沈露夢，鐘永軍，施珊珊，周超陽，楊仲毅

（臺州學(xué)院　生命科學(xué)學(xué)院，浙江　臺州　318000）

孟魯司特中間體酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)的HPLC測定方法

沈露夢，鐘永軍，施珊珊，周超陽，楊仲毅＊

（臺州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江臺州318000）

建立了孟魯司特中間體酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)中底物和產(chǎn)物濃度變化的HPLC測定方法。采用C18反相色譜柱，以乙腈和0.1%磷酸（80:20）為流動相，檢測波長為225 nm。結(jié)果表明，底物和產(chǎn)物濃度在50~400μg/m l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，適用于孟魯司特中間體酶促反應(yīng)的監(jiān)控。

孟魯司特中間體；酮還原酶；生物催化；高效液相色譜

孟魯司特（Montelukast），中文商品名順爾寧（英文商品名Singulair），是美國默克公司最早研發(fā)的一種白三烯受體拮抗劑，通過競爭性地結(jié)合I型半胱氨酰白三烯受體，進(jìn)而有效控制哮喘癥狀［1，2］。臨床上，孟魯司特主要被用于治療阿司匹林過敏性哮喘、運動性哮喘和季節(jié)性過敏性鼻炎等［3］。

2012年，孟魯司特全球銷售額達(dá)到43.8億美元（http://www.evaluategroup.com）［4］，其化合物專利EP480717B已于2012年到期［5］，因而給國內(nèi)的相關(guān)企業(yè)生產(chǎn)孟魯司特提供了機(jī)會。為減少生產(chǎn)成本，許多生產(chǎn)廠家采用生物催化法合成孟魯司特的關(guān)鍵中間體化合物1（圖1）［6］，取代原工藝中成本高、污染大且需高溫高壓的化學(xué)合成步驟［7］。

圖1　酮還原酶催化的轉(zhuǎn)化反應(yīng)Fig.1 Transformation Catalyzed by Ketone Reductase

1的檢測方法有手性和非手性兩種，其酶促轉(zhuǎn)化過程的優(yōu)化及工業(yè)化開發(fā)更多的用到非手性HPLC檢測方法。文獻(xiàn)報道的非手性HPLC方法或者分析時間較長，如樂庸堂［8］等人采用HPLC方法樣品分析時間需要30 m in，且未說明測定的具體條件；或者需要進(jìn)行梯度洗脫，如Liang［6］等人采用4.5×50 mm C18短色譜柱，梯度洗脫方法測定1和2，出峰時間分別為4.4 m in和5.7 m in。本文報道利用常規(guī)HPLC和等度洗脫的分析方法，可以在12 m in內(nèi)完成分析，且能同時測定反應(yīng)液中產(chǎn)物1和底物2的濃度變化。

1　儀器與試藥

LC3000型HPLC系統(tǒng)（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司），配備P3000高壓輸液泵，UV3000紫外/可見波長檢測器，KNAUER Dynam ic Mixing Chamber，RPL-D2000型柱溫箱。

1、2對照品由浙江天宇藥業(yè)提供，批號分別為140801和140803，含量分別為99.83%和99.65%；酮還原酶酶液來源于表達(dá)酮還原酶的大腸桿菌的全細(xì)胞裂解液，該菌種由本實驗室保藏；無水乙醇、DMSO、硫酸鎂、異丙醇、三乙醇胺、乙腈、磷酸、輔酶II購自國藥集團(tuán)或上海生工。

2　方法與結(jié)果

2.1對照品溶液配制

1、2對照品溶液：準(zhǔn)確稱取適量1和2對照品，分別先用無水乙醇和DMSO溶解，再用無水乙醇稀釋制成1000μg/m L的貯存液，臨用時直接用無水乙醇將貯存液稀釋到所需濃度。

2.2色譜條件

色譜柱為Cosmosil 5C18-MS-II（4.6×250 mm，5μm），流動相為乙腈和0.1%磷酸（80:20），柱溫40℃，流速1.0 m L/m in，檢測波長225 nm，進(jìn)樣量20μL。

