史瀟，王婷，周瑤，劉厲，詹曉敏，陳思梅，全松

體外操作對(duì)人精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)及細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的影響

史瀟，王婷，周瑤，劉厲，詹曉敏，陳思梅，全松

目的：研究體外物理操作（離心以及微量加樣器抽吸）對(duì)人精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)以及細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）的影響，旨在優(yōu)化人精子體外處理方法。方法：7例精液常規(guī)參數(shù)正常的標(biāo)本，采用不同離心力（200 g，600 g）及離心時(shí)間（5min，15min）以及不同微量加樣器抽吸次數(shù)（2，6，10次）進(jìn)行處理，測(cè)試精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)和細(xì)胞內(nèi)ROS的變化。結(jié)果：①活動(dòng)精子百分比以及活精子細(xì)胞內(nèi)ROS水平主要受到離心時(shí)間的影響（P＜0.05）；前向運(yùn)動(dòng)精子百分比（PR）以及平均運(yùn)動(dòng)速率（VAP）均不受離心力及離心時(shí)間的影響（P＞0.05）。單因素方差分析多重比較結(jié)果提示，當(dāng)離心時(shí)間為5min以上時(shí)精子活動(dòng)力顯著下降，而ROS水平顯著增加（P＜0.05）。②加樣器抽吸2次以上可致人精子活動(dòng)力顯著下降（P＜0.05），抽吸6次以上可導(dǎo)致人精子PR及VAP顯著降低（P＜0.05）；但抽吸操作并未顯著影響精子細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。結(jié)論：在人精子體外操作時(shí)應(yīng)盡量縮短離心時(shí)間并控制加樣器抽吸次數(shù)從而保證正常的精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)，也應(yīng)盡量縮短離心時(shí)間從而減少體外操作所致的細(xì)胞內(nèi)ROS升高。

精子；精子能動(dòng)性；離心法，梯密度；抽吸；氧化性應(yīng)激；受精，體外

【Abstract】Objective:To study the effects of centrifugation and pipette on humanmotility and intracellular ROS，so as to optimize the sperm handling procedure.Methods:Seven sperm samples with normal seminal parameters were treated with various centrifugation force（200 g，600 g）and centrifugation duration（5 min，15 min）and different pipetting times（2，6，10 times）.Motility parameter and intracellular ROS were measured. Results:For the centrifuge procedure，the centrifugation duration could significantly influence the sperm motility and intercellular ROS level（P＜0.05），while centrifugation did not significantly influence the percentage of progressivemotile sperm（PR）and the velocity of average path（VAP）（P＞0.05）.The centrifugation durationmore than 5 minutes could significantly decrease the sperm motility and intracellular ROS level（P＜0.05）.For the pipetting procedure，the pipetting more than 2 times would significantly decrease the sperm motility（P＜0.05），while the pipetting over 6 times would significantly decrease the PR and VAP（P＜0.05）.However，the intracellular ROS levelwas not significantly changed by the repeated pipetting.Conclusions:The special causion is that the centrifuge over 5 m inutes and pipetting over 2 times should be avoided during in vitro hand ling human sperm sample.

【Keywords】Spermatozoa；Sperm motility；Centrifugation，density gradient；Suction；Oxidative stress；Fertilization in vitro

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：369-371）

精液體外處理是輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive techniques，ART）的常規(guī)步驟，離心、加樣器抽吸等體外操作是精液分析、冷凍以及優(yōu)選等過程中必不可少的操作。根據(jù)以往對(duì)小鼠、大鼠等動(dòng)物精子體外操作的經(jīng)驗(yàn)，離心、加樣抽吸等物理操作均可能造成精子損傷，并且不同動(dòng)物精子對(duì)于離心、抽吸等體外操作的敏感性不同，因而精子所受損傷的程度也不同［1-4］。在ART臨床應(yīng)用及科學(xué)研究中如何優(yōu)化精子體外處理的條件是學(xué)者們共同關(guān)注的問題，然而目前仍缺乏人精子體外處理的相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究采用析因分析的方法，探討離心力、離心時(shí)間以及加樣器抽吸次數(shù)等操作對(duì)人精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)以及細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的影響，旨在為優(yōu)化ART過程中精子體外處理?xiàng)l件提供參考。

1　資料與方法

1.1標(biāo)本收集根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）第5版精液參數(shù)參考值，收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心有生育史且精液常規(guī)分析參數(shù)正常的30～40歲男性精液標(biāo)本7例（禁欲3～5 d，手淫法取精）。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意采用精液常規(guī)分析后剩余標(biāo)本進(jìn)行研究。

1.2主要儀器與試劑①CASA精液分析儀（SCA全自動(dòng)精液分析系統(tǒng)，西班牙Microptic S.L.公司）；②離心機(jī)（Sorvall Legend Mach 1.6/R，美國Thermo公司）；③正置顯微鏡（BX51，日本Olympus公司）；④流式細(xì)胞儀（美國BectonDickinson公司）；⑤ROS分析試劑盒（H2DCFDA，KGAF018，南京凱基生物公司）；⑥碘化丙啶（PI）染色試劑盒（KGA214，南京凱基生物公司）；⑦人輸卵管液（Human Tubal Fluid，HTF）按照文獻(xiàn)［5］配制。

