韓云云，宋方圓，韓艷文，李　玲，閆師杰，*

（1.天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子 832000；3.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；4.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384）

不同采收貯藏條件下鴨梨果實(shí)LOX基因表達(dá)及其與果心褐變的關(guān)系

韓云云1，宋方圓2，韓艷文1，李玲3，4，閆師杰3，4，*

（1.天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子 832000；3.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；4.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384）

以河北鴨梨為試材，通過測定鴨梨果實(shí)呼吸強(qiáng)度、乙烯釋放量、果心褐變指數(shù)等生理指標(biāo)變化及不同部位脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）基因表達(dá)特性和LOX活性變化，研究了兩種降溫條件下不同采收成熟度鴨梨LOX基因表達(dá)及其與鴨梨果心褐變的關(guān)系。結(jié)果表明：不同貯藏期果心LOX活性及果心褐變指數(shù)順序均為晚采果＞早采果＞中采果，急速降溫果＞緩慢降溫果；貯藏期間，鴨梨果心LOX基因表達(dá)量呈現(xiàn)先緩慢上升后下降，貯藏末期又上升的變化趨勢；急速降溫鴨梨LOX基因表達(dá)量大于緩慢降溫果，中采果LOX基因表達(dá)量小于早采及晚采果。中采結(jié)合緩慢降溫抑制了鴨梨果肉及果心部位LOX基因表達(dá)，進(jìn)而減少了果心褐變的發(fā)生；LOX基因的表達(dá)與LOX活性及鴨梨褐變指數(shù)變化趨勢一致，說明該基因與鴨梨褐變關(guān)系密切。

鴨梨；脂氧合酶；果心褐變；基因表達(dá)；褐變指數(shù)

鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd cv. Yali）集中產(chǎn)于河北南部、山東西北部、遼寧西部等地，是中國梨中最馳名品種之一。2014年，河北地區(qū)鴨梨產(chǎn)量為409.6萬 t，占全國梨總產(chǎn)量的25.8%；其中鴨梨種植面積占河北省梨樹總種植面積的78%［1］，為果農(nóng)創(chuàng)收做出了巨大貢獻(xiàn)。鴨梨在貯藏早期及后期極易發(fā)生果心褐變，極大地影響著鴨梨的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；因此提高鴨梨貯藏期間綜合品質(zhì)，解決早期及晚期黑心病的發(fā)生已成為迫在眉睫的問題。鴨梨果心褐變是采后貯藏中發(fā)生的一種生理紊亂現(xiàn)象，與多種酶、酚類、乙烯、膜變化等都有著密切的關(guān)系［2］。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）在植物中普遍存在［3］，由多基因家族編碼而成。其參與了多種代謝活動，過程中產(chǎn)生了活性氧、氧自由基、氫過氧化物等對細(xì)胞膜有破壞作用的物質(zhì)；同時(shí)LOX途徑產(chǎn)生的氫過氧化物和超氧自由基等物質(zhì)還參與了乙烯的生成［4-8］。在蘋果［9-10］、番茄［11］和獼猴桃［12］的已有研究中，從多角度證實(shí)了LOX基因家族在果實(shí)的成熟衰老過程中發(fā)揮著重要作用，但從分子角度揭示鴨梨果實(shí)中LOX途徑與褐變關(guān)系的研究卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對鴨梨組織LOX基因的cDNA進(jìn)行了測序和克隆，并通過半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）對各貯藏時(shí)期不同處理的鴨梨果肉及果心部位的LOX基因表達(dá)量進(jìn)行了分析，以研究兩種降溫方法處理的不同成熟度鴨梨的呼吸強(qiáng)度、乙烯釋放量、LOX活性及基因表達(dá)量，以進(jìn)一步鴨梨褐變與LOX基因之間的關(guān)系，為通過基因工程的方法抑制鴨梨褐變提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料為河北藁城鴨梨，分別于2014年9月6日（早采）、9月16日（中采）和9月26日（晚采）采摘；采摘后挑選批次內(nèi)成熟度和大小一致、無明顯機(jī)械傷的鴨梨果，加裝網(wǎng)套并裝箱后運(yùn)至天津農(nóng)學(xué)院冷庫。

