杜慧竟 石繼春 李江姣 王春娥 徐瀟 陳翠萍 葉強(qiáng)

[摘要] 目的 比較平板點(diǎn)樣法與傳統(tǒng)平板涂布計(jì)數(shù)法，建立更為簡(jiǎn)便的細(xì)菌懸液中活菌濃度的檢測(cè)方法。 方法 將3株A群溶血性鏈球菌制備成多份菌懸液，稀釋成不同梯度，用調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)中的平板點(diǎn)樣技術(shù)和傳統(tǒng)平板涂布法同時(shí)檢測(cè)，比較兩種方法計(jì)數(shù)結(jié)果，分析相關(guān)性和顯著差異。 結(jié)果 不同菌株和稀釋方法中平板點(diǎn)樣法的結(jié)果均隨菌液稀釋梯度呈現(xiàn)出較好的梯度；兩種方法計(jì)數(shù)結(jié)果呈高度相關(guān)（r = 0.84）；二者的t檢驗(yàn)結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 相對(duì)平板涂布法，平板點(diǎn)樣法計(jì)數(shù)更客觀準(zhǔn)確，檢測(cè)范圍更寬，操作更便捷，適用于菌液濃度的確定。

[關(guān)鍵詞] A群溶血性鏈球菌；細(xì)菌懸液；濃度測(cè)定；平板菌落計(jì)數(shù)

[中圖分類號(hào)] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（c）-0146-04

Comparison of two plate count methods of bacterial density determination

DU Huijing SHI Jichun LI Jiangjiao WANG Chun'e XU Xiao CHEN Cuiping YE Qiang▲

Key Laboratory for Standardization of Methods for Quality Control of Biotechnical Products， Ministry of Health， National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China

[Abstract] Objective To establish a more convenient detection method for determining concentrations of living bacteria in suspensions by comparing spot plate method with common spread plate method. Methods 3 groups of A Streptococcus strains were cultured and separately suspended in normal saline and diluted. The concentrations of the suspensions were detected by both spot plate method and spread plate method. The relationship and significant difference between the results from the two methods were analyzed. Results The counting results of different strains or diluting way suspensions from spot plates appeared a great dilution gradient dependence. The results of the two methods showed a good correlation， r = 0.84， and there was no significant difference in t-test （P > 0.05）. Conclusion Compared with spread plate method， spot plate method is a more objective and convenient method for bacteria counting， which also has a wide counting range.

[Key words] Group A Streptococcus； Bacteria suspension； Concentration determination； Plate culture count

在臨床細(xì)菌診斷試劑盒的評(píng)價(jià)過(guò)程中，菌液濃度的確定是參考品制備的關(guān)鍵步驟，因此菌液濃度的測(cè)定方法應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確、便捷。目前，菌液濃度的測(cè)定和參考品的制備常用濁度法（包括比濁法、分光光度法等）和平皿計(jì)數(shù)法[1-6]，但濁度法難以區(qū)分活菌與死菌，以及與微生物大小類似的雜質(zhì)[7]。傳統(tǒng)用于測(cè)定菌液內(nèi)活菌量的方法主要是平板涂布法。此方法雖結(jié)果較為準(zhǔn)確，但可計(jì)數(shù)濃度范圍窄，且人眼計(jì)數(shù)不夠客觀；操作復(fù)雜，所需時(shí)間較長(zhǎng)，當(dāng)制備大批量參考品時(shí)，其計(jì)數(shù)工作量也變得不可忽視，更易因疲勞而使誤差變大。

