殷智宇 楚帥帥 孫青 李璐 顧小萍 馬正良

[摘要] 目的 研究鞘內注射Caspase-6抑制劑Z-VEID-FMK對小鼠福爾馬林炎性痛的影響。 方法 采用小鼠右后足底皮內注射5%福爾馬林溶液建立疼痛模型，32只小鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分成四組：空白組、溶媒組、低劑量組和高劑量組，每組8只?？瞻捉M僅建立疼痛模型，溶媒組、低劑量組和高劑量組分別鞘內注射20%二甲基亞砜（DMSO）、5 μg Z-VEID-FMK和10 μg Z-VEID-FMK，給藥體積為5 μL，隨后建立疼痛模型。觀察福爾馬林炎性痛小鼠舔/咬腳時間，比較模型建立前及建立后60 min小鼠足底的厚度。 結果 各組小鼠足底皮內注射福爾馬林后均出現(xiàn)明顯的雙時相疼痛反應，在一相痛中，低劑量組[（88.88±6.98）s]、高劑量組[（90.09±8.49）s]與溶媒組[（90.50±11.18）s]小鼠舔/咬腳時間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；在二相痛中，與溶媒組[（220.25±80.80）s]比較，低劑量組[（81.25±14.10）s]、高劑量組[（50.63±10.77）s]小鼠舔/咬腳時間均顯著縮短，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。與溶媒組[（1.78±0.02）mm]比較，低劑量組[（1.31±0.07）mm]及高劑量組[（1.11±0.08）mm]小鼠足底腫脹顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。 結論 Caspase-6抑制劑Z-VEID-FMK可以緩解小鼠福爾馬林炎性痛，可能與其抑制炎性因子作用有關。

[關鍵詞] Caspase-6；Z-VEID-FMK；福爾馬林炎性痛；足底厚度

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（c）-0031-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of intrathecal injection Caspase-6 inhibitor Z-VEID-FMK on mice with formalin inflammatory pain. Methods The pain model was established by subcutaneous injection 5% formalin in mouse′ right plantar. 32 mice were divided into four groups： control group， vehicle group， low-dose group， high-dose group according to random number table method， each group had 8 mice. Pain model was established only in control group. Vehicle group， low-dose group and high dose group was intrathecal injected 20% DMSO， 5 μg Z-VEID-FMK and 10 μg Z-VEID-FMK （the volume was 5 μL） respectively， followed by the establishment of pain model. The mice licking/biting foot time with formalin inflammatory pain was observed. Meanwhile， the foot thickness of mice before and 60 min after establishment of formalin pain model was compared. Results All mice displayed apparent dual-phase pain response after subcutaneously injected formalin. In phase-1， there were no significant differences on mice licking/biting foot times among low-dose group [（88.88±6.98） s]， high dose group [（90.09±8.49） s] and vehicle group [（90.50±11.18） s] （P > 0.05）. In phase-2， compared with vehicle group [（220.25±80.80） s]， mice licking/biting foot times of low-dose group [（81.25±14.10） s] and high-dose group [（50.63±10.77） s] were significantly shorten， with statistical differences （P < 0.01）. Compared with vehicle group [（1.78±0.02） mm]， plantar thickness of mice in low-dose group [（1.31±0.07） mm] and high-dose group [（1.11±0.08） mm] were significantly reduced， with statistical differences （P < 0.01）. Conclusion Caspase-6 inhibitor Z-VEID-FMK can relieve formalin inflammatory pain and may be related to its anti-inflammatory effect.

[Key words] Caspase-6； Z-VEID-FMK； Formalin inflammatory pain； Plantar thickness

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（cystein-containing aspartate-specific protease，Caspase）是半胱氨酸蛋白酶家族中的一員，在調節(jié)細胞凋亡、神經退行性變及炎性反應中有著重要的作用[1]。已有研究表明，Caspase家族中的Caspase-1和Caspase-3通過調節(jié)白介素（IL）-1β和神經元凋亡參與神經病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展[2]。Caspase-6屬于效應Caspase分子，存在于神經元軸突中，與神經元軸突退行性變密切相關，在老年個體中，Caspase-6與阿爾茲海默?。ˋD）病理學及記憶力下降密切相關[3]，以往研究主要集中于AD等神經變性疾病及腫瘤方面作用[4-5]，但在其他領域研究較少。Caspase-6在大腦組織和外周組織中有廣泛表達[6-7]。有實驗研究顯示，Caspase-6蛋白存在于脊髓背角[8]，因此，推測Caspase-6參與了脊髓疼痛信號傳遞。本實驗擬通過觀察鞘內注射Caspase-6抑制劑Z-VEID-FMK對小鼠福爾馬林炎性痛的影響，初步探求Caspase-6在炎性疼痛中的作用，為進一步驗證Caspase-6參與脊髓疼痛信號傳遞提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

