陳國偉 周云霞 張潔清 等

[摘要] 目的 探討雌激素受體α（ERα）、ERβ在子宮內膜樣腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系。 方法 選擇2011年1月～2012年12月在廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院經組織學證實的93例子宮內膜腺癌（子宮內膜癌組）及31例正常子宮內膜（對照組）組織，分別采用qRT-PCR及免疫組化法檢測ERα、ERβ mRNA及蛋白的表達情況。 結果 子宮內膜癌組ERα mRNA 表達量及蛋白陽性表達率、ERα/ERβ mRNA均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）；隨著臨床分期、組織學分級、肌層浸潤加深，ERα mRNA表達量、蛋白陽性表達率及ERα/ERβ mRNA比值逐漸下降（P < 0.05或P < 0.01）；子宮內膜癌組ERβ mRNA及蛋白表達也降低，與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P > 0.05）。子宮內膜癌組織中ERα與ERβ陽性表達率呈負相關（r = -0.234，P < 0.05）。 結論 在子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展中，ERα的變化可能較ERβ更有意義，ERα/ERβ mRNA比值可作為判斷子宮內膜癌預后的指標。

[關鍵詞] 子宮內膜腺癌；雌激素受體α；雌激素受體β

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（b）-0087-04

子宮內膜癌被認為是一種激素依賴性腫瘤，雌激素受體（ER）、孕激素受體水平的改變與子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關。本實驗通過PCR技術及免疫組化檢測子宮內膜癌中ERα、ERβ表達的變化，以探討其與子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展的關系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月～2012年12月在廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院因子宮內膜癌手術治療切除的子宮內膜組織93例（子宮內膜癌組），年齡33～76歲，中位年齡53歲，術前均無雌、孕激素使用史。術后經病理證實。手術病理分期按國際婦產科聯(lián)盟2009年的標準：Ⅰ期55例，Ⅱ期18例，Ⅲ期16例，Ⅳ期4例。組織學分級：高分化45例，中分化28例，低分化20例。對照組選取因良性婦科腫瘤行子宮切除的正常子宮內膜31例，其中增生期21例，分泌期10例，年齡36～54歲，中位年齡48歲。

1.2 主要試劑

Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）購自美國Roche公司，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購自加拿大Fermentas公司，鼠抗人單克隆抗體ERα購自Santa Cruz公司，鼠抗人單克隆抗體ERβ購自GeneTex公司，免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 熒光定量PCR技術檢測各組組織中ERα mRNA和ERβ mRNA的表達

Trizol法提取各組組織總RNA，利用RT-PCR試劑盒合成cDNA。ERα基因引物序列，上游：5'-TGCCAAGGAGACTCGCTAC-3'，下游：5'-CTTCGTAGCATTTGC GGAG-3'，擴增產物片段長度為209 bp；ERβ基因引物序列，上游：5'-GGTCCATCGCCAGTTATCACAT-3'，下游：5'-GATGCGTAATCGCTGC AGACAG-3'，擴增產物片段長度為227 bp；以GAPDH基因為內參照，其引物序列，上游：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'，下游：5'-GAAGATGGTGATGGGATTT C-3'，擴增產物片段長度為225 bp。PCR反應體系共20 μL，包括DNA熒光染料SYBR Green 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，加水至20 μL。PCR反應條件：95℃預變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，35次循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對數(shù)據進行相對定量分析。實驗重復3次，取均值。

1.4 采用免疫組織化學SP法檢測ERα蛋白和ERβ蛋白的表達

石蠟切片（厚4 μm）經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3 %雙氧水封閉內源性過氧化物酶活性，室溫浸泡，磷酸鹽緩沖液（PBS）振洗后，分別以鼠抗人單克隆抗體ERα 1∶200、或ERβ 1∶200，4℃孵育過夜，過氧化物酶標志的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育，PBS振洗，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，樹膠封片。每次實驗均設立陽性及陰性對照，ER以已知陽性的乳腺癌切片作陽性對照，以PBS液代替一抗作陰性對照。

1.5 結果判定

ERα、ERβ蛋白陽性染色主要定位于細胞核，細胞核內有黃色或棕黃色顆粒分布者即為陽性細胞。每張切片在陽性表達較高區(qū)域隨機選擇5個高倍視野（400倍），每個視野至少計數(shù)100個腫瘤細胞，計算陽性細胞所占比例。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據分析，計量資料數(shù)據用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman相關系數(shù)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ERα、ERβ mRNA及蛋白在正常內膜及子宮內膜癌組織中的表達