平板點(diǎn)樣計(jì)數(shù)法是調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)（opsonophagocytic assay，OPA）中的細(xì)菌濃度檢測(cè)方法。調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)是評(píng)估肺炎球菌疫苗效價(jià)的實(shí)驗(yàn)方法，其原理是用肺炎球菌疫苗免疫后的血清樣本（抗體）、HL-60細(xì)胞和補(bǔ)體構(gòu)建體外型別特異性抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬模型，對(duì)一定濃度的肺炎鏈球菌進(jìn)行清除，之后通過(guò)檢測(cè)體系中存活肺炎鏈球菌的濃度計(jì)算出血清樣本中的功能抗體活力，實(shí)現(xiàn)對(duì)肺炎球菌疫苗保護(hù)效力的準(zhǔn)確評(píng)估[8]。近年來(lái)，美國(guó)阿拉巴馬大學(xué)通過(guò)長(zhǎng)期探索，建立了優(yōu)化的多重調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)（multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA），可同時(shí)對(duì)4種血清型的肺炎球菌功能抗體進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，減少了工作量并節(jié)約血清樣本，更使得OPA技術(shù)的檢測(cè)通量成倍提高[9-11]。此實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確高效，被WHO推薦用于肺炎球菌疫苗的功能性抗體檢測(cè)[12-13]，且國(guó)外部分藥企已經(jīng)開始采用[14-16]。其中檢測(cè)存活肺炎球菌濃度所用的平板點(diǎn)樣方法是該實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)高效便捷的關(guān)鍵步驟。

在目前申報(bào)檢驗(yàn)的臨床細(xì)菌診斷試劑盒中，A群鏈球菌抗原檢測(cè)試劑盒申報(bào)較多、應(yīng)用較廣[17-19]，且A群鏈球菌與肺炎球菌寄生部位接近，培養(yǎng)條件較相似。因此本實(shí)驗(yàn)選用A群鏈球菌抗原檢測(cè)試劑盒的國(guó)家參考菌株制備懸液，參考調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)中平板點(diǎn)樣的方法，同時(shí)與傳統(tǒng)平板涂布法比較驗(yàn)證，建立一種更快速簡(jiǎn)便的活菌濃度檢測(cè)法。

1 材料與方法

1.1 一般材料

菌株是由中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供A群溶血性鏈球菌CMCC32300、CMCC32301、CMCC32067。試劑是注射用生理鹽水；MH培養(yǎng)基（Bacto）、羊血（陸橋公司）；Todd-Hewitt Broth（Bacto）、酵母提取物（Bacto）、瓊脂（Bacto）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑TTC（Amresco）、水。培養(yǎng)基為10%羊血培養(yǎng)基：MH培養(yǎng)基10.5 g；水500 mL；在使用前融化培養(yǎng)基，溫度冷卻至50～60℃時(shí)加入羊血50 mL混勻。THYA培養(yǎng)基：Todd-Hewitt Broth培養(yǎng)基12 g；酵母提取物2 g；瓊脂6 g；水500 mL。上層培養(yǎng)基：Todd-Hewitt Broth培養(yǎng)基24 g；酵母提取物4 g；瓊脂6 g；水800 mL。TTC儲(chǔ)液：TTC 1.25 g；水50 mL，用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后，于4℃保存。溶液呈淡黃色；若顏色變紅，廢棄，重新制備。

1.2 儀器

電子天平（ME204）購(gòu)自瑞士METTLER TOLEDO儀器（上海）有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（LRH-250-Ⅱ）購(gòu)自廣東省醫(yī)療器械廠；恒溫水浴鍋（XMTD-6000）購(gòu)自北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；超凈工作臺(tái)（SG-603TX）購(gòu)自BAKER公司；菌落計(jì)數(shù)儀（ProtoCOL3）購(gòu)自英國(guó)Synbiosis公司；顯微鏡（BX51）購(gòu)自日本OLYMPUS公司；振蕩器（QL-901）購(gòu)自海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 樣品制備

1.3.1 菌懸液制備 將A群溶血性鏈球菌CMCC32067、CMCC32300、CMCC32301凍干粉復(fù)蘇后，制成懸液涂布在羊血培養(yǎng)基平板上，在37℃過(guò)夜培養(yǎng)。將平板上的菌體刮至10 mL注射用生理鹽水中，制成均一菌懸液。