32只健康成年雄性ICR小鼠，6～8周，體重30～35 g，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供[動物合格證號：SKXK（蘇）2012-0004]。飼養(yǎng)環(huán)境室溫控制在20～24℃，小鼠自由飲食，待適應環(huán)境5 d后用于實驗。

1.2 實驗分組

采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為空白組、溶媒組、低劑量組（5 μg Z-VEID-FMK）及高劑量組（10 μg Z-VEID-FMK），每組8只小鼠?？瞻捉M小鼠不注射藥物，溶媒組小鼠鞘內注射20%二甲基亞砜（DMSO），低劑量組小鼠鞘內注射5 μg Z-VEID-FMK，高劑量組小鼠鞘內注射10 μg Z-VEID-FMK。給藥后10 min，小鼠右后足底皮內注射5%福爾馬林溶液建立福爾馬林炎性痛模型。研究遵循有關實驗動物保護和使用的指南，并經單位實驗動物倫理委員會批準。

1.3 實驗方法及觀察指標

1.3.1 實驗儀器及材料 Z-VEID-FMK（Caspase-6抑制劑，Sigma公司），DMSO（北京舒伯偉化工儀器有限責任公司），甲醛溶液（36%～37%，Sigma公司），千分尺（Deshen，中國，0.01 mm）。Z-VEID-FMK首先溶解于DMSO中，隨后用生理鹽水（NS）稀釋，最終溶劑濃度20%DMSO。取0.5 mL的甲醛溶液稀釋于9.5 mL的NS中，配成5%的福爾馬林溶液。

1.3.2 小鼠鞘內注射方法 按壓小鼠腰骶兩側固定，自L4～L5棘突間進針，以鼠尾突然出現(xiàn)側向運動為注射成功標志。用微量進樣器進行注射，注射藥物容積為5 μL，注射時間10 s，留針10 s。

1.3.3 福爾馬林炎性痛模型制作及疼痛測定 福爾馬林實驗根據(jù)Hunskaar等[9]描述的方法進行，具體方法是將小鼠單獨置于玻璃燒杯中，使其適應環(huán)境30 min，鞘內注射藥物或溶媒后10 min，先固定小鼠，消毒小鼠右后肢，在右后足足底中部皮內注射25 μL的5%福爾馬林溶液，使其局部產生紅、腫、熱、痛等炎性反應，隨后將小鼠放置于燒杯中，在燒杯底下放一面鏡子以便清晰觀察小鼠的右后爪，用秒表記錄每5分鐘小鼠舔/咬腳的時間作為疼痛的指標。

1.3.4 足底腫脹程度測定 根據(jù)Winter等[10]所描述的方法，測量小鼠福爾馬林足底腫脹厚度，作為藥物抗炎作用的指標。小鼠足底皮內注射福爾馬林（5%，25 μL）后注射部位產生水腫，測量福爾馬林注射前和注射后60 min足背-足底軸的厚度。腫脹程度計算：Δ腫脹=V2-V1（V1：足底注射福爾馬林前的厚度；V2：足底注射福爾馬林后的厚度）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用重復測量方差分析或單因素方差分析，兩兩比較采用post hoc分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鞘內注射Z-VEID-FMK對小鼠福爾馬林炎性痛舔/咬腳時間的影響

小鼠模型建立后，0～5 min產生顯著的一相痛反應，靜息期無顯著疼痛反應；10～45 min產生顯著的二相痛。整體分析顯示：組間比較（F = 59.053，P < 0.01）、時間點比較（F = 157.037，P < 0.01）、分組與時間的交互作用比較（F = 5.209，P < 0.01）差異均有統(tǒng)計學意義。精細比較：空白組與溶媒組各個時間點的兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；福爾馬林注射后15～35 min，溶媒組、低劑量組、高劑量組兩兩比較，小鼠舔/咬腳時間差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；低劑量組及高劑量組舔/咬腳時間均短于空白組及溶媒組（P < 0.05），且高劑量組舔/咬腳時間短于低劑量組（P < 0.05）。見圖1。

