劉晏 魏剛 陸兔林

[摘要] 目的 觀察新痹痛靈對(duì)CIA大鼠脾臟T細(xì)胞亞群、白介素-2（IL-2）及白介素-2受體（IL-2R）的影響，探討新痹痛靈治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。 方法 44只SD大鼠建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型（CIA），造模成功的36只大鼠隨機(jī)分為4組： 模型組、陽(yáng)性藥組、新痹痛靈中劑量組、新痹痛靈高劑量組，每組各9只，另取9只正常SD大鼠為正常組。造模成功后連續(xù)給藥28 d，末次給藥后取血，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠脾臟CD4+ T細(xì)胞及CD8+ T細(xì)胞的變化，ELISA檢測(cè)觀察大鼠脾臟IL-2、IL-2R。 結(jié)果 與模型組比較，新痹痛靈中劑量組、新痹痛靈高劑量組的CD4+/CD8+比值下調(diào)，IL-2與IL-2R水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。形態(tài)學(xué)觀察顯示：新痹痛靈對(duì)滑膜細(xì)胞增殖有抑制作用。 結(jié)論 新痹痛靈對(duì)T細(xì)胞亞群及其相關(guān)炎癥因子的紊亂調(diào)節(jié)作用，可能是其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 新痹痛靈；CIA大鼠；T細(xì)胞亞群；IL-2；IL-2R

[中圖分類號(hào)] R593 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（b）-0008-04

Effects of New Bitongling Compound on the T cell semi-group of CIA rats

LIU Yan1 WEI Gang2 LU Tulin3 GUO Haiying1 WANG Yue1

1.Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210000， China； 2.Jiangsu Province Hospital of TCM， Jiangsu Province， Nanjing 210000， China；3.Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210000， China

[Abstract] Objective To observe the effects of New Bitongling Compound on the T cell semi-group， IL-2 and IL-2R， and study the mechanism of New Bitongling Compound treating RA. Methods 44 SD rats were established collagen-induced arthritis （CIA） model， successful CIA 36 rats were randomly divided into 4 groups： model group， positive drug group， middle-dose New Bitongling Compound group， high-dose new Bitongling Compound group， with 9 rats in each group， 9 normal SD rats were as normal group. After model successfully established， the rats were given drugs for 28 d， blood sample was taken after the last administration. The CD4+ and CD8+ T cell in spleen of CIA rats were detected by flow cytometer， the IL-2 and IL-2R were detected by ELISA. Results Compared with model group， the CD4+/CD8+ ratio of middle-dose New Bitongling Compound group and high-dose New Bitongling Compound group decreased， the level of IL-2 and IL-2R also reduced， the differences were statistically significant （P < 0.01 or P < 0.05）. Morphological observation indicated that New Bitongling Compound had significant in-hibitory on synovial cells proliferation. Conclusion New Bitongling Compound can regulate the abnormal T cell semi-group IL-2 and IL-2R， which may be one of its mechanism of treatment of rheumatoid arthritis.

[Key words] New Bitongling Compound； CIA rats； T cell semi-group； IL-2；IL-2R

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，其基本病理改變是滑膜炎，病因研究至今尚無(wú)明確定論。研究表明，T細(xì)胞是RA關(guān)節(jié)滑膜中數(shù)量最多的一類炎癥細(xì)胞，且處于激活狀態(tài)，對(duì)RA病理的持續(xù)進(jìn)展起重要作用[1]，而白介素2（IL-2）與白介素-2受體（IL-2R）是與T細(xì)胞密切相關(guān)的炎癥因子，是反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)[2，3]。

