張琳，張也，王如福，霍乃蕊

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

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大曲中高產(chǎn)糖化酶菌株的篩選及環(huán)境耐受性分析

張琳1，張也1，王如福1，霍乃蕊2*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]分離適應(yīng)釀造環(huán)境的高產(chǎn)糖化酶大曲土著菌株，用于大曲強(qiáng)化，以減少山西老陳醋釀造過程中的大曲用量，提高原料利用率并改善醋品品質(zhì)。[方法]以酒精發(fā)酵24 h的酒醅為樣品，用Martin培養(yǎng)基對大曲中的霉菌進(jìn)行分離，分別以透明圈和酶活大小進(jìn)行初篩和復(fù)篩獲得高產(chǎn)糖化酶菌株，以生長量為指標(biāo)進(jìn)行環(huán)境耐受性分析。[結(jié)果]初篩獲得的10株產(chǎn)糖化酶菌株中M2、M5、M6、M8、M15的產(chǎn)酶能力(U·mL-1)高于公認(rèn)的糖化酶高產(chǎn)菌株AS3.4309(M0)，依次為M6(3912.08(32.1)>M5(1413.16(13.92)>M8(1233.63(71.07)>M15(1152.47(21.96)>M2(923.86(22.42)>M0(828.88(22.23)。環(huán)境耐受性分析結(jié)果表明，5株霉菌均能耐受6%的乙醇濃度，在pH3.5生長良好，有的甚至能耐受pH2.0，在15～30 ℃范圍內(nèi)均可生長。[結(jié)論]獲得的5株霉菌，不僅產(chǎn)糖化酶能力高于公認(rèn)且應(yīng)用廣泛的AS3.4309，還能耐受山西老陳醋的整個(gè)釀造過程。

山西老陳醋； 酒醅； 高產(chǎn)糖化酶菌株； 環(huán)境耐受性

位于四大名醋之首的山西老陳醋，是以高粱為原料，麩皮、谷糠為輔料，經(jīng)過前處理、加曲、糖化及酒精發(fā)酵，再經(jīng)過固態(tài)醋酸發(fā)酵，淋醋熏醅陳釀等工藝釀造制成，有著悠久的歷史和“綿酸香甜鮮”的獨(dú)特風(fēng)味[1]。釀造過程則是通過生產(chǎn)大曲，最大限度地富集對生產(chǎn)有益的微生物及其代謝產(chǎn)物，是多種微生物的混合體系。其中霉菌是主要的糖化菌，是前期發(fā)酵原料中淀粉等大分子物質(zhì)降解的主要動力，大曲中的霉菌主要有根霉、曲霉、毛霉、青霉、頭霉等，其中曲霉和根霉糖化力較強(qiáng)，對生產(chǎn)有積極作用[2]。霉菌的代謝產(chǎn)物中有一些風(fēng)味物質(zhì)的前體，對產(chǎn)品風(fēng)味也有一定的貢獻(xiàn)。由于特殊的釀造工藝及長期的釀造馴化篩選，能適應(yīng)釀造環(huán)境的微生物更能發(fā)揮作用[3]。

生產(chǎn)大曲是傳統(tǒng)工藝自然接種，生產(chǎn)周期長、糖化力低、質(zhì)量不穩(wěn)定，并且成本高[4]，且山西老陳醋傳統(tǒng)釀造工藝以曲代梁，大曲用量用到40%以上，有的高達(dá)70%。發(fā)酵結(jié)束后，醋糟中的殘?zhí)沁€很高，所以原料利用率有待提高。AS3.4309是公認(rèn)的高產(chǎn)糖化酶菌株，已廣泛應(yīng)用于釀酒和釀醋工業(yè)。本研究旨在從酒醅中對大曲中的霉菌進(jìn)行分離，并從中篩選產(chǎn)糖化酶能力高于AS3.4309的菌株，并對其環(huán)境耐受性進(jìn)行分析。這些菌株的獲得，用于大曲強(qiáng)化，有望提高原料利用率，減少山西老陳醋釀造過程中的大曲用量，降低生產(chǎn)成本，并縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)品質(zhì)量，改善風(fēng)味。此外，這些優(yōu)良菌株還可用于其他發(fā)酵工業(yè)以及酶制劑的生產(chǎn)。

1　材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

M0為山西省某醋廠生產(chǎn)快曲的菌種AS3.4309。

Martin培養(yǎng)基[5]：孟加拉紅(1 g·L-1)0.33 mL，瓊脂粉1.2 g，葡萄糖7 g，蛋白胨0.5 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.05 g，水100 mL，自然pH(6.4±0.2)，112 ℃滅菌25 min。臨用前再加入預(yù)先滅菌的2 mL 2%的去氧膽酸鈉溶液和0.33 mL鏈霉素溶液(1萬單位·mL-1)。

產(chǎn)淀粉酶篩選培養(yǎng)基[6]：可溶性淀粉10 g，酵母膏1.5 g，NaNO31.5 g，K2HPO41 g，NaCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂15 g，鏈霉素0.000 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7，121 ℃滅菌20 min。