在一相痛中，四組小鼠舔/咬腳時間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；在二相痛中，與空白組及溶媒組比較，低劑量組小鼠舔/咬腳時間顯著縮短，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），高劑量組小鼠舔/咬腳時間顯著縮短，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。低劑量組與高劑量組兩兩比較差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），說明Z-VEID-FMK抑制小鼠福爾馬林炎性痛反應的效果呈劑量依賴性。見表1。

2.2 鞘內注射Z-VEID-FMK對小鼠福爾馬林炎性痛模型足底腫脹的影響

注射福爾馬林后，小鼠足底產生明顯紅腫，空白組及溶媒組小鼠的足底腫脹值分別為（1.78±0.04）、（1.78±0.02）mm，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。與溶媒組比較，低劑量組[（1.31±0.07）mm]、高劑量組[（1.11±0.08）mm]小鼠足底腫脹值顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見圖2。

3 討論

Caspase成員具有相似的氨基酸序列、結構和底物特異性，通常以酶原的形式存在。按效應可分為兩類：一類是上游啟動者Caspases，如Caspase-8、9，可裂解并激活其他Caspase；另一類是下游效應者Caspases，主要包括Caspase-3、6、7，可裂解各種底物，分解細胞結構或使酶失活[11]。近年來，Caspase-6的重要作用逐漸被研究者發(fā)現(xiàn)，除了參與細胞凋亡外，在神經退行性變、免疫炎癥、腫瘤、增殖等方面均有重要的作用。

足底皮內注射福爾馬林是一個經典的炎性痛模型，本實驗小鼠注射福爾馬林后，注射足表現(xiàn)出縮腿、舔爪及顫抖等反應，對傷害性刺激的行為學反應的表現(xiàn)分為兩個不同的時間段，與文獻報道一致，說明福爾馬林小鼠致痛模型的復制是成功的[12]。一相痛為0～5 min，主要與福爾馬林對外周C纖維的直接刺激及神經末梢釋放致痛物質有關，屬于非炎性痛；二相痛為10～45 min，主要由外周及脊髓的炎性因子[例如IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α等]釋放產生，屬于炎性痛[13-14]?？偟膩碚f，中樞性鎮(zhèn)痛藥可以抑制一相痛及二相痛，外周性鎮(zhèn)痛藥只能抑制二相痛[15]。溶媒組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義，說明鞘內注射溶媒不影響小鼠疼痛行為。本研究結果顯示，鞘內注射Z-VEID-FMK對小鼠一相痛沒有顯著影響，但是劑量依賴性地抑制二相痛，說明Caspase-6主要參與了福爾馬林炎性痛的中樞敏化及炎性反應的過程。傅開元等[16]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠足底皮內注射福爾馬林引起的炎性損傷可以導致脊髓角Fas/Fas-L途徑的神經元凋亡。Woolf等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在外周神經損傷的大鼠神經病理性疼痛模型中，脊髓背角淺層神經元發(fā)生凋亡后留下空隙，脊髓深層未受到損傷的神經纖維可通過芽生的方式，使軸突伸入脊髓背角淺層，與淺層的傷害性神經元構成新的突觸聯(lián)系，使傷害性刺激信息傳導通路發(fā)生異常放電，引起神經興奮性升高，產生痛覺過敏或痛覺異常。Moore等[18]研究報道，外周損傷引起脊髓后角凋亡的神經元可能為抑制性中間神經元，而抑制性中間神經元的減少使脊髓后角傳導痛覺的傷害性神經元異常興奮，可表現(xiàn)為痛覺過敏。吳飛翔[19]研究顯示，與Caspase-6同為Caspase效應酶的Caspase-3可通過增加TNF-α的表達從而增加細胞凋亡產生神經病理性疼痛，因此推測Caspase-6或許通過增加炎癥介質（IL-1β、TNF-α）釋放、活化膠質細胞、誘導神經元凋亡等參與福爾馬林炎性疼痛過程，具體機制仍有待進一步研究。

本實驗結果還顯示，鞘內注射Z-VEID-FMK可以劑量依賴性地抑制福爾馬林導致的小鼠足底腫脹。福爾馬林引起的足底局部組織水腫與某些炎癥介質如組胺、緩激肽等介導血管擴張與滲出有關[20]，在炎癥狀態(tài)下神經末梢會分泌P物質等神經介質，促進局部血管擴張，增加滲出，加重局部組織腫脹。抑制神經末梢某些促炎性因子（IL-1β、TNF-α）或神經介質（P物質）的釋放可能是鞘內注射Z-VEID-FMK抑制足底腫脹的機制。

綜上所述，Caspase-6抑制劑Z-VEID-FMK可以緩解小鼠福爾馬林炎性痛，減輕小鼠足底腫脹，可能與其抑制炎性因子作用有關。

[參考文獻]

[1] Graham RK，Ehrnhoefer DE，Hayden MR. Caspase-6 and neurodegeneration [J]. Trends Neurosci，2011，34（12）：646-656.