1.3.2 梯度稀釋 將CMCC32067制備7份菌懸液，將其中5份進(jìn)行1/10系列稀釋8個(gè)梯度，另外2份做1/2系列稀釋18個(gè)梯度；將CMCC32300和CMCC32301各制備1份菌懸液，并進(jìn)行1/10系列稀釋8個(gè)梯度。

1.4 平板點(diǎn)樣

1.4.1 培養(yǎng)基準(zhǔn)備 將THYA培養(yǎng)基融化后，倒于13 cm×13 cm方形培養(yǎng)皿中，25 mL/板；凝固后在超凈臺(tái)內(nèi)開蓋吹30～45 min，備用。將上層培養(yǎng)基融化后保存于50℃水浴中1～2 h，確保溫度至50℃，備用[20]。

1.4.2 平板點(diǎn)樣 1/10梯度稀釋每個(gè)濃度菌液以及1/2梯度稀釋的后8個(gè)濃度的菌液，分別取10 μL滴在THYA方形培養(yǎng)皿左側(cè)，每點(diǎn)完一個(gè)樣品立即傾斜平板，使菌液滴流成2～3 cm長(zhǎng)，每個(gè)梯度做兩個(gè)平行。待所有樣品點(diǎn)完后，室溫放置20～30 min，讓菌液吸收到瓊脂板上。從水浴中取出上層培養(yǎng)基，取25 mL入25 μL TTC儲(chǔ)液混勻，從板子邊緣緩慢傾倒在點(diǎn)樣的THYA平板上。待上層培養(yǎng)凝固，倒置于37℃孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜，

1.4.3 菌落計(jì)數(shù) 用菌落計(jì)數(shù)儀統(tǒng)計(jì)每個(gè)點(diǎn)樣條的菌落數(shù)[21]。

1.5 平板涂布

分別取各系列菌液中的部分梯度50 μL或100 μL菌液均勻涂布于羊血平板，各做兩個(gè)平行，倒置于37℃孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜，手動(dòng)計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將7份菌懸液的各稀釋梯度用兩種平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，再用各個(gè)梯度的計(jì)數(shù)結(jié)果分別折算出初始濃度，采用SPSS 13.0對(duì)兩組結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析和成對(duì)t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各稀釋梯度平板點(diǎn)樣法計(jì)數(shù)結(jié)果

5份CMCC32067菌懸液1/10系列稀釋，2份CMCC32067菌懸液1/2系列稀釋，用THYA平板點(diǎn)樣法分別檢測(cè)每份菌液的多個(gè)梯度，計(jì)算初始濃度結(jié)果分別見表1、2，點(diǎn)樣平板見圖1。

表1 5份1/10梯度稀釋CMCC32067菌懸液THYA平板計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 平板點(diǎn)樣法與平板涂布法計(jì)數(shù)結(jié)果比較

7份CMCC32067菌懸液的THYA平板和血平板計(jì)數(shù)結(jié)果比較見表3。將兩種方法的計(jì)數(shù)結(jié)果做相關(guān)性分析，得到r值為0.84，高度相關(guān)；并且用t檢驗(yàn)比較二者結(jié)果的差異性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

表3 7份CMCC32067菌懸液的THYA平板與血平板

菌落計(jì)數(shù)結(jié)果比較

2.3 其他菌株兩種方法計(jì)數(shù)結(jié)果比較

CMCC32300和CMCC3 2301菌懸液1/10系列稀釋，用THYA平板點(diǎn)樣法（點(diǎn)樣10 μL）分別檢測(cè)每份菌液的多個(gè)梯度，計(jì)算初始濃度結(jié)果，與血平板涂布法（點(diǎn)樣500 μL）計(jì)數(shù)結(jié)果比較，見表4，點(diǎn)樣平板見圖2。