M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 北京鑫澤天佑生物科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

Z323K高速冷凍離心機(jī) 德國Hermle公司；IMS-30制冰機(jī) 河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；Forma-86C ULT-80 ℃超低溫冰箱、Biomate 3S核酸蛋白測定儀美國Thermo公司；VORTEX-GENIE2漩渦混勻器 美國Scientific Industries公司；T100型PCR儀、164-5070電泳儀美國Bio-Rad公司；Tanon2500凝膠成像系統(tǒng) 上海天能公司。

1.3方法

1.3.1材料處理

急降溫處理果直接放入（0±1）℃冷庫中貯藏；緩降溫處理果于12 ℃預(yù)冷，每5 d降2 ℃，共30 d降至0 ℃。貯藏期間，每20 d測定相關(guān)生理指標(biāo)并取樣；每次隨機(jī)選取40 個(gè)果實(shí)，削皮，沿果實(shí)赤道處切開，將果肉和果心切塊，經(jīng)液氮速凍置于-80 ℃低溫冰箱中保存。

1.3.2呼吸強(qiáng)度的測定

呼吸強(qiáng)度的測定參考閆師杰等［13］的方法。

1.3.3乙烯釋放量的測定

隨機(jī)選取18 個(gè)果作為乙烯定果。將定果置于直徑25 cm、高50 cm的標(biāo)本缸中，密閉2 h，從頂部用注射器抽取20 mL氣體，每個(gè)處理重復(fù)3 次，用氣相色譜儀測定。乙烯樣品進(jìn)樣量為1 mL；色譜柱為Porapak 80-100不銹鋼填充柱（2 m×3 mm）；檢測器為氫火焰離子檢測器，載氣為N2；進(jìn)樣口溫度120 ℃，柱溫箱溫度60 ℃，檢測器溫度150 ℃。乙烯釋放量以μL/（kg·h）表示。

1.3.4果心褐變指數(shù)的測定

果心褐變指數(shù)的測定參考Yan Shijie等［14］的方法。

1.3.5LOX活性的測定

底物配制：參考羅云波等［15］的方法；LOX抽提液配制：50 mmol/L pH 6.8的磷酸緩沖液，加1% TritonX-100和1% PVP。酶液制備及活性測定參照閆師杰等［13］方法。酶活性用每分鐘反應(yīng)體系在波長234 nm處吸光度變化0.01所需的酶量表示。

1.3.6鴨梨LOX基因的擴(kuò)增及其半定量RT-PCR分析

將-80 ℃保存的鴨梨果肉及果心樣品取出，在液氮中研磨成粉末狀，參照改良的CTAB法［16-17］提取不同部位總RNA。使用Thermo核酸蛋白測定儀測定波長260 nm和280 nm處RNA吸光度，檢測總RNA純度；經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。以O(shè)ligo（dT）18為引物，利用不同貯藏期各處理樣品的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明合成cDNA第一鏈。

根據(jù)GenBank上登錄的薔薇科植物肌動蛋白（Actin）基因保守序列設(shè)計(jì)了一對跨內(nèi)含子引物Actin l、2；依據(jù)已知的高等植物的LOX基因保守區(qū)序列，進(jìn)行BLASTX比對分析，使用Primer 5.0等生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)一對LOX基因的簡并引物，交由上海生工生物技術(shù)公司合成。引物序列如下：Actin1：5’-CAGTGGTCGTACAACTGGTAT-3’；Actin2：5’-AGGTAGCTCATAGCTCTTCTC-3’。LOXF：5’-CCGATTTACAAACTTCTGC-3’；LOXR：5’-ATCCTTAACTGCCACTCCT-3’。

每個(gè)樣品吸取2.0 μL的反轉(zhuǎn)錄液（cDNA）作為模板，用引物分別進(jìn)行LOX基因及Actin基因的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變性45 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延長2 min，循環(huán)35 次（Actin基因的PCR擴(kuò)增循環(huán)30 次），最后72 ℃延伸10 min。分別取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于含溴化乙錠1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，用成像系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行成像和熒光密度掃描分析。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工生物技術(shù)公司測序，并通過BLAST分別比對鴨梨Actin及LOX基因與其他植物同源性。