1.3研究方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組本研究共分為3個(gè)大組，分別為對(duì)照組、離心處理組以及抽吸處理組。其中離心處理組分為4個(gè)亞組（200 g，600 g；5min，15m in；兩個(gè)因素各水平組合）；抽吸處理組分為3個(gè)亞組（2，6，10次抽吸）；對(duì)照組不做任何處理。每份標(biāo)本同時(shí)完成上述3個(gè)大組的實(shí)驗(yàn)。

1.3.2精子體外操作的處理實(shí)驗(yàn)Ⅰ為離心力及時(shí)間對(duì)精子的作用，實(shí)驗(yàn)Ⅱ?yàn)槌槲鼘?duì)精子的作用。實(shí)驗(yàn)Ⅰ的具體方案為：離心處理組的每個(gè)亞組取1×106個(gè)精子置于1.5mLEP管中加入200μLHTF。分別采用200 g，600 g的離心力及5m in，15min的離心時(shí)間進(jìn)行離心。共有4個(gè)亞組。對(duì)照組精子于37℃靜置，不進(jìn)行離心處理。實(shí)驗(yàn)Ⅱ的具體方案為：抽吸處理組的每個(gè)亞組取10×106個(gè)精子加入1mLHTF。置于1.5mLEP管中，采用1 000μL微量加樣器分別抽吸2，6，10次。共有3個(gè)亞組。對(duì)照組不進(jìn)行抽吸處理。

1.3.3精液參數(shù)分析將射精后的精液置于干凈的一次性取精杯內(nèi)，觀察精液一般性狀，然后置入37℃恒溫金屬浴保溫槽內(nèi)孵育，待其液化進(jìn)行檢測(cè)。離心和抽吸處理組在完成相應(yīng)體外處理后，再次進(jìn)行精液參數(shù)檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)取7μL液化的精子懸液于一次性精子計(jì)數(shù)板（荷蘭Leja公司）上，置于顯微鏡載物臺(tái)上靜置1min后開始采用CASA精液分析系統(tǒng)分析精子活動(dòng)率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分比（PR）以及精子平均運(yùn)動(dòng)速率（VAP）。每份樣本分析4個(gè)視野。

1.3.4精子細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)每份樣本均按照ROS檢測(cè)試劑盒（H2DCFDA）的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。將200μL濃度為106/mL的精子懸液與200μL的H 2DCFDA工作液及1μL PI工作液于37℃共同孵育30min。將孵育后的精子懸液標(biāo)本進(jìn)行物理應(yīng)激處理，隨后采用流式細(xì)胞分析儀分析2’，7’-二氯熒光素（DCF）熒光強(qiáng)度，從而檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況。流式細(xì)胞儀激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，采用前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）設(shè)門后，通過FL1（綠）檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度，F(xiàn)L2（紅）檢測(cè)PI熒光強(qiáng)度。每份樣本收集10 000個(gè)細(xì)胞。并采用Flow J軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算存活精子DCF平均熒光強(qiáng)度（DCFMFI，即PI陰性群中DCF平均熒光強(qiáng)度）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，實(shí)驗(yàn)Ⅰ為2×2析因設(shè)計(jì)資料，實(shí)驗(yàn)Ⅱ?yàn)閱我蛩?水平設(shè)計(jì)資料，分別采用析因方差分析和單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1存活精子細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測(cè)本研究采用PI和H2DCFDA聯(lián)合染色檢測(cè)存活精子細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，避免了混雜的死精子影響ROS檢測(cè)的結(jié)果。通過PI染色區(qū)分存活與凋亡細(xì)胞群，H2DCFDA染色計(jì)算得出DCFMFI評(píng)估細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果見圖1。

圖1　H2DCFDA/PI雙染精子細(xì)胞結(jié)果圖

2.2離心力及離心時(shí)間對(duì)人精子的影響析因分析結(jié)果提示，活動(dòng)精子百分比以及活精子細(xì)胞內(nèi)ROS（即DCFMFI）主要受離心時(shí)間的影響；PR以及VAP均不受離心力或離心時(shí)間的影響。進(jìn)一步進(jìn)行單因素方差分析多重比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)離心時(shí)間為5min和15min時(shí)精子活力顯著下降（P=0.01），同時(shí)活精子細(xì)胞內(nèi)ROS水平也顯著增加（P=0.00）。見表1。

2.3加樣器抽吸次數(shù)對(duì)人精子的影響加樣抽吸次數(shù)的增加可致活動(dòng)精子百分比、PR以及VAP顯著下降（P＜0.05），但并不引起存活精子細(xì)胞內(nèi)ROS水平產(chǎn)生變化。進(jìn)一步進(jìn)行多重比較提示，當(dāng)1mL的微量加樣器抽吸精子2次及以上即可造成活動(dòng)精子百分比的下降（P＜0.05），在抽吸達(dá)到6次及以上可造成PR以及VAP的顯著下降（P＜0.05）。多重比較也提示細(xì)胞內(nèi)ROS水平并無顯著改變（P＞0.05）。見表2。

