黃映紅，徐曉娟，秦旭華，王張，王秋香，李宛靜

成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075

◆實驗研究◆

內(nèi)異康復(fù)片對EMT大鼠VEGF、MMP-9、HGF及Wnt4、Wnt5α的調(diào)控機制研究

黃映紅，徐曉娟，秦旭華，王張，王秋香，李宛靜

成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075

目的：分析內(nèi)異康復(fù)片對子宮內(nèi)膜異位癥（EMT）大鼠異位內(nèi)膜黏附、浸潤及增生的調(diào)控作用，并探討其作用機制。方法：建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，隨機分為模型對照組、陽性對照組、中藥低、中、高劑量組，每組10只。治療3周后，測量各組大鼠異位內(nèi)膜體積；另取模型動物的異位內(nèi)膜組織，分離異位內(nèi)膜細(xì)胞，體外培養(yǎng)，設(shè)空白對照組、陽性對照組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組4個復(fù)孔。采用ELISA法測定血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）含量；Western Blot檢測Wnt4、Wnt5α的表達(dá)。結(jié)果：動物實驗結(jié)果：與模型對照組比較，中藥各劑量組、陽性對照組的異位內(nèi)膜體積顯著縮小，異位內(nèi)膜厚度變薄，腺體面積減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；中藥高劑量組、陽性對照組的腺體數(shù)目顯著少于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中藥高劑量組VEGF、MMP-9含量顯著低于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞實驗結(jié)果：中藥低、中、高各劑量組培養(yǎng)上清液的VEGF含量顯著低于空白對照組，中藥高劑量組MMP-9含量顯著低于空白對照組，中藥高劑量組和陽性對照組Wnt4、Wnt5α表達(dá)水平均顯著低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論：內(nèi)異康復(fù)片治療EMT的機理可能與抑制異位內(nèi)膜細(xì)胞分泌VEGF、MMP-9，以及調(diào)節(jié)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

內(nèi)異康復(fù)片；EMT模型大鼠；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）；基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）；肝細(xì)胞生長因子（HGF）；Wnt4；Wnt5α；動物實驗

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMT）屬于傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、癥瘕及不孕癥等范疇，其發(fā)病機理是具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織在子宮內(nèi)膜以外的部位生長、浸潤、出血，形成結(jié)節(jié)及包塊，從而引起女性下腹部疼痛，甚至不孕［1］。該病常見于育齡女性，發(fā)病率為10%～15%，且逐年上升［2～3］，為婦科難治性疾病之一。內(nèi)異康復(fù)片是四川省中醫(yī)院婦科數(shù)十年來治療EMT的特色院內(nèi)制劑，是療效明確的臨床驗方。課題組前期研究表明［4～7］，該藥可降低EMT模型動物血液黏度，改善微循環(huán)，促進異位內(nèi)膜萎縮，抑制其血管生成等。本文以課題組前期研究為基礎(chǔ)，對內(nèi)異康復(fù)片治療EMT的分子機制進行深入探討。

1　材料與方法

1.1實驗藥物和試劑內(nèi)異康復(fù)片由半枝蓮、大血藤、熟大黃、桃仁、三棱、莪術(shù)、薏苡仁、土鱉蟲、鱉甲等中藥組成，0.3 g/片，由四川省中醫(yī)院生產(chǎn)，批號：20120403；來曲唑片，每片2.5 mg，由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：2012-03-20。在進行離體實驗時，取內(nèi)異康復(fù)片于乳缽內(nèi)搗碎，置錐形瓶中，加DMEM培養(yǎng)液（比例為0.1 g/mL），超聲振蕩助溶2 h，于4℃密閉浸泡72 h后，取上清液，0.22 μm微孔濾器過濾，得內(nèi)異康復(fù)片貯存液，備用，實驗時用DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度；來曲唑片用DMEM培養(yǎng)液溶解，0.22 μm微孔濾器過濾后使用。DMEM培養(yǎng)基（批號：NXE0631，賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司）；無支原體胎牛血清（批號：111020，浙江天杭生物科學(xué)有限公司）；Rat-VEGF Elisa Kit、Rat-MMP-9 Elisa Kit（批號分別為：13051201、13051203，美國R&D公司進口分裝）；Rat-HGF Elisa Kit（批號：RT130371，美國ADL公司進口分裝）；wnt4、wnt5α抗體（批號：MAB1501，Santa Cruz公司）；二抗（批號：A5420，sigma公司）。