新痹痛靈是從全國(guó)名老中醫(yī)汪履秋教授治療中醫(yī)“痹證”（尤其是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）的經(jīng)驗(yàn)方變化而來(lái)，由朱丹溪上中下通用痛風(fēng)方化裁，在結(jié)合了前期的實(shí)驗(yàn)及臨床研究后總結(jié)而出。為進(jìn)一步研究新痹痛靈治療痹證的療效和機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)分別從T細(xì)胞亞群和炎癥因子兩個(gè)方面，對(duì)新痹痛靈進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究[4]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 新痹痛靈浸膏制備 中藥飲片購(gòu)于江蘇省中醫(yī)院門(mén)診部藥房，浸膏制作程序由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制教研室研制，江蘇省中醫(yī)院制劑部加工而成。痹痛靈浸膏主要制備工藝：取桂枝等提取揮發(fā)油、麻黃等醇提、制川烏等水提，減壓回收乙醇至無(wú)醇味的浸膏。取一定量浸膏烘干稱其質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率為9.3%，即浸膏折合原藥材為每1克浸膏含生藥量10.75 g。

1.1.2 其他 雷公藤多苷片，浙江得恩德制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)1403111B；牛Ⅱ型膠原蛋白，美國(guó)Chondrex公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑，美國(guó)Sigma公司；Anti-CD3-APC單抗，美國(guó)eBioscience公司，E16085-103；Anti-CD4-FITC單抗，美國(guó)eBioscience公司，E00074-1632；Anti-CD8-PE單抗，美國(guó)eBioscience公司，E01045-1643；紅細(xì)胞裂解液，美國(guó)genscrip公司，C31141409；大鼠IL-2、IL-2R ELISA檢測(cè)試劑盒，R&D公司。流式細(xì)胞儀，型號(hào)：FACS Calibur，BD公司；臺(tái)式大容量高速離心機(jī)，型號(hào)：5810，Eppendortf公司；酶標(biāo)儀，型號(hào)：EnVision，PerKin Elmer公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD雄性大鼠（180±20g），4周齡，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；動(dòng)物合格證號(hào)：SCXX（京）2012-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)在南京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一周進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環(huán)。飼料和水均在消毒后由動(dòng)物自由攝取。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及給藥 本實(shí)驗(yàn)共54只大鼠，10只大鼠不做任何處理為正常組，44只大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型（CIA）造模，無(wú)菌條件下將牛Ⅱ型膠原蛋白（CollagenⅡ，CⅡ）溶于0.05 mol/L乙酸溶液（濃度為2 mg/mL），置4℃冷庫(kù)、避光搖蕩過(guò)夜充分溶解后，再與等量弗氏完全佐劑充分混合（Ⅱ型膠原終濃度為1 mg/mL），于每只大鼠尾根部1～2 cm處按0.2 mL/只皮下注射；7 d后行加強(qiáng)免疫，取加強(qiáng)免疫乳膠混合物（將初次免疫中將完全佐劑換成不完全佐劑），按0.1 mL/只于尾根部1～2 cm處皮內(nèi)注射，其余操作同初次免疫，造模共21 d。以AI值>2為造模成功，44只大鼠中36只CIA造模成功，造模成功率為81.8%。36只大鼠隨機(jī)分為4組，每組各9只大鼠，即模型組：給予等量蒸餾水；陽(yáng)性藥組：雷公藤多苷片溶液0.012 g/kg；新痹痛靈中劑量治療組：給予3.95 g/kg；新痹痛靈高劑量治療組：給予15.8 g/kg；另取9只正常組大鼠給予等量蒸餾水；各組于造模成功后給藥，每日1次，連續(xù)28 d[5-7]。

1.3.2 大鼠的一般情況及AI的計(jì)算 體重（g）分組前及用藥前各1次、用藥后每周測(cè)1次；全身整體狀況觀察包括大鼠形體、毛色、反應(yīng)、活動(dòng)情況、食欲、大小便。于初次免疫前1 d，初次免疫后每周用肉眼觀察，依據(jù)關(guān)節(jié)腫大、變形、顏色及關(guān)節(jié)活動(dòng)情況對(duì)大鼠足趾關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)行評(píng)分，肉眼觀察AI值>2分說(shuō)明CIA大鼠造模成功。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[8]方法，無(wú)關(guān)節(jié)腫大為0分；有紅色斑點(diǎn)和輕度腫脹為1分；關(guān)節(jié)中度腫脹為2分；關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹為3分；關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹且不能負(fù)重為4分。