表1　離心力及離心時(shí)間對(duì)人精子的影響（x±s，n=7）

表2　微量加樣器抽吸次數(shù)對(duì)人精子的影響（x±s，n=7）

3　討論

在ART中如何優(yōu)化精子處理?xiàng)l件以減少對(duì)精子損傷是輔助生殖領(lǐng)域長(zhǎng)期探討的熱點(diǎn)問題。一些研究報(bào)道了經(jīng)過體外操作后動(dòng)物精子活動(dòng)力、膜完整性改變的現(xiàn)象［1-4］，然而人精子的相關(guān)研究資料較為缺乏。本研究根據(jù)實(shí)際操作中ART實(shí)驗(yàn)室常用的人精子離心處理參數(shù)進(jìn)行析因設(shè)計(jì)，設(shè)定離心力參數(shù)為200 g、600 g同時(shí)離心時(shí)間參數(shù)為5min、15min進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)當(dāng)離心時(shí)間增加至5min時(shí)，人精子活力顯著下降，而ROS水平顯著增加。而與對(duì)照組比較的結(jié)果也提示，離心時(shí)間增加可導(dǎo)致精子活動(dòng)率的進(jìn)一步下降。這一研究結(jié)果與本研究團(tuán)隊(duì)的動(dòng)物精子研究結(jié)果相似［4］。Kim等［2］以及Katkov等［5］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。離心導(dǎo)致精子活動(dòng)率以及PR的原因可能是由于離心過程中小鼠精子成團(tuán)，尾部折疊而致的運(yùn)動(dòng)能力損傷［2］。本研究還發(fā)現(xiàn)，離心操作顯著增加人精子內(nèi)的ROS水平。過高水平的ROS可能會(huì)影響精子的功能和受精能力，并導(dǎo)致精子DNA損傷［6］。因此，在精子體外操作的過程中必須盡量減少人為操作帶來的細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。本文研究結(jié)果提示，人精子體外處理操作中，離心時(shí)間應(yīng)控制在5min以內(nèi)，以減少對(duì)精子活動(dòng)力的損傷。

本研究還發(fā)現(xiàn)，對(duì)人精子實(shí)施抽吸操作不宜超過2次，否則人精子活動(dòng)率下降，而加樣器抽吸超過6次時(shí)PR以及VAP均會(huì)顯著降低。這一結(jié)果與本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)小鼠精子的研究結(jié)果相似［4］，同時(shí)也與Varisli等［1］以及Kim等［2］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似。Varisli等［1］認(rèn)為造成這一現(xiàn)象的原因與抽吸過程的機(jī)械剪切力有關(guān)，抽吸并未導(dǎo)致精子細(xì)胞內(nèi)ROS水平的改變，這可能是因?yàn)槌槲僮魉碌难趸瘧?yīng)激強(qiáng)度不高，小鼠精子內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)（anti-oxidative system）足以將ROS還原，因此不至于使ROS水平升高。

本研究針對(duì)離心、抽吸操作對(duì)有生育史、精液參數(shù)正常人精子的影響進(jìn)行研究，試圖優(yōu)化人精子體外操作的條件，為ART的操作過程提供參考。本研究發(fā)現(xiàn)加大離心力、延長(zhǎng)離心時(shí)間以及加樣抽吸均會(huì)影響精子的活動(dòng)力，同時(shí)可能增加精子內(nèi)源性ROS的產(chǎn)生。根據(jù)本研究的結(jié)果，建議在ART中體外離心人精子時(shí)應(yīng)控制離心時(shí)間不超過5min，抽吸次數(shù)少于2次。然而，在ART的操作過程中更多涉及到的是精液參數(shù)異常患者精子的處理。精液參數(shù)異常的精子標(biāo)本比正常精子標(biāo)本更易產(chǎn)生內(nèi)源性ROS，從而影響體外處理后的精子質(zhì)量［7］。本研究的局限性在于未能夠探討經(jīng)過離心、抽吸等操作后精子功能的變化以及對(duì)妊娠結(jié)局的影響，同時(shí)未能夠?qū)μ幚砗蟮木庸δ芎虳NA完整性進(jìn)行評(píng)估。今后的研究可對(duì)精液參數(shù)正常和異常的精液標(biāo)本處理前后，精子結(jié)構(gòu)、DNA完整性等指標(biāo)進(jìn)行更完善的評(píng)估，進(jìn)而對(duì)臨床ART操作有更為全面的指導(dǎo)意義。

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The E ffect of Physical Stress on Hum an Sperm M otility and Intracellular ROS Generation

SHI Xiao，WANG Ting，ZHOU Yao，LIU Li，ZHAN Xiao-min，CHEN Si-mei，QUAN Song.
Center for Reproductive Medicine，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 501515，China
Corresponding author:QUAN Song，E-mail:quansong@smu.edu.cn

2015-12-17）

［本文編輯王昕］

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（311220700174）；南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院院長(zhǎng)基金項(xiàng)目（2013C026）

510515廣州，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院生殖中心

全松，E-mail：quansong@smu.edu.cn