所有組織中均能檢測到ERα、ERβ mRNA的表達。子宮內膜癌組中，ERα mRNA及蛋白的表達量明顯下降，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）；ERβ mRNA及蛋白的表達量也降低，與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P > 0.05）；ERα/ERβ mRNA比值較對照組明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表1、圖1。

表1 兩組子宮內膜組織中ERα、ERβ mRNA及蛋白的表達

A、C：正常內膜；B、D：子宮內膜腺癌

圖1 不同子宮內膜組織中ERα及ERβ的表達情況

（SP染色，100×）

2.2 子宮內膜癌中ERα、ERβ的表達與臨床病理因素的關系

子宮內膜癌Ⅰ期、高分化、肌層浸潤深度<1/2、淋巴結陰性的內膜組織中ERα mRNA的表達量、蛋白陽性表達率及ERα/ERβ mRNA比值均高于子宮內膜癌Ⅱ～Ⅳ期、中低分、肌層浸潤>1/2、淋巴結陰性的內膜組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。子宮內膜癌Ⅰ期、高分化、肌層浸潤深度<1/2、淋巴結陰性的內膜組織中ERβ mRNA的表達量及蛋白陽性表達率均低于子宮內膜癌Ⅱ～Ⅳ期、中低分、肌層浸潤>1/2、淋巴結陰性的內膜組織，但差異均無統(tǒng)計學意義（均P > 0.05）。見表2。

表2 不同內膜癌組織中ERα、ERβ mRNA及蛋白的表達情況

2.3 ERα與ERβ在子宮內膜癌中表達的關系

在子宮內膜腺癌中，55例ERα 蛋白表達陽性的病例中，ERα與ERβ在子宮內膜癌組織中陽性表達率呈負相關 （r=-0.234，P < 0.05）。見表3。

表3 子宮內膜癌中ERα與ERβ的關系（例）

3 討論

一般認為子宮內膜癌的發(fā)生與雌激素刺激有關，而雌激素主要通過雌激素受體發(fā)揮作用，是一類由配體激活的轉錄因子。經典的雌激素受體有ERα和ERβ兩種亞型，具有高度同源性，ERα基因位于染色體6q24，而ERβ 基因則位于14q22～24，兩者組織分布不一，與配體結合特性不同，提示它們可能具有不同的生物學作用[1]。

ER與配體結合后發(fā)生構象變化，ERα和ERβ形成同源或異源二聚體，參與靶器官、組織的增殖和分化的調控。有研究表明[2-3]，子宮內膜組織從正常內膜、增生內膜到內膜癌，ERα和ERβ的表達逐漸減少，說明ERα和ERβ均參與子宮內膜癌的發(fā)生[4-5]。ERα mRNA的表達從正常組織或腫瘤G1到G3逐漸降低，ERα蛋白具有同樣的變化，ERβ mRNA和蛋白均無變化，結果表明ERα在子宮內膜表達下調可能與腫瘤的發(fā)生有關[6]。本研究結果顯示，ERα mRNA表達量及蛋白陽性表達率在正常內膜、內膜癌組織中的表達呈明顯下降趨勢，ERβ mRNA及蛋白表達亦明顯下降，表明ER兩種亞型表達改變在致癌過程中都起作用，引起的信號傳導通路與它們的相互作用發(fā)生改變有關，但ERα表達在內膜癌中的變化顯著高于ERβ，提示ERα表達的下調或缺失在內膜癌的發(fā)生中起到重要的作用[5，7]，而ERβ可能起調節(jié)作用，通過影響癌基因來促進子宮內膜癌的發(fā)生[8]。

Wilde等[9]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內膜癌患者在接受他莫昔芬治療過程中，由于他莫昔芬的抗雌激素作用，ERα的表達下調，推測雌激素主要通過ERα起作用，癌變到一定程度后對雌激素的反應改變，ERα表達下降。本研究結果顯示，ERα的表達率隨著分期的升高、分級的增加、肌層浸潤深度的加重其下調更為顯著，提示ERα表達下調與內膜癌的發(fā)展及浸潤轉移有關，與既往的研究[7，10]結果一致。高水平的ERα可抑制血管生成旁路而對子宮內膜癌有抑制作用[11]。ERα的低表達或缺失與上皮-間質細胞的惡性轉化及不良預后呈正相關[12]，ERα的表達狀態(tài)可能提供了不依賴于子宮內膜癌分期與分級的預后影響因素[13]。

