童艷麗 翟海云 陳纘光 霍延豪 梅華清 楊水源

[摘要] 目的 建立了微流控芯片非接觸電導檢測法測定三顆針與鹽酸小檗堿片中小檗堿的分析方法。 方法 選擇5 mmol/L 乙二胺 + 15 mmol/L H3BO3作緩沖溶液；加入0.4 mmol/L β-環(huán)糊精（β-CD） 添加劑；分離電壓2.50 kV；進樣時間10 s； 結果 鹽酸小檗堿的線性范圍為10～4.0×102 μg/mL（r = 0.997），檢出限為10 μg/mL（S/N = 3），三顆針中小檗堿平均含量為0.14%，鹽酸小檗堿片中小檗堿平均含量為91.6 mg/片，其平均標準偏差（RSD）分別為1.3%（n = 6）、1.4%（n = 6）。平均加標回收率分別為103%和98.9%。 結論 該方法快速、簡單、高效，可為三顆針及鹽酸小檗堿片提供新的分析方法。

[關鍵詞] 微流控芯片；非接觸電導檢測；鹽酸小檗堿；三顆針；鹽酸小檗堿片

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（c）-0143-04

Determination of Berberine in Barberry Root and Berberine hydrochloride Tablets by Microfluidic Chip

TONG Yanli1 ZHAI Haiyun2 CHEN Zuanguang3 HUO Yanhao3 MEI Huaqing1 YANG Shuiyuan1

1.Department of Pharmacy， Guangdong No.2 Provincial People's Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 510317， China； 2.School of Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangdong Province， Guangzhou 510006， China； 3.School of Pharmaceutical Sciences， Sun Yat-sen University， Guangdong Province， Guangzhou 510089， China

[Abstract] Objective To establish a new method for the determination of Berberine in Barberry Root and Berberine hydrochloride Tablets by microfluidic chip with contactless conductivity detection. Methods 5 mmol/L ethylene diamine + 15 mmol/L boric acid + 0.4 mmol/L β-CD were selected as buffer solution， 2.50 kV was chosen as separation voltage with injecting time of 10 s. Results The linear range of berberine ranged from 10 to 4.0×102 μg/mL （r = 0.997） with the detection limit of 10 μg/mL （S/N = 3）， the average recovery was 103% and 98.9% respectively. The average concentration of berberine in barberry root was 0.14% （RSD = 1.3%， n = 6） and the average content of berberine in berberine hydrochloride tablet was 91.6 mg （RSD = 1.4%， n = 6）. Conclusion The method is simple， rapid and efficient， which can provide a new analysis method for Berberine and Barberry root.

[Key words] Microfluidic chip； Contactless conductivity detection； Berberine hydrochloride； Barberry Root； Berberine hydrochloride Tablets

三顆針為小檗科（Berberidaceae）小檗屬（Beris）植物的俗稱，其含有的生物堿主要有小檗堿，具有清熱解毒、抗菌等作用[1]。鹽酸小檗堿片常用于治療腸道感染。其分析方法包括高效液相色譜法[1-7]、紫外分光光度法[8-9]、薄層掃描法[10-11]和毛細管電泳法[12-15]等。高效液相色譜分離效率較高、定量效果好、分析速度較快，但需分離柱、高壓泵及較大量的流動相，分析成本較高，且流動相多為有毒溶劑，對環(huán)境有一定污染；紫外分光光度法易受共存成分的干擾；相比而言，微流控芯片分析技術所需樣品量及緩沖液量少，分析耗費低，環(huán)境污染少，樣品預處理簡單[16-18]?？蔀槿w針與鹽酸小檗堿片的質量控制提供一種新的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CZG 06-1微流控芯片分析儀（自制[21]）；PMMA十字通道芯片（微通道上寬30 μm，下寬100 μm ，深30 μm，進樣通道為十字結構，分離通道長44 mm，有效分離長度43 mm，由大連理工大學微系統(tǒng)研究中心提供）；微型壓電陶瓷高壓電源（自制[19]）、非接觸電導檢測器（高頻電導檢測，自制[20]）；數(shù)據(jù)處理軟件（自制）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義予華儀器有限責任公司）；LK-400A中藥粉碎機（溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠）；DA-3A超聲波提取器（順德樂從靈通電子廠）。

