胡洋 張龍 李旺 魏峰 豐偉 田新華

[摘要] 目的 探討TTA1、Tat、聚乙二醇（PEG）修飾的明膠硅氧烷納米粒子（GS NPs）結合siRNA-EGFR轉染C6細胞，抑制其表皮生長因子受體（EGFR）表達的影響。 方法 根據鼠EGFR的mRNA序列設計合成siRNA-EGFR以及陰性對照siRNA-Scr（無意義序列）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs通過靜電作用結合siRNA。實驗分4組：Control組、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組及X-tremeGene/siRNA-EGFR組。除Control組外，其余三組均在體外對C6細胞進行轉染。Real-time PCR、Western blot分別檢測細胞EGFR mRNA及蛋白表達情況；CCK-8法、流式細胞儀分別檢測細胞增殖和凋亡情況。 結果 與Control組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組比較，TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組在體外細胞水平上能有效抑制C6細胞EGFR mRNA及蛋白的表達（P < 0.01），同時抑制C6細胞的增殖（P < 0.05或P < 0.01）并促進其凋亡（P < 0.01）。此外，X-tremeGene/siRNA-EGFR組和TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組在下調C6細胞EGFR水平、抑制細胞增殖及促進細胞凋亡方面差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結論 TTA1-Tat-PEG-GS NPs可能成為一種新型的基因治療載體，為膠質瘤基因治療的進一步研究提供理論依據。

[關鍵詞] 膠質瘤；納米粒子；基因載體；RNA干擾

[中圖分類號] R739.41 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（c）-0004-05

Research of TTA1-Tat-PEG-GS NPs combined with siRNA-EGFR in transfection of C6 cells and inhibiting its EGFR gene expression

HU Yang1 ZHANG Long1 LI Wang1 WEI Feng2 FENG Wei2 TIAN Xinhua2

1.Medical College， Xiamen University， Fujian Province， Xiamen 361004， China； 2.Department of Neurosurgery， Zhongshan Hospital Affiliated to Xiamen University， Fujian Province， Xiamen 361004， China

[Abstract] Objective To investigate the property of TTA1-Tat-PEG modified gelatin-siloxane nanoparticles （GS NPs） combined with siRNA-EGFR in transfection of C6 cells and inhibiting its EGFR gene expression. Methods The siRNA-EGFR and negative control sequences （siRNA-Scr） were designed and synthesized according to the EGFR mRNA sequence of rats. TTA1-Tat-PEG-GS NPs bound to siRNA via electrostatic interaction. The composites of experiment included control group， TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr group， TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR group and X-tremeGene/siRNA-EGFR group. C6 cells were transfected in all groups except for those in the control group. Real-time PCR and Western blot were used to detect EGFR mRNA and protein levels， respectively. The proliferation and apoptosis were detected with CCK-8 and flowcytometry， respectively. Results Compared with control group and TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr group， TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR group could inhibit the expression of EGFR mRNA and protein of C6 cells （P < 0.01）， restrain the proliferation of C6 cells （P < 0.05 or P < 0.01） and promote its apoptosis （P < 0.01）. In addition， there were no statistically significant differences between X-tremeGene/siRNA-EGFR group and TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR group in decreasing the EGFR levels of C6 cells， inhibiting the cell proliferation and promoting the cell apoptosis （P > 0.05）. Conclusion TTA1-Tat-PEG-GS NPs may be a novel gene carrier and provide theoretical foundation for the further research of glioma gene therapy.

[Key words] Glioma； Nanoparticles； Genetic vector； RNA interference

膠質瘤是最常見的顱內惡性腦腫瘤之一，整體的預后及治療效果不理想[1-2]，尋找有效的治療方法成為當務之急。近年來，基因治療膠質瘤研究成為一大熱點[3]，RNA干擾（RNAi）就是基因治療中極具前景的手段之一[4]。表皮生長因子受體（EGFR）在促進腫瘤細胞增殖及抑制凋亡等方面均發(fā)揮重要作用[5]。Wang等[6]認為，EGFR在惡性膠質瘤細胞中常出現擴增、突變以及過表達。應用RNAi降低膠質瘤細胞EGFR的表達，有望成為一個重要的治療途徑[7]?；蛑委煹年P鍵因素之一是基因載體，目前主要使用的載體為病毒載體[8]，但由于其安全性差、靶向能力差等原因限制了其應用[9]，因此非病毒基因載體成為一條新的研究途徑[10]，然而能具備跨血腦屏障及高效基因轉染能力的非病毒基因載體仍不多見[11-12]。GSNPs是一種新穎的納米復合物，以GSNPs為載體骨架，修飾上可延長循環(huán)時間的聚乙二醇（PEG），并通過ERP效應（選擇性高通透性和滯留性）在腫瘤組織中蓄積[13-14]；在修飾上具有高特異性靶向膠質瘤細胞的適配體TTA1[15]和具有強效穿膜能力的Tat[16]，設計成新型的TTA1-Tat-PEG-GS NPs基因載體。本研究以高表達EGFR的C6細胞為實驗對象，以TTA1-Tat-PEG-GS NPs為載體結合siRNA，在體外轉染C6細胞干擾EGFR基因表達，從而證明TTA1-Tat-PEG-GS NPs可作為一種新型的基因載體，為膠質瘤基因治療的進一步研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

