張暄琳，李毅，劉麗，張文靜，孟祥烔，徐鳳琴

炎癥因子對非PCOS患者顆粒細(xì)胞活性氧水平及線粒體DNA拷貝數(shù)的影響

張暄琳，李毅，劉麗，張文靜，孟祥烔，徐鳳琴△

目的探討炎癥因子對非多囊卵巢綜合征（PCOS）患者顆粒細(xì)胞活性氧（ROS）水平及線粒體DNA（mtDNA）的影響。方法選擇體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療的非PCOS患者50例，提取卵泡液中顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，隨機(jī)分為炎癥因子處理組和對照組，處理組分別加入5 nmol/L的炎癥因子白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α，對照組加入等量炎癥因子稀釋液，比較各組顆粒細(xì)胞ROS水平及mtDNA拷貝數(shù)是否存在差異。結(jié)果IL-1、IL-6、TNF-α處理組顆粒細(xì)胞ROS水平及mtDNA拷貝數(shù)均顯著高于對照組（均P＜0.05）。結(jié)論炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α可導(dǎo)致顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高和線粒體受損。

白細(xì)胞介素類；腫瘤壞死因子α；活性氧；DNA，線粒體；顆粒細(xì)胞

多囊卵巢綜合征（PCOS）、子宮內(nèi)膜異位癥及部分免疫性不孕患者體內(nèi)炎癥因子，如白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α水平高于正常人群［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)慢性炎癥反應(yīng)影響女性生殖健康，高水平炎癥因子降低卵母細(xì)胞質(zhì)量，降低妊娠率［2］。另有研究顯示氧化應(yīng)激在PCOS等不孕癥相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用［3］，氧化應(yīng)激過程產(chǎn)生的活性氧（ROS）可損傷線粒體，引起線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)的改變，嚴(yán)重者可引起細(xì)胞凋亡［4］。顆粒細(xì)胞對卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟起重要的調(diào)控作用，影響卵泡啟動(dòng)、發(fā)育、成熟及閉鎖的全過程，顆粒細(xì)胞受損會(huì)降低卵母細(xì)胞的質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能［5］。目前關(guān)于慢性炎癥狀態(tài)是否對顆粒細(xì)胞產(chǎn)生影響尚不完全清楚。本研究旨在探討炎癥因子是否影響顆粒細(xì)胞ROS及mtDNA拷貝數(shù)，進(jìn)一步明確高炎性狀態(tài)與不孕的關(guān)系。

1　對象與方法

1.1研究對象選擇2014年5月—2015年5月于我科接受體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療的非PCOS患者50例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡＜35歲，月經(jīng)周期規(guī)律（25～35 d），基礎(chǔ)內(nèi)分泌檢查無異常。排除甲狀腺疾病、腎上腺疾病及其他可能影響內(nèi)分泌系統(tǒng)的疾病，超聲檢查排除多囊卵巢、子宮內(nèi)膜異位改變，所有患者均知曉并自愿簽署知情同意書。

1.2超促排卵方案所有患者均采用長方案超促排卵。于排卵后5～7 d每日皮下注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑GnRH-a（商品名達(dá)必佳，輝凌制藥有限公司）0.05～0.10 mg。14～16 d后患者血清雌二醇≤50 ng/L，促卵泡激素（FSH）≤5 IU/L，黃體生成素（LH）≤5 IU/L，陰道B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度≤5 mm，多個(gè)卵泡直徑≤5～8 mm時(shí)，達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后給予促性腺激素（Gn）促排卵，根據(jù)卵泡發(fā)育情況調(diào)整劑量。當(dāng)1個(gè)卵泡平均直徑超過18 mm或2個(gè)卵泡平均直徑超過17 mm或3個(gè)卵泡平均直徑超過16 mm時(shí)給予人絨毛膜促性腺激素（HCG）10 000 U肌內(nèi)注射，36 h后取卵。

1.3顆粒細(xì)胞的提取留取所有卵泡液，將液體以2 000 r/min離心5 min，棄上清液。剩余細(xì)胞沉淀物重懸于DMEM/F12培養(yǎng)液（美國Gibco公司），以2∶3體積比將細(xì)胞懸液移至體積分?jǐn)?shù)45%Percoll分離液（美國Sigma公司）的表面，以2 000 r/min離心20 min。吸出位于界面處的顆粒細(xì)胞層，加入5倍體積的PBS，1 000 r/min離心3 min后棄上清。加入等體積10%透明質(zhì)酸酶消化1.5 min，用2倍體積含F(xiàn)BS（美國Gibco公司）的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化。再次用PBS洗滌細(xì)胞，用DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。