1.4數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及作圖，用DPS 7.05進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1不同降溫方法對不同成熟度采后鴨梨果實(shí)呼吸強(qiáng)度、乙烯釋放量及LOX活性的影響

圖1　緩慢降溫和急速降溫處理對不同采收成熟度鴨梨采后各指標(biāo)的影響Fig.1　Effects of slow cooling and rapid cooling on postharvest physiology and biochemistry of Yali pears of different maturities

鴨梨是典型的呼吸躍變型果實(shí)，貯藏過程中明顯的呼吸強(qiáng)度及乙烯釋放量高峰是其成熟和衰老的重要標(biāo)志［18］。由圖1可知，采收初期（貯藏0 d），田間熱尚未散去，且各成熟度鴨梨衰老程度低，因而其果實(shí)呼吸強(qiáng)度高、乙烯釋放量少，LOX活性處于較低水平。與急速降溫相比，緩降處理果經(jīng)歷了長時(shí)間（30 d）的高溫度（2～12 ℃）階段，高環(huán)境溫度造成了貯藏20、40 d時(shí)早采和中采緩降果相對于急降果較高的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量；該階段各處理果心部位LOX活性緩慢上升，各緩降果活性低于相同成熟度條件下急降果。

隨著貯藏時(shí)間延長，早采果、中采果及晚采果分別于貯藏80、60 d和40 d出現(xiàn)LOX活性及乙烯、呼吸代謝高峰，果心LOX活性與果實(shí)呼吸和乙烯釋放高峰出現(xiàn)時(shí)間相吻合。整個(gè)貯藏期間緩慢降溫果的呼吸強(qiáng)度及乙烯釋放量變化更為緩和，LOX活性及呼吸、乙烯代謝整體水平低于同期采收急速降溫果；相同降溫方式下中采果呼吸強(qiáng)度、乙烯釋放量及LOX活性峰值較低，且貯藏期間整體處于較低水平。貯藏期間緩慢降溫果呼吸、乙烯及LOX代謝水平較低，可能是由于緩慢降溫延緩了溫度驟變引起的膜脂過氧化作用［19］，并進(jìn)一步降低了果實(shí)生理代謝水平。該結(jié)論與李曉丹等［20］研究的緩慢降溫抑制鴨梨果心及果肉部LOX活性等結(jié)論一致。

2.2不同降溫方法對不同成熟度的采后鴨梨果心褐變指數(shù)的影響

圖2　兩種降溫方式對不同成熟度鴨梨采后果心褐變的影響Fig.2　Effects of two cooling methods on postharvest core browning index of Yali pears of different maturities

如圖2所示，早采果、中采果和晚采果分別于貯藏40、20 d和20 d開始出現(xiàn)果心褐變。隨著貯藏時(shí)間的延長，鴨梨果心褐變指數(shù)呈現(xiàn)不同程度的增長趨勢。其中，中采果褐變指數(shù)增長趨勢最為緩和，早采次之，晚采果增長趨勢最明顯。同一貯藏期，相同降溫方式下各采收期褐變指數(shù)大小為晚采果＞早采果＞中采果、同采收期褐變指數(shù)急速降溫果＞緩慢降溫果。貯藏期結(jié)束，急速降溫處理（緩慢降溫處理）的早采果、中采果和晚采果的褐變指數(shù)分別達(dá)到0.6（0.312）、0.367（0.319）、0.667（0.9），早期采收及中期采收結(jié)合緩慢降溫處理褐變指數(shù)顯著低于其他處理（P＜0.05）。閆師杰［21］、何利華［22］及王志華［23］等的研究均證實(shí)，適宜成熟度采收結(jié)合緩慢降溫能有效延緩果實(shí)衰老、抑制鴨梨貯藏期間果心褐變的發(fā)生。