2.3專屬性及系統(tǒng)適用性試驗

取1、2對照品儲存液按體積比1:1混勻，按2.2節(jié)色譜條件進(jìn)行HPLC檢測，典型的色譜結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，1、2的保留時間分別是6.346 m in和10.977 m in，理論塔板數(shù)分別為8911和11808，相互分離度為22.55，表明按2.2條件操作的HPLC分離效果良好。

圖2　 典型HPLC色譜圖Fig.2 Typical HPLC Chromatogram

2.4線性試驗

分別取50、100、150、200、250、300、350、400、450、500μg/m L的1、2對照品液進(jìn)行HPLC測定。以1、2的濃度c（μg/m L）對峰面積A進(jìn)行線性回歸，典型的1、2的回歸方程分別為：A=8×107c-81908，r= 0.998；A=9×107c+53364，r=0.997。結(jié)果表明，在50～400μg/m L濃度范圍內(nèi)，1、2的峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。

2.5精密度試驗

取1和2對照品溶液稀釋到50、200、400μg/m L，分別重復(fù)進(jìn)行HPLC測定5次，計算得1、2的RSD分別為0.43%、0.50%、0.58%和0.84%、1.02%、1.85%，表明1、2的HPLC檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性良好。

2.6穩(wěn)定性試驗

分別取1、2對照品溶液，其中一管放置在4℃，另一管放置在25℃，并分別于0、3、6、9、16.5 h取樣，以無水乙醇稀釋3倍后進(jìn)行HPLC測定。結(jié)果顯示，在25℃條件下，1在6 h內(nèi)穩(wěn)定，其RSD為0.54%；2 在3 h內(nèi)穩(wěn)定，其RSD為0.12%。而在4℃條件下，1、2在16.5h內(nèi)都穩(wěn)定，其峰面積的RSD分別為0.92% 和0.77%。以上結(jié)果表明，溫度對1和2的穩(wěn)定性影響很大，低溫可以有效增加1和2的穩(wěn)定性。

2.7回收率試驗

取酶促反應(yīng)液樣品10 m L，加入無水乙醇10 m L后混勻，于4℃ 10000 r/m in離心10 m in，上清取樣以無水乙醇稀釋100倍后進(jìn)行HPLC測定，另取上清液各1.0 m L，分別加入6.3 mg 1和4.9 mg 2，分別取樣測定3次，計算得1、2的平均回收率分別為104.1%和100.3%，RSD分別為1.5%和0.51%。

2.8酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)及反應(yīng)液的HPLC測定

取200 mg 2，依次加入1 m L異丙醇，0.6 m L的三乙醇胺緩沖液（0.1 mol/L，pH 8.5），1.5μL 1.0 mol/L的MgSO4溶液、2.0 mg還原型輔酶II、0.4 m L酮還原酶酶液于5 m L離心管中混勻，在45℃，170 r/m in的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)。在反應(yīng)不同時間取樣，用無水乙醇稀釋200倍，10000 r/m in離心2 m in，上清分別進(jìn)行HPLC測定，結(jié)果見圖3。雖然1和2的溶液在25℃條件下存在不穩(wěn)定性，但根據(jù)HPLC測定，酶促反應(yīng)過程中底物2不斷向產(chǎn)物1轉(zhuǎn)化，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到99%以上，說明反應(yīng)過程中1和2降解較少。這可能與酶促反應(yīng)采取的非均相體系有關(guān)，反應(yīng)過程中大部分底物和產(chǎn)物處于固相狀態(tài)，減少了破壞。

圖3　轉(zhuǎn)化過程檢測Fig.3 Detection along w ith Transformation Process

3　討論

本文研究過程中發(fā)現(xiàn)，底物2在無水乙醇中溶解度較小，而在DMSO中溶解度較大；產(chǎn)物1在無水乙醇中溶解度較大，而在DMSO中溶解度較小。為了保證產(chǎn)物1的檢測靈敏性，我們只在配置底物2貯存液時用DMSO，而產(chǎn)物1的溶解和轉(zhuǎn)化反應(yīng)液的稀釋都用無水乙醇。此外，本研究曾使用過乙腈和0.1%磷酸的配比為60:40時，底物和產(chǎn)物的保留時間分別為20.673和14.510 m in；乙腈和0.1%磷酸的配比為70:30時，底物和產(chǎn)物的保留時間分別為13.972和8.664 m in。上述結(jié)果表明，適當(dāng)增加流動相中有機(jī)溶劑的比例可以有效縮短底物和產(chǎn)物的保留時間，同時不影響底物和產(chǎn)物的分離檢測效果，進(jìn)而可以提高HPLC的檢測效率。