C6細胞購于上海美軒公司；明膠購于美國BBI公司；PEG購于美國DOW公司；適配體TTA1（CCTGCACTTGGCTTGGATTTCAGAAGGGAGACCC）、Tat（KYGRRRQRRKKRGC）多肽購于上海生工公司。X-tremeGene轉染試劑購于北京索萊寶公司；Trizol購于美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒以及Real-time PCR試劑盒購于日本Takara公司；抗體購于美國Abcam公司；CCK-8試劑盒購于天津百螢生物公司；ANNEXINV/PI試劑盒購于北京拜爾迪生物公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設計與合成 根據Genbank提供的鼠EGFR mRNA序列（NM_031507.1），設計靶向EGFR mRNA的序列為5'-GGAATTATGACCTTTCCTT-3'，陰性對照序列（Scramble）為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'，委托上海吉瑪公司合成相應siRNA。

1.2.2 TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA的結合及結合比例選擇 參考Wang等[17]及張龍等[18]方法合成GS NPs，依次修飾上PEG、TTA1、Tat，得到TTA1-Tat-PEG-GS NPs，再結合siRNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測TTA1-Tat-PEG-GS NPs與siRNA的結合能力：兩者分別以20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1的質量比制備懸液，均勻混合后上樣至瓊脂糖凝膠開始電泳，電壓80 V，時間20 min。分別取上述TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA復合物懸液置于表面電位儀上，測定表面粒徑、分散系數和電位。

1.2.3 C6細胞的轉染 實驗分四組：Control組（正常培養(yǎng)的C6細胞），TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組（TTA1-TAT-PEG-GS NPs轉染Scramble序列），TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組（TTA1-Tat-PEG-GS NPs轉染EGFR干擾序列）及X-tremeGene/siRNA-EGFR組（X-tremeGene Reagent轉染EGFR干擾序列）。取對數生長期細胞1.0×105/孔接種于6孔板中，待細胞貼壁達0.50融合度后，TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組細胞更換無血清培養(yǎng)基，分別加入TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scramble及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR復合物（根據方法“1.2.2”結果確定結合比例），共培養(yǎng)10 h更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。X-tremeGene/siRNA-EGFR組轉染嚴格按照X-tremeGene說明書中操作指南進行。

1.2.4 Real-time PCR檢測C6細胞EGFR mRNA水平 轉染48 h后，分別消化收集各組細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA，并按照TaKaRa試劑盒說明進行操作。實驗均重復3次（擴增EGFR的引物為：上游5'-GCCACAGGTTCCGAGATGAA-3'，下游5'-CCACGTAGTTTCTGGGGCAT-3'。用β-actin作內參，其引物序列為：上游5'-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3'，下游5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'）。

1.2.5 Western blot檢測C6細胞EGFR蛋白表達水平 轉染72 h后，分別消化收集各組細胞，離心棄去上清后加入RIPA細胞裂解液以及蛋白酶抑制劑PMSF。置于冰上30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清測定蛋白濃度。取50 μg蛋白加入到上樣緩沖液中，經100℃金屬浴加熱5 min變性后用SDS-PAGE電泳。常規(guī)轉膜及封閉后，分別加入抗EGFR或β-actin的一抗，4℃孵育過夜。TBST洗脫10 min×3次，加入二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗脫10 min×3次。硝酸纖維素膜加入顯色液后，ECL化學發(fā)光顯像，圖像分析儀分析結果。實驗均重復3次。

1.2.6 CCK-8實驗檢測C6細胞增殖能力 轉染48 h后，分別消化收集各組細胞，調整密度至5×104細胞/mL，各取100 μL細胞懸液/孔加入到5個96孔板中，每組設3個復孔。24 h后，取出1個96孔板，往每孔中加入10 μL CCK8試劑，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀測定450 nm處吸光值。每隔24 h采用同樣的方法取1個96孔板檢測，連續(xù)測5 d。

