于對(duì)照，且同一性狀在不同環(huán)境下表現(xiàn)出差異，這可能跟年際間環(huán)境差異有關(guān)，因此研究環(huán)境因子對(duì)性狀的影響尤為重要，這可能是導(dǎo)致同一性狀在不同環(huán)境下QTL表達(dá)存在差異的原因之一。

3.2低溫對(duì)QTL評(píng)價(jià)的影響

本研究共檢測(cè)到QTL數(shù)為71個(gè)，其中37個(gè)（52.1%）QTL在冷水脅迫或冷水反應(yīng)指數(shù)下檢測(cè)到，這些QTL表現(xiàn)出對(duì)冷水強(qiáng)的適應(yīng)性。12個(gè)QTL在多環(huán)境聯(lián)合分析下檢測(cè)到，僅有5個(gè)QTL與環(huán)境發(fā)生互作。其中，qIHD7-1、qIHD7-2、qFHD7-1、qSSR7-1和qSSR7-2同時(shí)在正常灌溉，冷水處理和冷水反映指數(shù)下檢測(cè)到，這些QTL可以反應(yīng)性狀的耐冷性，且貢獻(xiàn)率較大，是進(jìn)行耐冷性研究很好的選擇。在研究的5個(gè)性狀中，結(jié)實(shí)率受冷水影響最大，這與前人研究結(jié)果一致［30］。為了鑒定QTL的穩(wěn)定性，本研究采用MESSMER等［29］的QTL逐步聯(lián)合分析方法，在單環(huán)境分析下，與耐冷有關(guān)的QTL數(shù)為28個(gè)，單處理（冷水脅迫）分析下檢測(cè)到的QTL數(shù)為10個(gè)，其中qIHD7-1和qIHD7-2在單環(huán)境和單處理分析下同時(shí)檢測(cè)到，為冷水脅迫下穩(wěn)定表達(dá)的QTL。而全部環(huán)境聯(lián)合分析檢測(cè)到的QTL，qIHD7-2、qFHD7-2和qPH7-2在單環(huán)境和單處理下也檢測(cè)到?？偟膩碚f，不同處理和年際間，可重復(fù)檢測(cè)的QTL數(shù)要大于單處理或單年際檢測(cè)到的QTL數(shù)。相同性狀在不同環(huán)境中的QTL會(huì)存在較大差異［31］，這可以在本研究中得到證實(shí)。但本研究檢測(cè)到的穩(wěn)定QTL數(shù)不多，可能原因是年際間田間溫度和光照等因子存在差異，因此要研究冷水灌溉下水稻農(nóng)藝性狀的遺傳特性，在冷水環(huán)境下進(jìn)行鑒定和改良是好的選擇。

3.3抽穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重QTL的研究比較

控制相關(guān)性狀的QTL通常被定位在同一或相似的染色體區(qū)域［32］，經(jīng)過相同標(biāo)記和圖譜比較，本研究檢測(cè)到的一些QTL與前人位于相鄰位置，控制抽穗的qDTH-7［33］與本研究的RM1306具有相同標(biāo)記，控制粒寬的QTL［34］和本研究的qIHD3位于共同區(qū)域，在RM1306—RM70，存在開花［35］和花序［36-38］有關(guān)的研究結(jié)果。在RM1362—RM1306，和水稻生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的CYP714B1和CYP714B2［39］也被發(fā)現(xiàn)。本研究檢測(cè)到的和抽穗期，結(jié)實(shí)率相關(guān)的QTL在RM1362—RM1306和RM1306—RM70多次檢測(cè)到，可能是穩(wěn)定表達(dá)的區(qū)間，千粒重和單株粒重也分別在這兩個(gè)區(qū)間多次檢測(cè)到，總的來說，抽穗期檢測(cè)到的QTL分布廣泛，始穗期和齊穗期關(guān)聯(lián)程度較大。而千粒重和單株粒重的QTL關(guān)聯(lián)度不大，在RM27489—RM415，存在和結(jié)實(shí)率，齊穗期和單株粒重的QTL，在RM336—RM1362，存在與結(jié)實(shí)率、始穗期和千粒重的QTL。由此可見，這些多效性標(biāo)記區(qū)間包含豐富的遺傳背景，可控制多性狀表達(dá)，可以通過雜交建立次級(jí)群體，在該區(qū)間進(jìn)行遺傳分解，找出具體控制某一性狀表達(dá)的QTL片段。但這些研究并未針對(duì)耐冷性開展，因此，本研究在多環(huán)境下研究了抽穗期和產(chǎn)量性狀的耐冷性，結(jié)果表明，抽穗期和結(jié)實(shí)率受冷水脅迫影響較大。利用結(jié)實(shí)率開展水稻耐冷方面的報(bào)道很多［40-43］，定位到的QTL主要分布在染色體第2、3、7、8和10染色體上，在已報(bào)道的水稻耐冷性研究中，不同時(shí)期耐冷性QTL分布在水稻12條染色體上（qCT-1、qCTS-1-c、qCT-1、qCTB2a、qSDW2、qCSH2、qLTG3-1、qLVG3、qCTS4-1、qCTS4-3、Ctb1、OSAOXla、qLTG-5、qRCT6b、qLVG6、qLTG-7、qLVG7-2、qCIVG7-2、qCTB8、qCTS8-2a、qCTS8-2b、Clr9、Cisc（t）、ferll、dcll、qLT12、qCTS12），其中只有qCTB2a、ferll、Ctb1和qCTB8跟結(jié)實(shí)率有關(guān)，本研究檢測(cè)到的穩(wěn)定表達(dá)的耐冷性QTL在多年得到驗(yàn)證，包括qSSR7-1和qSSR7-2，分別位于RM1362—RM1306和RM1306—RM70，且均檢測(cè)到QTL與環(huán)境的互作，其中RM1362—RM1306經(jīng)過RAPD（http://rapdb.dna.affrc.go.jp）圖譜比較發(fā)現(xiàn)，該區(qū)間包含6個(gè)注釋基因（Os07g0681200、Os07g0681250、Os07g0681300、Os07g0681350、Os07g0681400和Os07g0681500），其中，Os07g0681300對(duì)赤霉素的內(nèi)穩(wěn)態(tài)起調(diào)節(jié)作用，Os07g0681400起鈣離子調(diào)節(jié)作用，這些基因可能跟耐冷性發(fā)生變化有關(guān)，可以作為下一步研究對(duì)象。而研究中檢測(cè)到可穩(wěn)定表達(dá)的和抽穗期相關(guān)的主效耐冷QTL（qIHD7-1、qIHD7-2和qFHD7-1）可以作為冷水脅迫下分子育種的參考，為選擇不同生育期的水稻育種提供相應(yīng)遺傳背景。