ERβ在子宮內膜癌發(fā)病機制中的作用研究較少，且其表達具有一定的差異性。有研究發(fā)現(xiàn)，ERβ在晚期及淋巴結轉移的患者中表達增加[14]。也有研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中ERβ mRNA水平明顯低于癌旁正常內膜組織[15]。Shabani等[16]的研究顯示，ERβ的表達與內膜癌臨床病理及預后無明顯相關性。本研究中，ERβ mRNA的表達量及蛋白陽性表達率在Ⅰ期與Ⅱ～Ⅳ期、組織學分化程度、淋巴結陰性與陽性、肌層浸潤深度之間的表達差異雖無統(tǒng)計學意義，但均呈增加趨勢，提示ERβ mRNA的相對高表達在子宮內膜癌變中具有一定的作用，可能與預后不良有關[14，17]。

在許多研究中，子宮內膜癌的惡性轉化與ERα/ERβ mRNA比值下降有關[14，18]。本研究中，ERα/ERβ mRNA比值與臨床分期、組織學分級及肌層浸潤深度有關，ERα與ERβ在子宮內膜癌組織中陽性表達率呈負相關，說明兩者比例的改變與ERα水平下降和/或ERβ上升有關。在子宮內膜惡變過程中存在ERα/ERβ mRNA比值的降低，這種改變可能歸結于ERα的下調及ERβ的上調[10]，ERα/ERβ mRNA比值≤1是影響預后的獨立因素，ERα和ERβ的表達失衡，尤其是ERα/ ERβ比值，較單一的ERα或ERβ，對評估患者預后可能更具優(yōu)勢[19]。研究還發(fā)現(xiàn)，17β雌二醇由ERα介導能激活轉錄，而ERβ介導則表現(xiàn)為抑制轉錄，推測ERα和ERβ在基因表達的調節(jié)方面各有分工，兩者的比例可能決定細胞對雌激素的反應性[20]。本研究也發(fā)現(xiàn)，ERα/ERβ mRNA比值隨著手術病理分期、組織學分級的升高和肌層浸潤的加深而明顯下降，說明ERα/ERβ mRNA比值的降低與患者的不良預后具有一定的相關性，可作為判斷預后的指標。

綜上所述，子宮內膜癌的預后評估可能需要共同分析ERα、ERβ而得到，兩者的變化對內膜癌的發(fā)生發(fā)展的影響還需要進一步的研究。

[參考文獻]

[1] Zwart W，de Leeuw R，Rondaij M，et al. The hinge region of the human estrogen receptor determines functional synergy between AF-1 and AF-2 in the quantitative response to estradiol and tamoxifen [J]. J Cell Sci，2010，123（Pt8）：1253-1261.

[2] 陳嘉彥，張建芳，李雯慧，等.TFF2、ERa和ERβ在子宮內膜癌中的表達及其臨床意義[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012，12（31）：6029-6033.

[3] Jarzabek K，Koda M，Walentowicz-Sadlecka M，et al. Altered expression of ERs，aromatase，and COX2 connected to estrogen action in type 1 endometrial cancer biology [J]. Tumour Biol，2013，34（6）：4007-4016.

[4] Kreizman-Shefer H，Pricop J，Goldman E，et al. Distribution of estrogen and progesterone receptors isoforms in endometrial cancer [J]. Diagn Pathology，2014，9（77）：1596-1577.

[5] Chakravarty D，Srinivasan R，Ghosh S，et al. Estrogen receptor beta（ERbeta）in endometrial simple hyperplasia and endometrioid carcinoma [J]. Appl immunohistochem Mol Morphol，2008，16（6）：535-542.

[6] Seagusa M，Okayasa I. Changes in estrogen receptor alpha and beta in relation to progesterone receptor and pS2 status in normal and malignant endometrium [J]. Jpn J Cancer Res，2000，91（5）：510-518.

[7] Banno K，Kisu I，Yanokura M，et al. Biomarkers in endometrial cancer：possible clinical applications [J]. Oncol Lett， 2012，3（6）：1175-1180.

[8] H■ring J，Skrzypczak M，Stegerer A，et al. Estrogen receptor β transcript variants associate with oncogene expression in endometrial cancer [J]. Int J Mol Med，2012，29（6）：1127-1136.

[9] Wilde JL，Shajahan S，Khatt NH，et al. Tamoxifen-associated malignant endometrial tumors：pathologic features and expression of homone receptor estrogen-α，estrogen-β and progesterone；a case controlled study [J]. Gynecol Oncol，2004，92（2）：553-558.