[2] Scholz J. Blocking caspase activity prevents transsynaptic neuronal apoptosis and the loss of inhibition in lamina Ⅱ of the dorsal horn after peripheral nerve injury [J]. J Neurosci，2005，25（32）：7317-7323.

[3] LeBlanc AC，Ramcharitar J，Afonso V，et al. Caspase-6 activity in the CA1 region of the hippocampus induces age-dependent memory impairment [J]. Cell Death Differ，2014，21（5）：696-706.

[4] Linder M，Tschernig T. Vasculogenic mimicry：possible role of effector caspase-3，caspase-6 and caspase-7 [J]. Ann Anat，2016，204：114-117.

[5] Graham RK，Deng Y，Carroll J，et al. Cleavage at the 586 amino acid caspase-6 site in mutant huntingtin influences caspase-6 activation in vivo [J]. J Neurosci，2010，30（45）：15019-15029.

[6] Albrecht S，Bourdeau M，Bennett D，et al. Activation of caspase-6 in aging and mild cognitive impairment [J]. Am J Pathol，2007，170（4）：1200-1209.

[7] Baburamani AA，Miyakuni Y，Vontell R，et al. Does caspase-6 have a role in perinatal brain injury？[J]. Dev Neurosci，2015，37（4-5）：321-337.

[8] 王運盛.DR6與Caspase-6在PrP106-126誘導大鼠脊髓神經元軸突變性過程中的調控機制[D].北京：中國農業(yè)大學，2015.

[9] Hunskaar S，F(xiàn)asmer OB，Hole K. Formalin test in mice，a useful technique for evaluating mild analgesics [J]. J Neurosci Methods，1985，14（1）：69-76.

[10] Winter CA，Risley EA，Nuss GW. Carrageenin-induced edema in hind paw of rats as an assay for anti-inflammatory drug [J]. Proc Soc Exp Biol Med，1962，111（23）：544-547.

[11] Puccini J，Kumar S. Caspases [J]. Encyclopedia Cell Biol，2016，3（1）：364-373.

[12] Zhang Y，Wang C，Wang L，et al. Novel analgesic isolated from a traditional Chinese medicine [J]. Curr Biol，2014， 24（2）：117-123.

[13] Abbott FV，F(xiàn)ranklin KB，Westbrook RF. The formalin test：scoring properties of the first and second phases of the pain response in rats [J]. Pain，1995，60（1）：91-102.

[14] Tjolsen A，Berge OG，Hunskaar S，et al. The formalin test：an evaluation of the method [J]. Pain，1992，51（1）：5-17.

[15] Holanda AD，Asth L，Santos AR，et al. Central adenosine A1 and A2A receptors mediate the antinociceptive effects of neuropeptide S in the mouse formalin test [J]. Life Sci，2015，120：8-12.

[16] 傅開元，張非煜，候波，等.福爾馬林致炎癥疼痛動物脊髓后角神經元凋亡[J].中國疼痛醫(yī)學雜志，2005，11（1）：25-28.

[17] Woolf CJ，Shortland P，Coggeshall RE. Peripheral nerve injury tiggers central sproting of myelinated afferents [J]. Nature，1992，355（6355）：75-78.

[18] Moore KA，Kohno T，Karchewski LA，et al. Partial peripheral nerve injury promotes a selective loss of GABAergic inhibition in the superficial dorsal horn of the spinal cord [J]. J Neurosci，2002，22（15）：6724-6731.

[19] 吳飛翔.Caspase-3凋亡通路參與神經病理性疼痛及其相關機制的研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學，2008.

[20] Damas J，Liégeois JF. The inflammatory reaction induced by formalin in the rat paw [J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，1999，359（3）：220-227.

（收稿日期：2015-12-06 本文編輯：李亞聰）