1.2實驗動物分組、造模、給藥及檢測SD大鼠，SPF級，雌性，體重200～250 g，成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（川）2013-24。雌性SD大鼠50只隨機分為模型對照組，陽性對照組，中藥高、中、低3個劑量組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，監(jiān)測大鼠動情周期，參考文獻方法［8］，在動情期行手術(shù)異位移植子宮內(nèi)膜，建立大鼠EMT模型。造模術(shù)后第21 d給藥，中藥高、中、低劑量組分別給予內(nèi)異康復(fù)片1.512 g/kg（相當(dāng)于成人劑量的14倍）、0.756 g/kg（相當(dāng)于成人劑量的7倍）、0.378 g/kg（相當(dāng)于成人劑量的3.5倍）灌胃，陽性對照組給予來曲唑片0.35 mg/kg（相當(dāng)于成人劑量的7倍）灌胃，每天1次，連續(xù)21 d，模型對照組給予等體積生理鹽水灌胃。末次給藥后24 h眼眶取血，離心分離血清，采用ELISA法測定血清中VEGF、MMP-9、HGF含量。處死動物后分離其腹腔內(nèi)的異位內(nèi)膜組織，用兩腳規(guī)測量異位內(nèi)膜的體積長（mm）×寬（mm）×高（mm）［9］。并取異位內(nèi)膜組織制備病理切片，行HE染色，觀察各組大鼠異位內(nèi)膜形態(tài)學(xué)差異，檢測異位內(nèi)膜腺體數(shù)量、腺體面積。實驗中個別大鼠由于手術(shù)感染死亡，其中模型對照組死亡2只，陽性對照組死亡1只，中藥高劑量組死亡2只。

1.3異位內(nèi)膜細(xì)胞的培養(yǎng)及指標(biāo)的檢測EMT大鼠模型造模方法同1.2，造模第21天，無菌條件下取出異位內(nèi)膜組織，此時異位內(nèi)膜成囊泡狀，囊泡內(nèi)可見淡黃色透明積液者為造模成功的異位內(nèi)膜組織。參考文獻［10］方法，分離細(xì)胞并接種培養(yǎng)。分為空白對照組、陽性對照組，中藥高、中、低劑量組，每組設(shè)4個復(fù)孔。陽性對照組加入終濃度為5×10-5mg/mL的來曲唑水提液，中藥高、中、低劑量組分別加入終濃度為50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL的內(nèi)異康復(fù)片水提液，空白對照組用等體積DMEM培養(yǎng)液代替受試藥物，孵育48 h后，收集培養(yǎng)上清液，用ELISA法檢測VEGF、MMP-9、HGF含量。0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，取細(xì)胞裂解液行Western Blotting檢測，測定異位內(nèi)膜組織細(xì)胞內(nèi)Wnt4、Wnt5α表達(dá)水平。Western Blot結(jié)果用Biorad公司的Quantity One軟件分析，計算目的條帶的相對灰度值，即目的蛋白的免疫印跡灰度與內(nèi)參β-actin蛋白的灰度的比值，以表示目的蛋白的相對表達(dá)量，單位為DPI（dots per inch）。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法HE染色及WesternBlotting結(jié)果用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析；ELISA實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用《中國醫(yī)學(xué)百科全書·醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)》統(tǒng)計軟件包PEMS3.1進行統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠異位內(nèi)膜體積及內(nèi)膜厚度比較見表1和圖1。與模型對照組比較，中藥各劑量組、陽性對照組的異位內(nèi)膜體積顯著縮小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。中藥各劑量組、陽性對照組的異位內(nèi)膜厚度均顯著小于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。圖1主要說明各組移植物的結(jié)構(gòu)和生長情況，各組移植灶結(jié)構(gòu)完整，由外向內(nèi)依次為內(nèi)膜層、肌層和漿膜層，提示建模成功。圖1-A中箭頭所指可見模型對照組異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈長柱狀或假復(fù)層上皮細(xì)胞，間質(zhì)較薄。圖1-B～E中箭頭所指可見陽性對照組及中藥低、中、高劑量組異位內(nèi)膜不同程度地萎縮變薄，異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈扁平狀。