[10] 徐艷紅，溫宏武.雌激素受體亞型ERα和ERβ在子宮內膜癌中表達的研究[J].中國醫(yī)刊，2006，41（8）：31-33.

[11] Ali SH，O'Donnell AL，Balu D，et al. Estrogen receptor-alpha in the inhibition of cancer growth and angiogenesis [J]. Cancer Res，2000，60（24）：7094-7098.

[12] Wik E，Raeder MB，Krakstad C，et al. Lack of estrogen receptor-alpha is associated with epithelial-mesenchymal transition and PI3K alterations in endometrial carcinoma [J]. Clin Cancer Res，2013，19（5）：1094-1105.

[13] Pertschuk LP，Masood S，Simone J，et al. Estrogen receptor immunocytochemistry in endometrial carcinoma：a prognostic marker for survival [J]. Gynecol Oncol，1996，63（1）：28-33.

[14] Jongen V，Briёt J，de Jong R，et al. Expression of estrogen receptor-alpha and -beta and progesterone receptor-A and -B in a large cohort of patients with endometrioid endometrial cancer [J]. Gynecol Oncol，2009，112（3）：537-542.

[15] Smuc T，Rizner TL. Aberrant pre-receptor regulation of estrogen and progesterone action in endometrial cancer [J]. Mol Cell Endocrinol，2009，301（1-2）：74-78.

[16] Shabani N，Kuhn C，Kunze S，et al. Prognostic significance of oestrogen receptor alpha （ER alpha） and beta （ER beta），progesterone receptor A（PR-A） and B（PR-B） in endometrial carcinomas [J]. Eur J Cancer，2007，43（16）：2434-2444.

[17] H■ring J，Skrzypczak M，Stegerer A，et al. Estrogen receptor β transcript variants associate with oncogene expression in endometrial cancer [J]. Int J Mol Med，2012，29（6）：1127-1136.

[18] Mylonas I. Prognostic significance and clinical importance of estrogen receptor alpha and beta in human endometrioid adenocarcinomas [J]. Oncol Rep，2010，24（2）：385-393.

[19] Zannoni GF，Monterossi G，De Stefano I，et al. The expression ratios of estrogen receptor α （ERα） to estrogen receptor β1（ERβ1）and ERα to ERβ2 identify poor clinical outcome in endometrioid endometrial cancer [J]. Hum Pathol，2013，44（6）：1047-1054.

[20] Paech K，Webb P，Kuiper GG，et al. Differential ligand activation of estrogen receptors ER alpha and ER beta at AP1 sites [J]. Science，1997，277（5331）：1508-1510.

（收稿日期：2015-10-09 本文編輯：任 念）

Expression of estrogen receptor subtype and its relationship with clinicopathology in adenocarcinoma of endometrium

CHEN Guowei1，2 ZHOU Yunxia1 ZHANG Jieqing1▲ LI Li1

1.Department of Gynecologic Oncology， Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530021， China； 2.Department of Obstetrics and Gynecology， Guangxi Medical University Fourth Hospital， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Liuzhou 545005， China

[Abstract] Objective To explore the expression of estrogen receptor alpha （ERα） and beta （ERβ） and its relationship with clinical and pathological characteristics in tissues with adenocarcinoma of endometrium. Methods 93 cases of endometrial adenocarcinoma （endometrial adenocarcinoma group） and 31 cases of normal endometrium （control group） from January 2011 to December 2012 in Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University were selected， Real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） and immunohistochemistry were used to detect the expression of ERα and ERβ in endometrial tissues of two groups. Results Expression of ERα mRNA and protein， ERα/ERβ mRNA were significantly lower in endometrial adenocarcinoma group than that in control group （P < 0.05 or P < 0.01）； with the increasing of clinical stages， histological grades and depth of myometrial invasion， the expression of ERα mRNA and protein， ERα/ERβ mRNA were significantly reduced （P < 0.05 or P < 0.01）； compared with the control group， expression of ERβ mRNA and protein in endometrial adenocarcinoma group were reduced， the difference was no statistically significant （P > 0.05）. There was a negative correction between ERα and ERβ in endometrial adenocarcinoma（r = -0.234， P < 0.05）. Conclusion ERα may play a different and more important role in the occurrence and development of endometrial carcinoma compared to ERβ， ERα/ERβ mRNA ratio can be used to judge prognosis of endometrial carcinoma.

[Key words] Endometrial adenocarcinoma； Estrogen receptor alpha； Estrogen receptor beta