林玉婷，馬翔，蔡令波，曾橋，吳畏，刁飛揚(yáng)，劉嘉茵，千日成

玻璃化冷凍的卵母細(xì)胞在卵母細(xì)胞捐贈(zèng)中的應(yīng)用

林玉婷，馬翔，蔡令波，曾橋，吳畏，刁飛揚(yáng)，劉嘉茵，千日成

目的：分析玻璃化冷凍的卵母細(xì)胞在供卵周期中的臨床結(jié)局，以期為卵母細(xì)胞捐獻(xiàn)的臨床應(yīng)用提供參考。方法：回顧性分析2006年2月—2014年10月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床生殖醫(yī)學(xué)中心216個(gè)供卵周期的玻璃化冷凍的卵母細(xì)胞，比較解凍后的復(fù)蘇率、行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）的正常受精率、累計(jì)臨床妊娠率、種植率和累計(jì)活產(chǎn)率等臨床結(jié)局。結(jié)果：解凍玻璃化凍存的卵母細(xì)胞的復(fù)蘇率為82.0%（899/1 097），二原核（2PN）受精率76.9%（691/899）。在216個(gè)周期中，胚胎種植率為21.4%（84/393），累計(jì)臨床妊娠率為33.3%（72/216），累計(jì)活產(chǎn)率達(dá)27.3%（59/216）。每解凍1枚卵母細(xì)胞獲得活產(chǎn)兒的概率為6.5%（71/1 097）。結(jié)論：卵母細(xì)胞玻璃化凍融技術(shù)在卵母細(xì)胞捐贈(zèng)的臨床應(yīng)用上可以獲得較好的臨床結(jié)局。

卵母細(xì)胞；低溫保存；受精，體外；胚胎移植；妊娠結(jié)局

【Abstract】Objective:To analyse the clinical outcomes of the ovum donation cycles conducted with the vitrified oocytes，so as to provide the predictive information for the clinical application of this technique.M ethods: The clinical outcomes of 216 ovum donation cycles，which conducted with the vitrified-thawed oocytes undergoing IVF-ET in our reproductive center from February 2006 to October 2014，were retrospective analyzed.The main outcome parameterswere the survival rate of the freezen-thawed oocytes，the normal fertilization（2PN）rate of in vitro fertilization，the cumulative clinical pregnancy rate，the implantation rate and the cumulative live birth rate. Results:The survival rate of the freezen-thawed oocytes was 82.0%（899/1 097）.The normal fertilization（2PN）rate was 76.9%（691/899）.The rates of implantation，cumulative clinical pregnancy and live birth were 21.4%（84/393），33.3%（72/216）and 27.3%（59/216），respectively.The oocyte-to-baby rate was 6.5%（71/1 097）.Conclusions: There is relatively good clinical outcomes of the freezen-thawed oocyteswhen applied in the ovum donation.

【Keywords】Oocytes；Cryopreservation；Fertilization in vitro；Embryo transfer；Pregnancyoutcome

（JInt Reprod Health/Fam Plan，2016，35：362-364）

自1986年世界上第1例凍卵試管嬰兒誕生以來(lái)［1］，人卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)取得了極大進(jìn)步。截止2008年文獻(xiàn)報(bào)道的全球出生的凍卵試管嬰兒有900多例［2］。目前，玻璃化冷凍技術(shù)已成為冷凍保存卵母細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)［3］。卵母細(xì)胞的捐獻(xiàn)為卵巢功能早衰、卵巢功能不全或遺傳疾病婦女獲得贈(zèng)卵誕生新生命帶來(lái)了希望［1］。南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心在國(guó)內(nèi)率先開展了卵母細(xì)胞玻璃化冷凍-捐贈(zèng)分享技術(shù)［4-5］。本研究回顧性分析了該技術(shù)開展之初的216個(gè)供卵周期的臨床數(shù)據(jù)，以期為今后更好地改善供卵周期的臨床結(jié)局提供參考依據(jù)。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選擇2006年2月—2014年10月本院臨床生殖醫(yī)學(xué)中心的216個(gè)供卵周期。供卵來(lái)源為在本院臨床生殖醫(yī)學(xué)中心接受體外受精-胚胎移植/胞漿內(nèi)單精子注射（IVFET/ICSI）治療、年齡≤35歲、獲卵數(shù)≥15～20枚并獲得活產(chǎn)兒女性的剩余冷凍卵子。卵母細(xì)胞受者平均年齡（38.3±7.0）歲，不孕時(shí)間中位數(shù)和四分位數(shù)為5（3，9）年，平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（22.2±2.6）kg/m2。臨床資料由本院不孕不育數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)（CCRM）收錄。受者不孕原因包括卵巢功能減退、染色體異常、子宮內(nèi)膜異位癥等。根據(jù)解凍卵母細(xì)胞數(shù)目的不同，對(duì)216個(gè)供卵周期進(jìn)行分組（解凍卵母細(xì)胞數(shù)目≤4枚、5～6枚、7～8枚、≥9枚），比較每組供卵周期的臨床結(jié)局，包括累計(jì)臨床妊娠率、種植率和累計(jì)活產(chǎn)率。