表1　各組大鼠異位內(nèi)膜體積及厚度比較（±s）

表1　各組大鼠異位內(nèi)膜體積及厚度比較（±s）

與模型對照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組別模型對照組陽性對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組樣本數(shù)（只）8 9 10 10 8異位內(nèi)膜體積（mm3）19.69±1.60 6.89±1.6②15.50±1.06①12.01±0.89①8.00±1.60②異位內(nèi)膜厚度（um）23.88±5.30 6.00±1.58①9.40±1.80①6.10±1.80①4.63±1.32①

圖1　各組大鼠異位內(nèi)膜病理切片 （HE染色，100×）

2.2各組大鼠異位內(nèi)膜腺體數(shù)目、腺體面積比較見表2和圖2。中藥高劑量組、陽性對照組腺體數(shù)目顯著少于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中藥各劑量組、陽性對照組的腺體面積均顯著小于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。圖2表明各組大鼠移植灶內(nèi)腺體分布的情況。圖2-A顯示模型對照組異位內(nèi)膜內(nèi)有腺體分布，圖中箭頭所指可見腺上皮層較厚，上皮細(xì)胞為柱狀；圖2-B～E圖中箭頭所指可見，跟模型對照組比較，陽性對照組及中藥低、中、高劑量組異位內(nèi)膜中腺體數(shù)量顯著減少、腺體面積明顯縮小，腺上皮層變薄。

表2　各組大鼠異位內(nèi)膜腺體數(shù)目、腺體面積比較（±s）

表2　各組大鼠異位內(nèi)膜腺體數(shù)目、腺體面積比較（±s）

與模型對照組比較，①P＜0.05

組別模型對照組陽性對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組樣本數(shù)（只）8 9 10 10 8腺體數(shù)目（個）12.50±5.80 3.44±2.60①10.50±4.48 9.40±6.31 4.50±2.56①腺體面積（mm2）4.17±1.03 0.96±0.47①2.96±1.09①1.43±0.31①1.20±0.60①

圖2　各組大鼠異位內(nèi)膜腺體病理切片 （HE染色，100×）

2.3各組大鼠血清中VEGF、MMP-9、HGF含量比較見表3。中藥高劑量組VEGF、MMP-9含量顯著低于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4各組大鼠異位內(nèi)膜細(xì)胞分泌VEGF、MMP-9、HGF含量比較見表4。中藥低、中、高各劑量組培養(yǎng)上清液的VEGF含量顯著低于空白對照組；中藥高劑量組MMP-9含量顯著低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。

2.5各組大鼠異位內(nèi)膜細(xì)胞中Wnt4、Wnt5α表達(dá)水平比較見圖3、圖4、表5。中藥高劑量組和陽性對照組Wnt4、Wnt5α表達(dá)水平均顯著低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 各組大鼠血清中VEGF、MMP-9、HGF含量比較（±s）ng/L