1.2.7 流式細胞術檢測C6細胞的凋亡 轉染48 h后，分別消化收集各組細胞，調整密度至1×106細胞/mL，取0.5 mL細胞懸液，室溫1200 r/min離心3 min，去上清后再用200 μL預冷的1×結合緩沖液輕輕重懸。加入10 μL AnnexinV-FITC，室溫避光反應15 min，室溫1000 r/min離心5 min，洗滌1次，用500 μL 1×結合緩沖液重懸細胞，加入10 μL碘化丙啶（PI），4℃避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測分析凋亡情況。實驗均重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行數據處理，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TTA1-Tat-PEG-GS NPs與siRNA的結合比例

當TTA1-Tat-PEG-GS NPs與siRNA的質量比為100時，TTA1-Tat-PEG-GS NPs可將siRNA完全結合（圖1）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA的表面電位隨著TTA1-Tat-PEG-GS NPs與siRNA質量比的增高而增加，同時粒徑相應減?。ū?）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA以100∶1的質量比進行結合時，復合物粒徑較小，表面電位較高，可完全結合siRNA。

條帶1：mark；條帶2：siRNA；條帶3、4、5、6、7：TTA1-Tat-PEG-GSNPs與siRNA的質量分別比為20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1

圖1 瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA

結合性

表1 TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA納米粒子粒徑、分散系數

和Zeta電位（x±s）

2.2 Real-time PCR檢測C6細胞中EGFR mRNA的相對表達量

Control組、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組及X-tremeGene/siRNA-EGFR組EGFR的mRNA相對表達量分別為（1.005±0.057）、（1.002±0.076）、（0.287±0.022）及（0.249±0.036）（圖2）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組表達水平較Control組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組明顯下調（P < 0.01），而與X-tremeGene/siRNA-EGFR組差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

**P < 0.01

圖2 Real-time PCR檢測四組C6細胞中EGFR mRNA的表達水平

2.3 Western blot檢測C6細胞中EGFR蛋白的表達

TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組蛋白的表達水平較Control組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組明顯下調（P < 0.01），抑制率約為0.70，而與X-tremeGENE/siRNA-EGFR組差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）（圖3）。

**P < 0.01

圖3 Western blot檢測四組C6細胞中EGFR蛋白的表達水平

2.4 C6細胞增殖的檢測

TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組細胞的增殖速度比Control組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組顯著減慢（圖4）。從第3天開始TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組與Control組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組之間差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），并隨時間的延長差異增加（P < 0.01）。而TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組與X-tremeGene/siRNA-EGFR組之間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

*P < 0.05，**P < 0.01

圖4 CCK-8法檢測四組C6細胞的增殖情況

2.5 C6細胞凋亡的檢測

Control組、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組及X-tremeGene/siRNA-EGFR組細胞早期凋亡率分別為（1.61±0.25）、（1.84±0.30）、（9.81±0.47）及（10.40±0.40）（圖5）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組凋亡率較Control組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組明顯增加（P < 0.01），而與X-tremeGene/siRNA-EGFR組差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

3 討論

膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其預后較差，致殘率及病死率都很高[19]。膠質瘤發(fā)生與發(fā)展伴有多種基因改變，因此基因治療提供了一種新的治療策略[20]。在此研究的基礎上，本研究提出一種由TTA1-Tat-PEG-GS NPs結合siRNA與膠質瘤細胞mRNA相互作用的模式。這是一種將具有高特異靶向膠質瘤的TTA1及Tat多肽同時作為靶向基團，連接至GS NPs納米材料上，并對其進行PEG修飾，設計成新型的TTA1-Tat-PEG-GS NPs基因載體。

為了研究新型基因載體TTA1-Tat-PEG-GS NPs結合siRNA是否能影響膠質瘤細胞的生長和生存，本研究利用TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR轉染C6細胞后，通過Real-time PCR、Western blot分別在mRNA水平與蛋白水平檢測了其對EGFR的干擾效果，隨后通過CCK-8實驗檢測了細胞的增殖情況，并用流式細胞術檢測了細胞的凋亡情況。結果顯示：TTA1-Tat-PEG-GS NPs結合siRNA-EGFR轉染C6細胞能夠有效干擾ERGF的表達，EGFR表達下調后可明顯降低C6細胞的增殖能力，并導致細胞凋亡率上升。

總之，本研究建立了一種新的基因載體TTA1-Tat-PEG-GS NPs，它具有體外轉染細胞的能力，并具備靶向傳遞能力以及穿膜功能，這使TTA1-Tat-PEG-GS NPs有可能成為一種獨特的基因傳遞載體，在膠質瘤的基因治療中具有應用潛力。鮮見有文獻報道以TTA1、Tat、PEG修飾的GS NPs作為基因傳遞系統(tǒng)在膠質瘤治療的體內外實驗中使用。然而，這種應用目前只用于體外膠質瘤細胞的siRNA傳遞，還沒有用于體內膠質瘤動物模型。針對裸鼠原位膠質瘤模型的siRNA傳遞的更多研究是筆者正在起步的工作。

[參考文獻]

[1] Dolecek TA，Propp JM，Stroup NE，et al. CBTRUS statistical report：primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009 [J]. Neuro Oncol，2012，14（5）：v1-v49.