1.4顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)取0.1 mL細(xì)胞懸液加等量臺(tái)盼藍(lán)（美國Sigma公司）染色，檢測存活細(xì)胞在75%以上。血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×104/mL密度接種于12孔培養(yǎng)板，每孔內(nèi)含1 mL培養(yǎng)液。每例患者接種4板，隨機(jī)編號(hào)為1、2、3、4號(hào)，其中1號(hào)為IL-1組，2號(hào)為IL-6組，3號(hào)為TNF-α組，4號(hào)為對照組。1、2、3號(hào)分別加入IL-1、IL-6及TNF-α（IL-1、IL-6、TNF-α購自ProSpec公司，用18 MΩ·cm水稀釋）至培養(yǎng)液中炎癥因子濃度為5 nmol/L，4號(hào)加入等量18 MΩ·cm水。置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h換液1次，144 h后用PBS沖洗顆粒細(xì)胞，待測。

1.5顆粒細(xì)胞內(nèi)ROS的測定應(yīng)用ROS檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）檢測顆粒細(xì)胞內(nèi)ROS水平。炎癥因子處理組與對照組分別加入10 μmol/L的DCFH-DA 200 μL，置于37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min，用PBS洗3遍。用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

1.6顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)測定按DNA提取試劑盒（TAKARA公司）說明提取DNA，首先制備mtDNA標(biāo)準(zhǔn)品并梯度稀釋后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用Real-time PCR檢測炎癥因子處理組與對照組中顆粒細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)ND1（mtDNA管家基因）。ND1片段為mtDNA高度保守序列，可反映mtDNA的總量。應(yīng)用ABI PRISM7900H T實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosysterms）檢測mtDNA拷貝數(shù)。運(yùn)用Sequence Detector Systems Version 2.0軟件（Applied Biosystems）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。ND1基因擴(kuò)增引物：上游5′-GGCTACATACAATTACGCAAAG-3′，下游5′-TAGAATGGA GTAGACCGAAAGG-3'，目的片段長度221 bp。β-actin引物擴(kuò)增片段：上游5′-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3′，下游5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′，目的片段長度110 bp。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 s，95℃變性5 s，61℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1入組患者一般情況50例患者平均年齡（29.65±0.67）歲，體質(zhì)指數(shù)（22.38±0.22）kg/m2，基礎(chǔ)內(nèi)分泌：FSH（6.18±0.24）IU/L，LH（3.65±0.39）IU/L，睪酮（0.79±0.08）nmol/L。基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)（9.50±5.26）個(gè)。Gn使用時(shí)間（14.20±1.20）d，Gn劑量（2 249.40± 245.70）IU。發(fā)育卵泡數(shù)（7.12±4.08）個(gè)，獲卵數(shù)（6.02±4.62）個(gè)。

2.2炎癥因子對顆粒細(xì)胞ROS水平的影響炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α處理組的ROS水平和mtDNA拷貝數(shù)均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1The level of ROS and copy number of mtDNA in granulosa cells in treatment group and control group表1　炎癥因子處理組與對照組顆粒細(xì)胞的ROS及mtDNA拷貝數(shù)

Tab.1The level of ROS and copy number of mtDNA in granulosa cells in treatment group and control group表1　炎癥因子處理組與對照組顆粒細(xì)胞的ROS及mtDNA拷貝數(shù)

＊P＜0.05；a與對照組比較，P＜0.05

組別n ROS（ng/mL）mtDNA拷貝數(shù)（copy/μg，×105）對照組IL-1組IL-6組TNF-α組F 91 2 14 15 1.00±0.89 3.64±0.43a 4.13±0.65a 3.98±0.65a 26.387＊4.00±0.62 6.32±0.99a 6.84±1.02a 5.99±0.89a 31.316＊

3　討論

PCOS是不孕癥的常見病因之一，研究證實(shí)患PCOS、子宮內(nèi)膜異位癥等疾病的女性體內(nèi)炎癥因子水平普遍高于正常人群［1］，在IVF-ET治療時(shí)表現(xiàn)為卵子及胚胎質(zhì)量下降、妊娠率低而流產(chǎn)率高等特點(diǎn)。近年來慢性炎癥反應(yīng)對女性生殖健康的影響越來越受到關(guān)注。Ebejer等［6］認(rèn)為PCOS患者妊娠率低可能與體內(nèi)炎癥因子導(dǎo)致卵巢功能障礙有關(guān)，但具體的作用機(jī)制尚不十分清楚。另有研究表明PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞凋亡率較非PCOS患者明顯升高，卵母細(xì)胞質(zhì)量降低與卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞代謝功能異常及過度凋亡有關(guān)［7］。為了探討PCOS患者體內(nèi)高炎癥狀態(tài)是否影響顆粒細(xì)胞的代謝功能，從而尋找導(dǎo)致PCOS患者卵子及胚胎質(zhì)量下降的可能因素，本研究選擇非PCOS患者IVF-ET后卵泡液中的顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)，于培養(yǎng)液中添加炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α模擬機(jī)體內(nèi)慢性炎癥狀態(tài)對顆粒細(xì)胞的影響，從ROS及線粒體方面分析慢性炎癥狀態(tài)下顆粒細(xì)胞正常生理狀態(tài)是否發(fā)生改變。