改良的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：生玉米高粱粉(質(zhì)量比9∶1)40 g、KCl 0.5 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、水1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min，備用。

霉菌培養(yǎng)基，奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2原料與試劑

酒醅：山西省某醋廠酒精發(fā)酵24 h的酒醅。

DNS試劑；1 g·L-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；0.2%剛果紅染液；1 mol·L-1NaCl溶液；5%醋酸溶液；0.1 mol·L-1和1 mol·L-1鹽酸溶液。

1.3方法

1.3.1酒醅中霉菌的分離

取10 g酒精發(fā)酵24 h的酒醅于90 mL蒸餾水，振蕩洗滌20 min，梯度稀釋制成10-1～10-7的梯度菌懸液，涂布于Martin培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)3 d。選取有典型霉菌菌落特征的菌株純化，保藏備用。

1.3.2產(chǎn)糖化酶菌株的篩選

初篩：將大曲中分離純化得到的菌株點(diǎn)接于產(chǎn)淀粉酶篩選培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d，2 mL盧戈氏碘液染色5 min，觀察透明圈[7]，初步篩選產(chǎn)糖化酶菌株。

復(fù)篩：將初篩得到的菌株接種于改良的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃，150 r·min-1搖床發(fā)酵培養(yǎng)3 d，菌液4 000 r·min-1離心10 min，取上清即為粗酶液。適當(dāng)稀釋后，采用DNS法[8]測定糖化酶活力，即25 mL比色試管中各加入1 mL 1%淀粉溶液和1 mL檸檬酸緩沖溶液，混勻，40 ℃水浴3 min，加入1 mL適當(dāng)稀釋酶液，混勻，40 ℃水浴3 min，加入2 mL DNS試劑，混勻，沸水浴5 min，反應(yīng)結(jié)束后立即冷卻，定容至刻度，用分光光度計(jì)在540 nm處測OD值。具體按表1添加試劑并測定。并以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g·L-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液[9]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活力定義為：溫度40 ℃、pH 5.6條件下，1 min產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需要的酶量為1個(gè)酶活，用U·mL-1表示。

糖化酶活力=(OD-C)/(K×t×v)×1000×n

式中，C為葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；K為葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；t為酶反應(yīng)時(shí)間/min；v為所取粗酶液體積；n為粗酶液稀釋倍數(shù)；1 000為1 mg轉(zhuǎn)化為1 μg的因子。

1.3.3高產(chǎn)糖化酶菌株環(huán)境耐受性分析

耐乙醇能力分析：按4%、6%、8%(v/v)的比例調(diào)整霉菌培養(yǎng)基乙醇濃度，分別裝50 mL培養(yǎng)基于150 mL三角瓶，分別取一環(huán)菌活化，按1%的接種量接種，30 ℃，150 r·min-1培養(yǎng)3 d，過濾并烘干至恒重，稱菌體干重[10]。

表1　樣品及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液糖化酶活性測定方法

耐酸能力分析：霉菌培養(yǎng)基調(diào)整pH為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5，分別裝50 mL培養(yǎng)基于150 mL三角瓶中，各取一環(huán)菌種活化，按1%的接種量接種，30 ℃，150 r·min-1搖床培養(yǎng)3 d，稱菌體干重。

不同溫度的生長情況分析：取一環(huán)菌活化，按1%接種量接種于自然pH(6.0±0.2)的霉菌培養(yǎng)基，分別在溫度為15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃條件下，150 r·min-1搖床培養(yǎng)3 d，稱菌體干重。

2　結(jié)果與分析

2.1霉菌分離與產(chǎn)糖化酶菌株初篩

用Martin培養(yǎng)基分離，并通過菌落和個(gè)體形態(tài)初步鑒定，選出15株霉菌，編號為M1～M15。將其點(diǎn)接于產(chǎn)淀粉酶篩選培養(yǎng)基，結(jié)果如圖1，觀察透明圈篩選出10株產(chǎn)糖化酶菌株，即M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M14、M15，M0為對照菌株。

圖1　所選產(chǎn)糖化酶菌株的透明圈平板Fig.1　Trasparent circle plate for amyloglucosidase producing strains

2.2糖化酶活力測定

根據(jù)不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD540值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，在該試驗(yàn)條件下，葡萄糖溶液濃度在0.2～1.2 g·L-1范圍內(nèi)有很好的線性相關(guān)性。

圖2　DNS法制作的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Glucose standard curve made by DNS method

圖3　分離菌株的糖化酶活力Fig.3　Glucoamylase activities of separent strains

測定篩選出的10株產(chǎn)糖化酶菌株的糖化酶活力，用軟件SigmaPlot12.0作柱形圖，并用軟件Statistix8.1進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見圖3。所選菌株均有一定的產(chǎn)糖化酶能力，與初篩結(jié)果一致。其中菌株M5、M6、M8和M15的產(chǎn)糖化酶能力顯著高于對照菌株M0，菌株M6的產(chǎn)糖化酶能力遠(yuǎn)高于M0，約達(dá)到M0的4.7倍。菌株M2的產(chǎn)糖化酶能力也高于M0，但差異還未達(dá)到顯著水平。因此，篩選出5株高產(chǎn)糖化酶菌株，其產(chǎn)酶能力大小依次為M6(3 912.08±32.11)U·mL-1>M5(1 413.16±13.92)U·mL-1>M8(1 233.63±71.07)U·mL-1>M15(1 152.47±21.96)U·mL-1>M2(923.86±22.42)U·mL-1>M0(828.88±22.23)U·mL-1。