表3 各組大鼠血清中VEGF、MMP-9、HGF含量比較（±s）ng/L

與模型對照組比較，①P＜0.05

組別模型對照組陽性對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組樣本數(shù)（只）8 9 10 10 8 V EGF 207.58±31.61 175.13±30.57 170.47±30.91 168.05±33.02 150.31±15.39①M M P-9 33.33±8.01 25.98±9.94 25.88±8.95 22.80±7.16 18.27±4.96①HGF 65.32±22.70 61.08±21.12 60.18±20.02 59.48±21.14 59.93±19.97

表4 各組大鼠異位內(nèi)膜細(xì)胞分泌VEGF、MMP-9、HGF含量比較（±s，n=4）　ng/L

表4 各組大鼠異位內(nèi)膜細(xì)胞分泌VEGF、MMP-9、HGF含量比較（±s，n=4）　ng/L

與空白對照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組別空白對照組陽性對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組V EG F 129.25±19.02 105.13±23.89 97.13±14.77①91.38±28.26①83.48±24.07②M M P-9 26.67±7.52 19.31±6.10 20.88±4.69 17.80±6.07 13.43±6.96①H G F 28.65±9.45 26.08±9.54 25.18±6.80 21.15±9.43 18.27±6.46

圖3　各組大鼠異位內(nèi)膜細(xì)胞中Wnt4表達(dá)水平比較

圖4　各組大鼠異位內(nèi)膜細(xì)胞中Wnt5α表達(dá)水平比較

表5　各組大鼠異位內(nèi)膜細(xì)胞Wnt4、Wnt5α表達(dá)水平比較（±s，n=4）

表5　各組大鼠異位內(nèi)膜細(xì)胞Wnt4、Wnt5α表達(dá)水平比較（±s，n=4）

與空白對照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組別空白對照組陽性對照組中藥低劑量組W nt4（D PI）1.00±0.12 0.27±0.06②0.89±0.14 W nt5α（D PI）1.00±0.19 0.21±0.07②0.92±0.10中藥中劑量組中藥高劑量組0.74±0.08 0.43±0.05①0.79±0.12 0.46±0.11①

4　討論

內(nèi)異康復(fù)片中半枝蓮清熱解毒，大血藤活血通絡(luò)［11～12］；桃仁活血祛瘀；薏苡仁健脾滲濕；土鱉蟲、鱉甲破血祛瘀；三棱、莪術(shù)破血行氣，全方具有清濕化瘀，行氣止痛，消癥散結(jié)之效。臨床應(yīng)用該方治療子宮內(nèi)膜異位癥取得了較好療效，但對該方的作用機制尚需深入研究。Wnt/β-catenin信號通路在介導(dǎo)雌激素促進異位內(nèi)膜細(xì)胞黏附、侵襲和血管生成過程中可能起著關(guān)鍵的作用［13～14］。該信號通路下游分子VEGF和MMP與EMT病變區(qū)微血管密度增高、異位內(nèi)膜種植及生長關(guān)系密切，且VEGF與MMP的表達(dá)呈正相關(guān)［15］。VEGF是目前公認(rèn)的最重要的促血管生成因子［16］，VEGF的高表達(dá)可能是決定異位內(nèi)膜成功種植及生長的因素之一［17］。MMPs是參與基質(zhì)降解最重要的酶類，MMPs可降解細(xì)胞外基質(zhì)和基膜，誘導(dǎo)血管生成［18～19］。此外，HGF具有誘發(fā)上皮細(xì)胞遷移、侵襲以及誘發(fā)血管生成的多重功能［20～21］，臨床研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥患者血清中、腹腔液中HGF濃度均升高［22～24］。由此可見，Wnt信號分子在異位內(nèi)膜細(xì)胞的特征性表達(dá)以及HGF等生長因子的大量分泌在EMT的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著極為重要的作用。