2.3鴨梨LOX基因保守序列的擴(kuò)增及測序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測分析，在500 bp左右出現(xiàn)一條特異條帶，與理論上擴(kuò)增的片段大小相符，且條帶清晰（圖3）。圖3的PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測序，測序結(jié)果如圖4所示，片段長度為473 bp。使用NCBI中BLAST程序?qū)υ摵怂嵝蛄信c其他物種的LOX基因進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示：該核酸序列和已經(jīng)報(bào)道的沙梨（登錄號：EF215449.1）、蘋果（登錄號：001294101.1）的LOX基因cDNA序列的一致性分別達(dá)到99%、99%。可以確定該核酸序列與其他物種LOX基因具有同源性，本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增得到的片段為鴨梨LOX基因的cDNA片段。圖5為目的序列與沙梨、蘋果LOX基因cDNA序列的比對結(jié)果。

圖3　鴨梨LOX基因RT-PCR產(chǎn)物圖Fig.3　The Yali pear product of RT-PCR

圖4　鴨梨cDNA序列及推測的氨基酸序列Fig.4　The nucleotide sequence of LOX and the deduced amino acid sequence of Yali pear

圖5　目的片段與沙梨及蘋果LOX基因BLAST比對Fig.5　Alignment between the query and the LOX gene of Pyrus pyrifolia and Malus

2.4不同降溫方法對不同成熟度鴨梨果實(shí)中LOX基因表達(dá)量的半定量分析

2.4.1內(nèi)參基因Actin的PCR擴(kuò)增及測序結(jié)果分析

以鴨梨總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行Actin基因的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示擴(kuò)增出的特異性片段大小為297 bp，與預(yù)期大小相符（圖6）。

圖6　鴨梨Actin基因的RT-PCRFig.6　RT-PCR product of actin of Yali pear

圖7　鴨梨Actin cDNA核苷酸序列Fig.7　Nueleotide sequence of Actin cDNA of Yali pear

將圖6中的PCR產(chǎn)物送樣測序，測序結(jié)果見圖7。之后根據(jù)NCBI中BLAST比對核苷酸序列，結(jié)果表明克隆所得序列與薔薇屬（Rosa hybrid）、梨屬（Pyrus bretschneideri）、葡萄（Vitis vinifera）的堿基序列同源性達(dá)87%，與李屬（Prunus salicina）、蘋果（Malus domestica）的堿基相似性高達(dá)88%以上。而與楊樹（Populus tomentosa）、大豆（Glycine max）、柳樹（Salix miyabeana）、栗樹（Castanea sativa）等的相似性也達(dá)86%以上。

2.4.2鴨梨果實(shí)中LOX基因表達(dá)量的半定量分析

圖8　兩種降溫方式不同成熟度鴨梨貯藏過程中LOX基因RT-PCR表達(dá)量分析Fig.8　Semi-quantitative RT-PCR analysis of LOX expression in Yali pears of different maturities under two cooling methods during storage

用改良CTAB法提取不同降溫方法處理的不同成熟度鴨梨采后0～180 d 10 個(gè)采樣點(diǎn)的果肉、果心中的總RNA，經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，總RNA的純度和完整性達(dá)到了圖6的結(jié)果，然后通過半定量RT-PCR分析LOX基因的表達(dá)量差異。如圖8所示，對比各貯藏期不同處理果心及果肉部電泳結(jié)果，可以得出：鴨梨果肉及果心部LOX基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先緩慢上升至高峰后逐漸下降、貯藏末期又上升的趨勢，與貯藏期間各處理果心部LOX活性變化趨勢一致；貯藏期間，中采鴨梨果心LOX基因表達(dá)量整體小于早采和晚采鴨梨果心，急速降溫鴨梨果心部LOX基因表達(dá)量高于緩慢降溫鴨梨；各貯藏期內(nèi)，鴨梨果肉部LOX基因表達(dá)量小于果心。

結(jié)合圖1、2所示的貯藏期間果實(shí)生理代謝變化，發(fā)現(xiàn)LOX基因的表達(dá)模式與LOX活性及鴨梨果心褐變指數(shù)變化趨勢相一致；貯藏期間，采取不同降溫方法的不同成熟度鴨梨果實(shí)的LOX活性與乙烯釋放量峰值同時(shí)出現(xiàn)，鴨梨LOX基因可能是隨著乙烯合成產(chǎn)生作用，但對于LOX與乙烯的調(diào)控機(jī)理與關(guān)系，尚未有確切的闡述［24-25］。