三羥甲基氨基甲烷（Tris），2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）（上海生工生物工程有限公司）；其他試劑為國產(chǎn)分析純；水為雙蒸餾去離子水。所有試劑使用前均經(jīng)0.22 μm的微濾膜過濾。鹽酸小檗堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110713-200609）；三顆針（購自廣州清平中藥材市場，經(jīng)廣東省第二人民醫(yī)院中藥房副主任中藥師鄭艷平鑒定為三顆針）；鹽酸小檗堿片（赤峰蒙欣藥業(yè)有限公司，批號：150203）。

1.2 對照品和樣品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品0.0100 g，配制濃度為1.00 mg/mL的對照品溶液。4℃保存，臨用時稀釋成各濃度的標準溶液。

將干燥三顆針藥材粉碎，過三號（50目）篩，精密稱取2.0000 g，加入20 mL無水乙醇浸泡過夜，超聲頻率60 kHz提取30 min，振搖后靜置10 min，過濾；殘渣加入10 mL無水乙醇，重復超聲提取0.5 h，過濾，合并兩次濾液，于蒸發(fā)皿上水浴蒸干乙醇，再用適量雙蒸餾去離子水溶解，定容于10 mL容量瓶，得三顆針供試品溶液。4℃保存，臨用時稀釋成所需濃度的供試品溶液。

精密稱取鹽酸小檗堿片1片量（0.1218 g），加入適量雙蒸去離子水，水浴1 h，超聲頻率60 kHz下提取30 min，過濾，濾液用雙蒸去離子水定容于50 mL容量瓶，得鹽酸小檗堿片供試品溶液。4℃保存，臨用時稀釋成所需濃度的供試品溶液。

進樣前所有溶液均用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.3 分離測定

新芯片使用前依次用1 mol/L HNO3、雙蒸餾去離子水依次清洗芯片的通道20、10 min。實驗前，先用0.1 mol/L NaOH沖洗活化通道20 min，然后用雙蒸餾去離子水沖洗10 min，最后用緩沖溶液活化20 min。實驗后，依次用乙醇、1 mol/L HNO3沖洗通道，再用水充滿通道，以防止通道堵塞。進樣電壓100～500 V，分離電壓500～5000 V。檢測器優(yōu)化的激發(fā)電壓為60 V（VP-P）、激發(fā)頻率為60 kHz。檢測器的輸出信號由數(shù)據(jù)工作站采集到微機中進行實時數(shù)據(jù)處理、圖形顯示和數(shù)據(jù)文件存儲。實驗在恒溫（25℃）、恒濕（60%）條件下進行。

2 結果

2.1 線性關系、檢出限

精密量取鹽酸小檗堿對照品的儲備液，配制成10～9.0×102 μg/mL的系列標準溶液，在優(yōu)化條件下測定。在10～4.0×102 μg/mL范圍內，鹽酸小檗堿的峰面積（Y）與質量濃度（X）呈良好的線性關系，線性方程為Y=2.20×103X-1.56×104，相關系數(shù)r = 0.997，檢出限為10 μg/mL（S/N = 3）。

2.2 精密度、樣品分析及重復性試驗

以濃度100.0 μg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液，在優(yōu)化實驗條件下，重復進樣6次，測得鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.5%，說明精密度良好。另外精密量取三顆針及鹽酸小檗堿片供試品母液稀釋1/2，各自重復進樣6次，根據(jù)線性方程，計算得三顆針供試品的平均濃度為1.35×102 μg/mL，稀釋后的鹽酸小檗堿片的平均濃度為91.6 μg/mL。從而計算得三顆針中小檗堿的平均含量為0.14 %，鹽酸小檗堿片中小檗堿含量平均為91.6 mg/片。平均RSD值分別為1.3%（n = 6），1.4%（n = 6），重復性符合要求，具體樣品分析圖見圖1。