1.3.3 脾臟T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的檢測(cè) 各組大鼠于末次給藥24 h后股動(dòng)脈放血處死，取胸腺、脾臟，去除臟器表面游離組織、被膜，用生理鹽水沖干凈，用眼科剪將脾臟剪碎后，加入3 mL生理鹽水，用一個(gè)覆蓋300目尼龍網(wǎng)的燒杯過(guò)濾至錐形管內(nèi)，即得脾臟單個(gè)細(xì)胞懸液。取1 mL的脾臟淋巴細(xì)胞懸液于離心管中，在室溫下以1500 r/min，離心4 min，取出后傾倒上清（勿破壞下面的沉淀）加入抗體，渦旋后，避光孵育15 min，脾臟組加入1 mL的紅細(xì)胞裂解液原液，避光孵育10 min。以1500 r/min，離心4 min，去上清，加PBS緩沖液500 μL，吹打后用渦旋機(jī)渦旋，再次在室溫下以1500 r/min，離心4 min，去上清，加500 μL的PBS緩沖液，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。將另一部分脾臟放入液氮中凍存，按試劑盒說(shuō)明書(shū)以ELISA法測(cè)定脾臟IL-2、IL-2R，依次稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；加樣、孵育；加酶、孵育；加顯色劑；測(cè)定各個(gè)標(biāo)本的吸光度（OD值）。

1.3.4 組織形態(tài)學(xué)觀察 心臟采血后脫頸處死后取右側(cè)踝關(guān)節(jié)剔除皮毛、肌肉、筋膜等，將保留完整的踝關(guān)節(jié)和滑膜組織固定于4%多聚甲醛固定液中1周[9]。關(guān)節(jié)病理制作及形態(tài)學(xué)檢測(cè)參考文獻(xiàn)[9]方法，依次脫鈣、固定標(biāo)本、制作標(biāo)本蠟塊、切片、然后進(jìn)行HE染色、最后拍照保存進(jìn)行病理評(píng)分。病理學(xué)評(píng)分參照文獻(xiàn)[10]方法，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：沒(méi)有組織病理學(xué)改變；1分：輕微局灶性浸潤(rùn)；2分：中度浸潤(rùn)；3分：嚴(yán)重炎癥浸潤(rùn)，但無(wú)血管翳形成或軟骨損傷；4分：非常嚴(yán)重的浸潤(rùn)形成血管翳和/或軟骨、骨侵蝕。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況的評(píng)估及模型的鑒定

第2次免疫后1周左右，大鼠陸續(xù)發(fā)病，表現(xiàn)為足趾腫脹，至21 d左右，36只大鼠（81.8%）達(dá)到急性炎癥期表現(xiàn)：關(guān)節(jié)腫脹明顯。癥狀一般自后踝先發(fā)，逐漸加重，累及趾間關(guān)節(jié)、前足等，嚴(yán)重者四肢腫脹不能承重、活動(dòng)受限。肉眼觀察大鼠AI值>2，造模成功。

2.2 新痹痛靈對(duì)T細(xì)胞亞群的影響

造模后模型組CD4+數(shù)值顯著升高（P < 0.05），致使CD4+/CD8+比值上升（P < 0.05）；予給藥干預(yù)后，CD4+、CD4+/CD8+均有不同程度回降（P < 0.05）；但CD8+數(shù)值并未見(jiàn)規(guī)律性改變，可見(jiàn)CD4+數(shù)值在最終結(jié)果中占決定性地位。見(jiàn)表1、圖1～2。

表1 新痹痛靈對(duì)T細(xì)胞亞群的影響（n = 9，x±s）

注：與模型組相比，*P < 0.05

圖1 正常組大鼠CD4+ T細(xì)胞流式圖

2.3 新痹痛靈對(duì)脾臟IL-2、IL-2R的影響

造模后大鼠脾臟IL-2與IL-2R均有顯著上升（P < 0.01），予給藥干預(yù)后，均有不同程度回落，其中陽(yáng)性藥組藥效最為顯著，新痹痛靈高劑量組其次，新痹痛靈中劑量組最末。見(jiàn)表2。