本研究結(jié)果表明內(nèi)異康復(fù)片能使異位內(nèi)膜變薄、甚至萎縮，并可減少異位內(nèi)膜內(nèi)腺體數(shù)目、縮小腺體面積。內(nèi)異康復(fù)片的上述作用與藥物劑量呈正相關(guān)，提示臨床治療EMT可使用較大劑量的內(nèi)異康復(fù)片。Wnt4、Wnt5α在異位內(nèi)膜細(xì)胞特征性表達(dá)，血清和異位內(nèi)膜細(xì)胞上清液中VEGF、MMP-9含量明顯增加，說明Wnt信號通路可能參與了內(nèi)膜細(xì)胞異位黏附-浸潤性生長-血管生成的病理過程。內(nèi)異康復(fù)片能下調(diào)EMT細(xì)胞中Wnt4、Wnt5α的表達(dá)水平，同時抑制異位內(nèi)膜細(xì)胞分泌VEGF、MMP-9，并降低EMT大鼠血清中VEGF、MMP-9含量，提示內(nèi)異康復(fù)片可能通過阻斷Wnt信號通路以抑制異位內(nèi)膜細(xì)胞分泌VEGF、MMP-9，從而防止異位子宮內(nèi)膜的黏附、侵襲和血管生長。本研究探討了內(nèi)異康復(fù)片的作用機制，為更好指導(dǎo)臨床用藥提供了重要的實驗依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Regulatory Mechanism Study of Neiyi Kangfu Tablet on VEGF，MMP-9，HGF，Wnt4 and Wnt5α of Endometriosis Rats

HUANG Yinghong，XU Xiaojuan，QIN Xuhua，WANG Zhang，WANG Qiuxiang，LI Wanjing

Objective：To analyze the regulatory function of Neiyi Kangfu tablet on adhesion，infiltration and proliferation of Ectopic endometrial in rats with endometriosis（EMT）and to discuss its mechanism.Methods：Established rat models with endometriosis，and divided them into model control group，positive control group，Chinese medicine（CM）low-dose，mid-dose，high-dose group，10 cases in each group.After 3 week of treatment，endometriosis volume of rats in every group was measured.In addition，took endometriosis tissue and separated endometriosis cell，then cultured in vitro，divided into blank control group，positive control group，CM low-dose，mid-dose，high-dose group.Detected levels of vascular endothelial growth factor（VEGF），matrix metalloproteinase（MMP）and hepatocyte growth factor（HGF）by ELISA method，detected expression of Wnt4 and Wnt5α by Western Blot.Results：Comparing with model control group，endometriosis volume of CM every dose group and positive control group was decreased obviously，endometriosis thickness was thinned，gland area was reduced，the differences being significant（P＜0.01 or P＜0.05）.Gland numbers in CM high-dose group and positive control group were lower than that in model control group，the difference being significant（P＜0.05）.Levels of VEGFand MMP-9 in CM high-dose group were lower than those in model-dose group，the differences being significant（P＜0.05）. The levels of VEGF in culture supernate of CM low-dose，mid-dose，high-dose group were all lower than those in blank control group，the level of MMP-9 in CM high-dose group was lower than that in blank control group，expression levels of Wnt4 and Wnt5α were all lower than those in blank control group，the differences being significant（P＜0.05 or P＜0.01）. Conclusion：The mechanism of Neiyi Kangfu tablet for EMT can be related to inhibit endometriosis cell to secrete VEGF and MMP-9 and regulate Wnt signal transduction pathway.

Neiyi Kangfu tablet；Endometriosis model；Vascular endothelial growth factor（VEGF）；Matrix metalloproteinase（MMP）；Hepatocyte growth factor（HGF）；Wnt4；Wnt5α；Animal experiment；Rats

R285.5

A

0256-7415（2016）09-0217-05

10.13457/j.cnki.jncm.2016.09.097

2016-04-05

四川省中醫(yī)藥管理局應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（2012-F-020）；四川省科技廳基礎(chǔ)研究計劃項目（2013JY0184）

黃映紅（1972-），女，副教授，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

徐曉娟，E-mail：847956379@qq.com。