[2] Stupp R，Mason WP，van den Bent MJ，et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma [J]. N Engl J Med，2005，352（10）：987-996.

[3] Chen JJ，Juan SY. Editorial（thematic issue：emerging concepts and therapeutics strategies for the treatment of brain tumors）[J]. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry，2014，14（8）：1063-1064.

[4] An S，Jiang XT，Shi JS，et al. Single-component self-assembled RNAi nanoparticles functionalized with tumor-targeting iNGR delivering abundant siRNA for efficient glioma therapy [J]. Biomaterials，2015，53：330-340.

[5] Stupp R，Hegi ME，Mason WP，et al. Effects of radiotherapy withconcomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase Ⅲ study：5-year analysis of the EORTC-NCIC trial [J]. Lancet Oncol，2009，10（5）：459-466.

[6] Wang SJ，Zhao Y，Ruan ZC，et al. Association between EGF +61 G/A and glioma risk in a Chinese population [J]. BMC Cancer，2010，10（1）：221.

[7] Kang CS，Zhang ZY，Jia ZF，et al. siRNA epidermal growth factor receptor silencing in U251 glioma cells [J]. Neural Regeneration Research，2008，（6）：652-655.

[8] Serguera C，Bemelmans AP. Gene therapy of the central nervous system：general considerations on viral vectors for gene transfer into the brain [J]. Revue Neurologique，2014， 170（12）：727-738.

[9] 李偉，劉佳，劉立.腫瘤基因治療中腺病毒載體改造熱點[J].中國生物化學與分子生物學報，2008，24（11）：1008-1013.

[10] Wen ZF，Jung F，Wang WW，et al. Genetic engineering of mesenchymal stem cells by non-viral gene delivery [J]. Clin Hemorheol Microcirc，2014，58（1）：19-48.

[11] Meade BR，Dowdy SF. Enhancing the cellular uptake of siRNA duplexes following noncovalent packaging with protein transduction domain peptides [J]. Adv Drug Deliv Rev，2007，60（4-5）：530-536.

[12] 朱文靜，張學農.非病毒基因載體的遞送屏障及其提高基因遞送效率的研究進展[J].抗感染藥學，2015，12（4）：487-493.

[13] Li SD，Huang L. Stealth nanoparticles：high density but sheddable PEG is a key for tumor targeting [J]. J Control Release，2010，145（3）：178-181.

[14] Essa S，Rabanel JM，Hildgen P. Characterization of rhodamine loaded PEG-g-PLA nanoparticles（NPs）：effect of poly（ethylene glycol）grafting density [J]. Int J Pharm，2011，411（1-2）：178-187.

[15] Hirata E，Arakawa Y，Shirahata M，et al. Endogenous tenascin-C enhances glioblastoma invasion with reactive change of surrounding brain tissue [J]. Cancer Sci，2009， 100（8）：1451-1459.

[16] Yao Q，Chen H，Yuan W，et al. Lipsome formulated with TAT-modified cholesterol for improving brain delivery and therapeutic efficacy on brain glioma [J]. Int J Pham，2011，420（2）：304-312.

[17] Wang ZY，Zhao Y，Ren L，et al. Novel gelatin-siloxane nanoparticles decorated by Tat peptide as vectors for gene therapy [J]. Nanotechnol，2008，19（44）：445103.

[18] 張龍，胡洋，林曉寧，等.Tat-TTA1-PEG共修飾明膠-硅氧烷納米粒跨血腦屏障及對膠質瘤的靶向性研究[J].中國生化藥物雜志，2014，（8）：43-46.

[19] Endersby R，Baker SJ. PTEN signaling in brain：neuropathology and tumorigenesis [J]. Oncogene，2008，27（41）：5416-5430.

[20] de Groot JF，Gilbert MR. New molecular targets in malignant gliomas [J]. Curr Opin Neurol，2007，20（6）：712-718.

（收稿日期：2015-11-14 本文編輯：張瑜杰）