表2 新痹痛靈對(duì)脾臟IL-2、IL-2R的影響（n = 9，x±s）

注：與模型組比較，*P < 0.01， **P < 0.05

2.4 病理形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)比各組病理切片，正常組（圖3）關(guān)節(jié)及滑膜結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，無(wú)炎細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，無(wú)血管翳形成。模型組（圖4）見(jiàn)明顯滑膜、軟骨壞死，陽(yáng)性藥組（圖5）、新痹痛靈中劑量組（圖6）出現(xiàn)滑膜、軟骨破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但較模型組有明顯改善。

正常組大鼠關(guān)節(jié)表面被覆透明軟骨，關(guān)節(jié)囊腔光滑，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞連續(xù)平整、結(jié)構(gòu)層次清晰，未見(jiàn)滑膜腫脹、組織壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)

圖3 正常組大鼠關(guān)節(jié)病理（HE染色，400×）

圖4 模型組大鼠關(guān)節(jié)病理（HE染色，400×）

圖5 陽(yáng)性藥組大鼠關(guān)節(jié)病理（HE染色，400×）

圖6 新痹痛靈中劑量組大鼠關(guān)節(jié)病理（HE染色，400×）

3 討論

RA是一種以大量T細(xì)胞浸潤(rùn)為主的慢性滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制與T細(xì)胞亞群數(shù)量和功能有密切關(guān)系[11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)中，CIA模型大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞明顯升高（P < 0.01），而CD8+T細(xì)胞無(wú)明顯增長(zhǎng)或下降規(guī)律，但最終模型組CD4+/CD8+比值較空白組升高（P < 0.05），說(shuō)明T細(xì)胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中其重要作用。而在陽(yáng)性藥和新痹痛靈治療后，脾臟組織中CD4+ T細(xì)胞與CD4+/CD8+比值均有回降（P < 0.05）。同時(shí)，在IL-2及IL-2R實(shí)驗(yàn)中，模型組IL-2的數(shù)值明顯升高（P < 0.01），予陽(yáng)性藥（雷公藤多苷）及新痹痛靈治療后，脾臟中IL-2有不同程度的下降，陽(yáng)性藥組和新痹痛靈對(duì)脾臟IL-2均由回調(diào)作用，但從實(shí)驗(yàn)數(shù)值上可以看出，陽(yáng)性藥組藥效最強(qiáng)（P < 0.01），對(duì)新痹痛靈有劑量依賴性。

既往研究表明，CD4是T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞的表面標(biāo)志，CD4+ T細(xì)胞具有輔助T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成效應(yīng)細(xì)胞、B細(xì)胞轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞以及活化巨噬細(xì)胞等功能[12-14]。CD8是T抑制/殺傷細(xì)胞的表面標(biāo)志，CD8+ T細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)及抑制T細(xì)胞活化、抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，起抑制細(xì)胞及體液免疫的作用，因此，CD4+、CD8+數(shù)目的變化，尤其CD4+/CD8+比值是RA發(fā)病及免疫損傷的中心環(huán)節(jié)[15]。IL-2主要是由外周免疫器官（如脾臟、淋巴結(jié)等）的CD4+輔助細(xì)胞產(chǎn)生，同時(shí)也具有刺激T細(xì)胞增殖的能力，IL-2起的是受體間的相互作用。各種細(xì)胞表面有與IL-2結(jié)合的蛋白，稱為IL-2R[3，16]。而可被釋放和溶解的IL-2R，稱為可溶性白介素-2受體（sIL-2R），大劑量IL-2輸入體內(nèi)能引起血清sIL-2R濃度的增高[17，2]。本實(shí)驗(yàn)中，CIA大鼠脾臟CD4+升高，CD4+/CD8+比值、IL-2、sIL-2R均上升，提示Th細(xì)胞功能相對(duì)亢進(jìn)和Ts細(xì)胞功能相對(duì)減弱。表明，新痹痛靈可能通過(guò)抑制Th細(xì)胞功能亢進(jìn)，并增強(qiáng)Ts細(xì)胞功能，對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎起到治療作用。

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（收稿日期：2015-08-27 本文編輯：蘇 暢）