a：三顆針的芯片毛細管電泳圖；b：鹽酸小檗堿片的芯片毛細管電泳圖

圖1 樣品分析

2.3 回收率試驗

將鹽酸小檗堿供試品母溶液濃度稀釋至2/3，根據(jù)線性方程，測得濃度為61.6 μg/mL。再用標準加入法，按照三顆針供試品溶液及鹽酸小檗堿片供試品稀釋后溶液濃度的120%、100%、80%加入小檗堿標準品溶液，每組測定3次，并按線性方程計算測出量濃度，最終計算得樣品加標回收率分別為：三顆針103%，鹽酸小檗堿98.9%，回收率在85%～115%之間，符合要求，平均RSD值分別為1.3%和1.8%。見表1。

表1 加標回收率試驗結果（n = 3）

2.4 穩(wěn)定性試驗

按照“1.2”項下方法制備樣品母溶液，并分別稀釋至1/2，放置于4℃冰箱保存，并在0、4、8、12、24、36、48 h測定峰面積值的變化，結果峰面積RSD值為1.6%（n = 7），表明樣品溶液在48 h內穩(wěn)定。

3 討論

緩沖溶液的組分及濃度比例、分離電壓、進樣時間對分離產(chǎn)生了較大影響，因此實驗考察了上述因素對實驗結果的影響，具體討論結果如下：

首先緩沖溶液的pH值決定各組分的電離程度。小檗堿pKa值為11.50，遠大于7.00，在pH值<11.50的緩沖體系中呈電離狀態(tài)，可進行電泳分析，故本實驗考察了多個pH值<11.50的緩沖體系，包括MES-Tris、Tris-H3BO3、Tris-H3PO4、Tris-HCl、H3PO4-NaH2PO4、HAc-NaAc、硼酸-硼砂、檸檬酸-檸檬酸鈉、三乙胺- H3BO3、三乙胺-H3PO4、二乙胺-H3PO4、二乙胺-H3BO3、乙二胺-H3BO3等。結果發(fā)現(xiàn)：在乙二胺-H3BO3緩沖體系中，鹽酸小檗堿峰形較好，基線平穩(wěn)，而在其他緩沖體系中，樣品無法分離或分離效果較差。因此選擇乙二胺-H3BO3緩沖體系，并考察了乙二胺（5～20 mmol/L）和H3BO3（5～20 mmol/L）不同濃度配比的緩沖體系對分離檢測的影響。結果表明，當乙二胺濃度高時，峰形變差，響應值變小，可能是因為乙二胺濃度升高，體系pH值升高，鹽酸小檗堿電離度降低，造成目標離子濃度降低；H3BO3濃度低時，出峰變慢，靈敏度降低，高濃度時，噪音變大。因此最終緩沖體系濃度定為乙二胺（5 mmol/L）-H3BO3（15 mmol/L）。除此之外，實驗考察了5%～10%甲醇、5%～10%乙醇及0.5～3.0 mmol/L的SDS，0.2-4.0 mmol/L β-CD添加劑對樣品分離及檢測效果的影響，結果表明甲醇、乙醇、SDS對分離無顯著幫助，而當加入0.4 mmol/L β-CD時，靈敏度較之前提高。因此考慮加入0.4 mmol/L β-CD作為緩沖溶液添加劑。

其次考察了分離電壓1.0～3.0 kV對樣品分離檢測的影響，結果發(fā)現(xiàn)，較低的分離電壓會使樣品出峰時間延長，且出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。過高的分離電壓，電流增大，焦耳熱效應使基線噪音也隨之增加。綜合考慮峰形、響應值、噪音等因素，優(yōu)化選擇分離電壓為2.5 kV。

最后考察了進樣時間為5.0～20.0 s對分離檢測的影響。結果表明，當進樣時間延長時，出峰時間減小，響應值增大。但超過10.0 s，峰形有一定的拖尾。綜合考慮，優(yōu)化進樣時間為10.0 s。

綜上所述，本分析方法操作簡單，消耗樣品及試劑量小，分析速度快，可為三顆針及鹽酸小檗堿片中小檗堿的含量分析提供新的方法。

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（收稿日期：2015-09-30 本文編輯：趙魯楓）