ROS是炎癥反應(yīng)的效應(yīng)器，近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，ROS在不孕癥的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用。ROS啟動(dòng)竇卵泡顆粒細(xì)胞凋亡［8］，誘發(fā)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中非整倍體形成［3］。Elizur等［9］研究認(rèn)為卵泡液中ROS水平降低時(shí)，胚胎質(zhì)量更高。本研究添加炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α后體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞，結(jié)果提示炎癥因子處理組顆粒細(xì)胞中ROS水平均顯著高于對照組，這可能與炎癥因子水平升高打破機(jī)體內(nèi)ROS產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)［3］。另外，IL-1通過促進(jìn)胰島B細(xì)胞的一氧化氮生成和細(xì)胞凋亡而引起B(yǎng)細(xì)胞選擇性的破壞［10］；IL-6通過抑制胰島素介導(dǎo)的脂肪合成、葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)及抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)［1］；TNF-α通過促進(jìn)脂肪分解引起血漿游離脂肪酸水平增高［2］，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，過剩的糖類物質(zhì)和游離脂肪酸氧化產(chǎn)生ROS，引發(fā)氧化應(yīng)激［11］，過多的ROS累積損傷顆粒細(xì)胞。

另外大量研究證實(shí)線粒體與卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育密切相關(guān)，使用影響線粒體生成的藥物處理成熟期小鼠后，卵子質(zhì)量下降，線粒體移植可以改善IVF妊娠結(jié)局［12］。mtDNA拷貝數(shù)提示線粒體功能水平，當(dāng)線粒體受損時(shí)通過提高mtDNA拷貝數(shù)以代償減弱的線粒體呼吸功能［4］。本研究結(jié)果顯示，3種炎癥因子處理組顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)均顯著高于對照組，提示高水平炎癥因子損傷顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒體功能。這可以用經(jīng)典的“ROS-線粒體損傷學(xué)說”解釋，細(xì)胞內(nèi)ROS累積破壞mtDNA，而mtDNA的損傷又會(huì)加劇ROS堆積，形成惡性循環(huán)［4］，提示高炎癥狀態(tài)影響線粒體正常呼吸功能，導(dǎo)致ROS累積，ROS加劇線粒體損傷，導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)代償性增加。mtDNA缺乏組蛋白保護(hù)，較易發(fā)生基因變異，導(dǎo)致線粒體的能量代謝出現(xiàn)異常，影響顆粒細(xì)胞的正常生理功能，誘發(fā)顆粒細(xì)胞的凋亡。而顆粒細(xì)胞在雌激素合成、卵泡發(fā)育及卵子成熟上起重要作用。這可能是PCOS患者卵子及胚胎質(zhì)量下降、妊娠率下降而流產(chǎn)率增高的因素之一，因此PCOS患者在進(jìn)行IVF-ET前改善高炎癥狀態(tài)對改善患者的妊娠結(jié)局至關(guān)重要。

本研究初步解釋了機(jī)體處于慢性炎癥狀態(tài)與顆粒細(xì)胞功能受損之間的關(guān)系。目前關(guān)于慢性炎癥反應(yīng)與女性不孕癥關(guān)系的研究尚處于起步階段，炎癥因子是否影響卵巢微環(huán)境、不同炎癥因子濃度下顆粒細(xì)胞生理功能是否存在差異、抗炎藥物及抗氧化劑對提高IVF-ET成功率是否存在幫助等一系列問題，仍需進(jìn)一步研究。

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（2016-01-09收稿2016-04-12修回）

（本文編輯魏杰）

Effects of inflammatory markers on the level of reactive oxygen species and mitochondria DNA copy numbers in granulosa cells of patients without PCOS

ZHANG Xuanlin，LI Yi，LIU Li，ZHANG Wenjing，MENG Xiangtong，XU Fengqin△
Department of Reproductive，Tianjin First Center Hospital，Tianjin 300192，China△

E-mail：xufengqin1968@126.com

ObjectiveTo study the effect of inflammatory markers on the level of reactive oxygen species（ROS）and mitochondrial DNA（mtDNA）copy numbers in granulosa cells of patients without polycystic ovary syndrome（PCOS）. MethodsFifty patients without PCOS treated with in vitro fertilization and embryo transfer（IVF-ET）were selected in this study.The granulosa cells were extracted and cultured in vitro.Cells were randomly divided into treatment group and control group.The 5 nmol/L interleukin（IL）-1，IL-6 and tumor necrosis factor（TNF）-α were given to treatment group，and same amount of inflammatory diluted solution was added to control group.The levels of ROS and copy numbers of mtDNA were compared between two groups.ResultsThe ROS levels and mtDNA copy number of granulosa cells were significantly higher in IL-1，IL-6 and TNF-α treatment groups than those of control group（P＜0.05）.ConclusionInflammatory markers of IL-1，IL-6 and TNF-α increase the level of ROS and damage mtDNA in granulosa cells.

interleukins；tumor necrosis factor-alpha；reactive oxygen species；DNA，mitochondrial；granulosa cells

R711.6

A

10.11958/20160013

天津市衛(wèi)生局科技基金（2013KZ033）

天津市第一中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（郵編300192）

張暄琳（1989），女，碩士，主要從事生殖醫(yī)學(xué)研究

E-mail：xufengqin1968@126.com