3　結(jié) 論

綜合比較2 種降溫方式下不同采收成熟度鴨梨生理指標(biāo)變化可以看出，適宜成熟度采收（中采）結(jié)合緩慢降溫，在延緩果實(shí)各生理指標(biāo)（呼吸強(qiáng)度、乙烯釋放量及果心LOX活性）高峰出現(xiàn)的同時(shí)，有效地降低了其貯藏期間生理代謝水平，并進(jìn)一步減少了果心褐變發(fā)生，為鴨梨采后較適宜的抑制果心褐變的處理方法。

通過對鴨梨LOX基因cDNA進(jìn)行克隆、測序，并與其他植物L(fēng)OX基因的同源性分析，確定了獲得的cDNA為鴨梨LOX基因的cDNA片段，鴨梨LOX基因?yàn)長OX基因家族一員。通過對不同貯藏期鴨梨果肉及果心部位LOX活性及鴨梨果心褐變指數(shù)變化趨勢相一致。LOX基因參與了鴨梨采后貯藏期間果心褐變的發(fā)生進(jìn)程，具體的發(fā)生機(jī)理仍待進(jìn)一步研究和確定。

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［24］ 張瑩瑩， 任小林， 王雷存， 等. 蘋果果實(shí)發(fā)育及成熟軟化過程中LOX的活性特點(diǎn)［J］. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2010， 19（9）: 159-162. DOI:10.3969/ j.issn.1004-1389.2010.09.032.

［25］ 張瑩瑩. 蘋果脂氧合酶基因克隆及其表達(dá)特性研究［D］. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2010.

LOX Gene Expression and Its Relationship with Core Browning of Yali Pear under Different Harvest and Storage Conditions

HAN Yunyun1， SONG Fangyuan2， HAN Yanwen1， LI Ling3，4， YAN Shijie3，4，*
（1. College of Horticulture and Landscape， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China；2. Institute of Agricultural Products Processing， Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science， Shihezi 832000， China；3. College of Food Science and Biotechnology， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China；4. Tianjin Engineering and Technology Research Centre of Agricultural Products Processing， Tianjin 300384， China）

Hebei-grown Yali pears （Pyrus bretschneideri Rehd cv. Yali） of different maturities were stored at （0 ± 1） ℃directly or after pre-cooling at gradually decreasing temperature. Changes in respiration intensity， ethylene production and core browning index and lipoxygenase （LOX） activity and LOX gene expression pattern during storage were determined and the relationship of LOX gene expression with core browning was studied as well. The results showed that during storage，the decreasing order of LOX activity and core-browning index was as follows: late-harvested fruit ＞ early-harvested fruit ＞middle-harvested fruit， as well as rapid-cooling fruit ＞ slow-cooling fruit. The expression level of LOX gene in core tissues initially increased slowly， then declined， and increased again until the end of storage. The expression level of LOX gene in rapid-cooling fruits was higher than in slow-cooling fruits， and the expression level of LOX gene in middle maturity fruits was lower than in fruits of early and late maturities. Middle-maturity harvest combined with slow pre-cooling inhibited the LOX gene expression of flesh and core tissues， thereby suppressing core browning of Yali pears. LOX activity and the gene expression level of LOX were coordinated with core browning index， suggesting that the expression level of this gene was correlated closely with core browning of Yali pears.

Yali pear； lipoxygenase； core browning； gene expression； core browning index

10.7506/spkx1002-6630-201618035

S609.3

A

1002-6630（2016）18-0216-07

韓云云， 宋方圓， 韓艷文， 等. 不同采收貯藏條件下鴨梨果實(shí)LOX基因表達(dá)及其與果心褐變的關(guān)系［J］. 食品科學(xué)， 2016，37（18）: 216-222. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618035. http://www.spkx.net.cn

HAN Yunyun， SONG Fangyuan， HAN Yanwen， et al. LOX gene expression and its relationship with core browning of Yali pear under different harvest and storage conditions［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 216-222. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618035. http://www.spkx.net.cn

2016-03-08

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471630）

韓云云（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣哔A藏保鮮。E-mail：1461871540@qq.com

閆師杰（1971—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏、食品質(zhì)量與安全。E-mail：yanshijie@126.com