1.2方法

1.2.1玻璃化冷凍方法成熟的卵母細(xì)胞用玻璃化冷凍試劑盒（Jieying Laboratory，Canada）冷凍。首先，在室溫下將成熟卵母細(xì)胞置于1號(hào)液（7.5%乙二醇+7.5%丙二醇）平衡10min，然后轉(zhuǎn)入2號(hào)液（15%乙二醇+15%丙二醇+0.5mol/L蔗糖）2 min，再裝載于JY冷凍載桿（Jieying Laboratory，Canada）上，最后投入液氮中保存。

1.2.2凍卵復(fù)蘇方法卵母細(xì)胞復(fù)蘇前，將復(fù)蘇液（Jieying Laboratory，Canada）升溫至室溫，將載有卵母細(xì)胞的冷凍載桿從液氮中取出，前端置于T1（含1mol/L蔗糖）液中使卵母細(xì)胞脫落至液體中，平衡1～3min后，將卵母細(xì)胞依次轉(zhuǎn)移至T2液（含0.5mol/L蔗糖）、T3液（含0.25mol/L蔗糖）、T4液（不含蔗糖）中各3min，最后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受精液中，在37℃、6%CO2下培養(yǎng)2 h后行ICSI受精。

1.2.3復(fù)蘇后胚胎移植時(shí)機(jī)自然周期卵泡監(jiān)測(cè)，排卵日復(fù)蘇冷凍卵母細(xì)胞并行ICSI受精，第3天行ET。排卵障礙的患者采用人工周期準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜，自月經(jīng)周期的第3天開始口服戊酸雌二醇或17β-雌二醇4mg/d，定期B超監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜變化，調(diào)整雌激素用量，內(nèi)膜厚度達(dá)8mm時(shí)開始給予黃體支持。次日復(fù)蘇冷凍卵母細(xì)胞并行ICSI受精，第3天行胚胎移植，移植后繼續(xù)使用黃體支持。

1.2.4臨床結(jié)局判斷和計(jì)算移植后第14天測(cè)血人絨毛膜促性腺激素β亞單位（β-hCG）＞5.3 IU/L，移植28 d后超聲檢查見孕囊及胎心搏動(dòng)確定為臨床妊娠，隨訪到嬰兒出生為活產(chǎn)。臨床指標(biāo)的計(jì)算如下。卵母細(xì)胞復(fù)蘇率=解凍后存活卵母細(xì)胞數(shù)/解凍卵母細(xì)胞總數(shù)×100%；二原核（2PN）受精率=2PN卵子數(shù)/ICSI卵子數(shù)×100%；累計(jì)臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/供卵周期數(shù)×100%；種植率=超聲見孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)× 100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；累計(jì)活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/供卵周期數(shù)×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1卵母細(xì)胞凍融結(jié)果和胚胎移植后的臨床結(jié)局共解凍玻璃化凍存的卵母細(xì)胞1 097枚，復(fù)蘇率82.0%（899/1 097），2PN受精率76.9%（691/899）。216個(gè)供卵周期中，有194個(gè)周期有可移植胚胎，占89.8%，平均移植胚胎（1.8±0.6）個(gè)，累計(jì)臨床妊娠率為33.3%（72/216），種植率為21.4%（84/393），流產(chǎn)率為12.5%（9/72），累計(jì)活產(chǎn)率為27.3%（59/216）。

59例患者共分娩71個(gè)活產(chǎn)兒，隨訪均未發(fā)現(xiàn)新生兒出生缺陷。每解凍1枚卵母細(xì)胞獲得活產(chǎn)兒的概率為6.5%（71/1 097），即獲得1個(gè)活產(chǎn)兒所需冷凍卵母細(xì)胞數(shù)目約為15.5（1 097/71）個(gè)。

2.2解凍不同數(shù)目卵母細(xì)胞的各供卵周期的臨床結(jié)局比較本研究結(jié)果顯示，4組的累計(jì)臨床妊娠率、種植率和累計(jì)活產(chǎn)率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1　解凍不同數(shù)目卵母細(xì)胞的各供卵周期的臨床結(jié)局比較%（n/n）

3　討論

目前，人卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)主要有慢速程序化冷凍和玻璃化冷凍2種。研究表明，玻璃化冷凍技術(shù)優(yōu)于慢速程序化冷凍技術(shù)，采用玻璃化冷凍的卵母細(xì)胞復(fù)蘇成活率更高［6］。玻璃化凍融卵母細(xì)胞，能在減數(shù)分裂中使紡錘體更快恢復(fù)［7］，對(duì)卵母細(xì)胞線粒體DNA（mtDNA）缺失及拷貝數(shù)影響較小，可較好地實(shí)現(xiàn)保存卵母細(xì)胞的目的［8］。2013年美國(guó)生殖學(xué)會(huì)頒布的指南中表明，成熟卵母細(xì)胞的冷凍已不再局限于實(shí)驗(yàn)階段，正式將卵母細(xì)胞凍融技術(shù)納入人類輔助生殖技術(shù)的臨床應(yīng)用［3］。