4　結(jié)論

冷水脅迫下，水稻抽穗時(shí)間延遲，結(jié)實(shí)率、千粒重和單株粒重下降，結(jié)實(shí)率分別同抽穗期，千粒重和單株粒重存在相似的遺傳機(jī)制，而抽穗期和千粒重、單株穗重的遺傳相互獨(dú)立。相比而言，冷水脅迫下選育結(jié)實(shí)率高的品種比選育抽穗期、千粒重和單株粒重困難。

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（責(zé)任編輯李莉）

QTL Analysis of Heading Date and Yield Traits in Japonica Rice Under Cold Water Stress in Different Years

YANG Luo-miao， SUN Jian， ZHAO Hong-wei， WANG Jing-guo， LIU Hua-long， ZOU De-tang
（Rice Research Institute， College of Agricultural， Northeast Agricultural University， Harbin 150030）

【Objective】Heading date， seed setting rate， thousand grain weight and grain weight per plant are traits associated with yield and these traits are greatly influenced by cold water. Therefore， the QTL analysis of heading date， seed setting rate，thousand grain weight and grain weight per plant of rice under cold water stress were conducted in the present study in order to provide a scientific basis for the rice genetic mechanism of cold tolerance and molecular marker assisted breeding. 【Method】Totally 190 recombinant inbred line （RIL） populations derived from two rice varieties （Dongnong 422 and Kongyu131） were used as materials under cold water irrigation at booting stage， a linkage map was constructed using 155 SSR markers. The correlation analysis on the initial heading （IHD） date， full heading （FHD） date， seed setting rate， thousand grain weight and grain weight perplant were conducted to detect （QTL） these traits by stepwise joint QTL mapping method. The correlations between QTLs of different traits were determined by using the hypergeometric probability function. 【Result】 IHD and FHD were postponed under cold water irrigation in two parents and RIL. Seed setting rate， thousand grain weight and grain weight per plant had significant changes. Those traits had a positive or a negative correlation. A total of 71 QTLs were detected by using stepwise joint QTL mapping method， among them， 37 QTL were associated with cold tolerance， among them， 28 were detected under singleenvironment， 11 QTL explained beyond 10% of phenotypic variance， 10 QTL were detected under the single-treatment， 6 QTL explained beyond 10% of phenotypic variance， all 17 QTL were associated with cold tolerance. Five QTL had significant QE interaction under the Joint QTLs combining data of all environments. Twenty pairs of additive×additive epistasis were detected，and two main-effect QTL had epistatic interaction. Hypergeometric probability function showed that QTL was associated among those traits. By comparing the mapping results， some of the detected QTLs were in the same or adjacent chromosomal regions of previously reported QTLs， which include qIHD7-2， qFHD7-2， qFHD7-1 and qIHD7-1. These four QTL were stable in different environments， meanwhile， qIHD7-1， qIHD7-2， qFHD7-1， qSSR7-1 and qSSR7-2 were associated with cold tolerance. These QTL loci may provide a basis for molecular breeding for cold resistance in rice.【Conclusion】Seed setting rate has similar genetic mechanism with heading date， thousand grain weight and grain weight per plant under cold water stress. However， heading date，thousand grain weight and grain weight per plant are independently inherited. Meanwhile， it is more harder to breed the rice has high seed setting rate than heading date， thousand grain weight and grain weight per plant under cold water stress.

Japonica rice； cold water stress； heading data； yield traits； QTL

2016-04-21；接受日期：2016-07-13

黑龍江省重大科技招標(biāo)基金項(xiàng)目（GA14B102-02）

聯(lián)系方式：楊洛淼，E-mail：yaochang616@163.com。通信作者鄒德堂，E-mail：zoudtneau@126.com