表4 CMCC32300、CMCC32301的THYA平板與血平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果比較

注：“-”無(wú)法計(jì)數(shù)

圖2 1/10梯度稀釋的CMCC32300和CMCC3 2301 THYA平板

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中，用不同菌株、不同稀釋方法且多次重復(fù)試驗(yàn)，平板點(diǎn)樣法的結(jié)果均隨菌液稀釋梯度呈現(xiàn)出較好的梯度。比較了平板點(diǎn)樣法與平板涂布法計(jì)數(shù)7份CMCC32067的菌懸液的不同濃度梯度，以及不同的血平板點(diǎn)樣量，結(jié)果均顯示出高度相關(guān)性，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；用兩種平板計(jì)數(shù)方法計(jì)算另外兩株A群溶血性鏈球菌菌液濃度，同樣具有較好的一致性。比較兩種計(jì)數(shù)方法的操作性和準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)平板點(diǎn)樣法點(diǎn)樣區(qū)域小、點(diǎn)樣量少，計(jì)數(shù)簡(jiǎn)便，因而可檢測(cè)的濃度范圍比平板涂布法較寬。

用多個(gè)稀釋度的濃度檢測(cè)結(jié)果計(jì)算初始菌液濃度顯示，測(cè)定結(jié)果隨稀釋度提高略有升高，分析原因可能為：①存在稀釋過(guò)程中的操作誤差；②點(diǎn)樣區(qū)域有限，在稀釋度低時(shí)菌液濃度高，菌落密集且大小不均，容易漏計(jì)或合并計(jì)數(shù)，造成計(jì)算結(jié)果偏低；高稀釋度時(shí)菌液濃度低，菌體可能未落在點(diǎn)樣區(qū)域，造成平行孔之間CV值較大，濃度計(jì)算不準(zhǔn)確。根據(jù)結(jié)果分析，選擇菌落數(shù)在20～100個(gè)之間的點(diǎn)樣區(qū)計(jì)算菌液濃度的偏差較小，點(diǎn)樣濃度最好在2×104～2×102 cfu/mL，將同一菌液的多個(gè)梯度的計(jì)數(shù)結(jié)果平均，計(jì)算初始菌液濃度更為準(zhǔn)確。

由于平板點(diǎn)樣法所需樣品量少、點(diǎn)樣區(qū)域小，可以在一塊方形培養(yǎng)皿里同時(shí)檢測(cè)多個(gè)稀釋度或多種菌液。若待檢樣品多，還可以將初始菌懸液用移液器在96孔板中梯度稀釋后，再用多道移液器同時(shí)點(diǎn)樣多個(gè)梯度或多種菌液，操作更加便捷[20]。且此方法用儀器自動(dòng)計(jì)數(shù)，并且可以根據(jù)情況進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整，準(zhǔn)確度和效率更高，減少了傳統(tǒng)平板涂布法的涂布不均和人眼計(jì)數(shù)誤差。

對(duì)于其他細(xì)菌檢測(cè)試劑盒，當(dāng)制備試劑盒評(píng)價(jià)參考品時(shí)，如果其抗原菌株不能在THYA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，如淋病奈瑟菌等，在測(cè)定參考品濃度時(shí)可篩選出適宜其生長(zhǎng)的且透明度好的培養(yǎng)基點(diǎn)樣，以便于TTC顯色后用儀器計(jì)數(shù)，這部分研究將在本室的后續(xù)工作中進(jìn)行。

綜上所述，相較于平板涂布法，用平板點(diǎn)樣法檢測(cè)菌液濃度更加快捷，簡(jiǎn)便，上樣量少，且檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確客觀，檢測(cè)范圍寬，平均多個(gè)梯度后計(jì)算更加縮小了誤差，可以用于大批量試劑盒參考品的制備。

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（收稿日期：2015-11-04 本文編輯：趙魯楓）