本研究的216個(gè)供卵周期共解凍玻璃化凍存的卵母細(xì)胞1 097枚。其中22個(gè)周期無(wú)可移植胚胎，周期取消率為10.1%，平均移植胚胎（1.8±0.6）個(gè)，最終成功獲得71例活產(chǎn)兒。相關(guān)研究報(bào)道的卵母細(xì)胞復(fù)蘇率在70%～88%［9］，復(fù)蘇后行ICSI的正常受精率為71%～79%［10-14］，移植后種植率為17.1%～20.4%［12-13］，每解凍1枚卵母細(xì)胞獲得活產(chǎn)兒的概率為6.5%［14］，均與本研究結(jié)果相似。

本研究根據(jù)解凍卵母細(xì)胞數(shù)目的不同，對(duì)216個(gè)供卵周期進(jìn)行分組，比較每組供卵周期的臨床結(jié)局，4組的臨床結(jié)局差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。西班牙的一項(xiàng)研究報(bào)道顯示，解凍卵子數(shù)目在25個(gè)以內(nèi)，隨著解凍數(shù)目的增加，累計(jì)活產(chǎn)率升高的趨勢(shì)越快；而解凍卵子數(shù)目在25～40個(gè)，累計(jì)活產(chǎn)率升高的趨勢(shì)較慢，直至接近于100%［14］。由于我國(guó)供卵來(lái)源限制嚴(yán)格，卵源稀缺，本院臨床生殖醫(yī)學(xué)中心的每個(gè)供卵周期解凍卵子數(shù)目主要集中在6個(gè)以內(nèi)，所以比較解凍不同卵子數(shù)目的臨床結(jié)局還需要更多的樣本。

本研究的卵子來(lái)源均為在本院臨床生殖醫(yī)學(xué)中心接受IVF/ICSI治療、年齡≤35歲、獲卵數(shù)≥15～20枚并已成功分娩的女性的剩余冷凍卵子。在目前供卵來(lái)源困難的情況下，對(duì)IVF-ET獲卵較多的患者進(jìn)行冷凍部分卵母細(xì)胞，待分娩后進(jìn)行冷凍卵子捐贈(zèng)的方法是可行的，且累計(jì)活產(chǎn)率達(dá)27.3%，臨床結(jié)局尚可；卵子來(lái)源均為較年輕且有成功分娩史的女性，既保障了供受雙方的利益，又避免多余的卵子因形成了剩余胚胎無(wú)法捐獻(xiàn)而造成的資源浪費(fèi)。

本研究對(duì)采用卵母細(xì)胞玻璃化凍融技術(shù)的供卵周期中分娩的59例新生兒進(jìn)行隨訪，并未發(fā)現(xiàn)新生兒出生缺陷。2009年，Noyes等［2］統(tǒng)計(jì)了從1986—2008年全球出生的936例“凍卵寶寶”健康情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)凍卵出生的新生兒出生缺陷率僅為1.3%（12例），與美國(guó)自然出生的新生兒相比，凍卵并未增加新生兒出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)，與本研究隨訪結(jié)果一致。

隨著卵母細(xì)胞玻璃化凍融技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，卵母細(xì)胞的冷凍復(fù)蘇率較以前有了明顯的提高，但是冷凍損傷不可避免，又因卵母細(xì)胞的特殊性，與胚胎冷凍相比冷凍復(fù)蘇率仍較低，面對(duì)我國(guó)卵源緊張的局面，卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)顯得尤為重要。另外該技術(shù)臨床應(yīng)用時(shí)間較短，對(duì)子代遠(yuǎn)期的影響仍需持續(xù)關(guān)注。

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Application of Human Vitrified Oocytes in Ovum Donation

LINYu-ting，MAXiang，CAILing-bo，ZENG Qiao，WUWei，DIAOFei-yang，LIUJia-yin，CHIANRi-cheng.
TheClinicalCenterforReproductiveMedicine，The State Key Laboratory of Reproductive Medicine，The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China
Corresponding author:CHIAN Ri-cheng，E-mail:rchian@126.com

2016-06-20）

［本文編輯秦娟］

國(guó)家自然科學(xué)基金（81270746、81200444）；江蘇省婦幼保健重點(diǎn)學(xué)科（FXK201221）

210029南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（林玉婷，馬翔，蔡令波，曾橋，吳畏，刁飛揚(yáng)，劉嘉茵，千日成）；南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（劉嘉茵，千日成）

千日成，E-mail：rchian@126.com