化合物1雖然是孟魯司特的手性中間體，但對于工藝開發(fā)過程，非手性HPLC具有更大的實用價值。本文結(jié)果同時表明，常規(guī)的HPLC方法可以對孟魯司特中間體的生物催化過程提供監(jiān)控和指導(dǎo)作用。

［1］King AO,Corley EG,Anderson RK,et al.An efficient synthesis of Ltd4 antagonist L-699,392［J］.J Org Chem,1993,58（14）:3731-5.

［2］Zhang HP,Jia CE,Lv Y,et al.Montelukast for prevention and treatment of asthma exacerbations in adults: systematic review and meta-analysis［J］.A llergy Asthma Proc,2014,35（4）:278-87.

［3］武玉清.白三烯受體拮抗劑孟魯司特的研究進(jìn)展 ［J］.國外醫(yī)學(xué)：藥學(xué)分冊,2003,30（5）:284-7.

［4］http://www.evaluategroup.com/Universal/View.aspx?type=Entity&entityType=Product&lType=modData&id= 19133&componentID=1002#&&_View Args=%7b%22_EntityType%22%3a2%2c%22_Parameters%22%3a%7b% 22_ContextData%22%3a%22%7b%5c%22com ponentID%5c%22%3a%5c%221003%5c%22%2c%5c%22item ID%5c%22%3a%5c% 228709%5c%22%2c%5c%22lType%5c%22%3a%5c%22modData%5c%22%2c%5c%22pgaName%5c%22%3a%5c%22%5c%22%2c% 5c%22reportingCurrency%5c%22%3a%5c%22%5c%22%2c%5c%22sceName%5c%22%3a%5c%22%5c%22%2c%5c%22tab Id% 5c%22%3a%5c%22%5c%22%2c%5c%22conceptTab%5c%22%3a%5c%22%5c%22%7d%22%7d%2c%22_Type%22%3a3%7d

［5］Leger S,Roy P,Xiang YB,et al.Unsaturated hydroxyalkyquinoline acids as leukotriene antagonists:EP, 480717B［P］.1992-04-15.

［6］Liang J,Lalonde J,Borup B,et al.Development of a biocatalytic process as an alternative to the（-）-DIP-Clmediated asymmetric reduction of a key intermediate of montelukast［J］.Org Process Res Dev,2010,14（1）:193-8.

［7］Zhao MZ,King AO,Larsen RD,et al.A convenient and econom ical method for the preparation of DIPChloride（TM）and its app lication in the asymmetric reduction of aralkyl ketones［J］.Tetrahedron Lett,1997,38 （15）:2641-4.

［8］樂庸堂,鞠鑫.一種生物法制備孟魯斯特中間體的方法［P］.中國專利：103710405，2014-04-09.

HPLC M ethod for Analyzing Enzamatic Transformation of M ontelukast Intermediate

SHEN Lumeng，ZHONGYongjun，SHI Shanshan，ZHOU Chaoyang，YANG Zhongyi＊
（School of Life Science,Taizhou University,Taizhou 318000,China）

HPLC method w as established to analyze enzamatic transformation of montelukast intermediate.The column was Cosmosil 5C18-MS-II,the mobile phase was acetonitrile and 0.1%phosphoric acid(80:20),and the detection w avlength w as 225 nm.The results indicates that both the substrate and product of the enzymatic transformation show good linear relation at the range of 50~400μg/m l,and the method is suitable for the control of enzymatic transformation of montelukast intermediate.

Montelukast intermediate;Ketone reductase;Biocatalyst;HPL

10.13853/j.cnki.issn.1672-3708.2016.03.004

（責(zé)任編輯：耿繼祥）

2015-10-13；

2016-03-21

簡介：楊仲毅（1971-），男，浙江臺州人，高級工程師。