2.3高產(chǎn)糖化酶菌株的環(huán)境耐受性分析

2.3.1耐乙醇能力分析

根據(jù)山西老陳醋傳統(tǒng)工藝，通過測菌體干重，考察各高產(chǎn)糖化酶菌株對4%、6%、8%(v/v)乙醇濃度的耐受能力，并與對照菌株M0進(jìn)行比較。由圖4可知，M2、M5、M6、M8在乙醇濃度4%的培養(yǎng)基中，菌體干重均高于對照菌株M0，且生長良好。當(dāng)乙醇濃度的升高至6%時(shí)，M0、M2、M5、M6和M15菌體干重減小，而M8的生長速率比反而有所升高。隨著乙醇濃度升高至8%，M5停止生長，M2、M6、M15比乙醇濃度6%略有降低，M0仍保持在6%乙醇濃度生長水平，而M8菌體干重明顯高于其他菌株，且生長良好。因此，分離得到的5株高產(chǎn)糖化酶均可耐受6%的乙醇濃度，除M5外的4株均對8%的乙醇濃度也具有很好的耐受能力，耐乙醇能力較強(qiáng)。

圖4　高產(chǎn)糖化酶菌株在不同乙醇濃度培養(yǎng)基的菌體干重Fig.4　Dry weight of high glucoamylase-producing strains at different ethanol concentration

圖5　高產(chǎn)糖化酶菌株在pH 1.5～3.5培養(yǎng)基中的菌體干重Fig.5　Dry weight of high glucoamylase-producing strains under pH 1.5～3.5

2.3.2耐酸能力分析

用不同pH培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)各高產(chǎn)糖化酶菌株，考察pH 1.5～3.5范圍內(nèi)各菌株的生長情況。如圖5所示，隨著pH的降低，高產(chǎn)糖化酶菌株生長狀況受到不同程度的抑制。pH 3.5時(shí)，各菌株均可較好的生長，并且M2和M5的生長速率高于M0。pH下降至3時(shí)，M15生長受到很大程度的抑制，而M0、M2、M5、M6、M8仍能較好的生長。pH2.5時(shí)，M2和M8停止生長，M15生長仍處于明顯抑制狀態(tài)，M0、M5和M6耐受能力較強(qiáng)，仍可以較好生長。pH 2.0時(shí)各菌株幾乎不生長，pH 1.5所有菌株完全停止生長。因此，可知該5株均可以耐受pH 3.5的酸性環(huán)境，有的甚至可以耐受pH 2.0，耐酸能力較強(qiáng)。

2.3.3不同溫度的生長狀況分析

根據(jù)醋廠的實(shí)際生產(chǎn)條件，分別在15 ℃、20 ℃、25 ℃和30 ℃溫度下培養(yǎng)高產(chǎn)糖化酶菌株，考察溫度對菌株生長狀況的影響。結(jié)果如圖6所示，高產(chǎn)糖化酶菌株均在15 ℃生長良好，在此溫度范圍內(nèi)菌體干重最大，尤其是對照菌株M0，15 ℃下生長速率遠(yuǎn)高于其他菌株，與自身相比，15 ℃下生長速率遠(yuǎn)高于其20～30 ℃，符合實(shí)際生產(chǎn)要求，入發(fā)酵池后就能迅速生長繁殖。M5與M0生長狀況一致，培養(yǎng)溫度上升至20 ℃，菌體干重下降，而25～30 ℃范圍內(nèi)菌體干重基本相同。M2、M6和M8在15～25 ℃菌體干重下降緩慢，M6在20 ℃反而略有升高，M8在15℃和25℃生長狀況基本一致。培養(yǎng)溫度升高至30 ℃時(shí)，所有菌株的菌體干重均有所下降，但菌體干重依然較高，生長狀況良好。所以，篩選出的5株高產(chǎn)糖化酶菌株在15～25 ℃的實(shí)際生產(chǎn)溫度范圍內(nèi)生長良好。

圖6　高產(chǎn)糖化酶菌株在15～30 ℃培養(yǎng)的菌體干重Fig.6　Dry weight of high glucoamylase-producing strains at 15～30 ℃

總之，分離篩選出的5株高產(chǎn)糖化酶菌株M2、M5、M6、M8和M15均可耐受6%的乙醇濃度，在pH 3.5酸性環(huán)境中生長良好，有的甚至能耐受pH 2.0，在15～30 ℃范圍內(nèi)均可生長。

3　討論與結(jié)論

老陳醋的發(fā)酵是多種微生物的混合作用，其中

霉菌是主要糖化菌[2]，為得到高產(chǎn)糖化酶菌株，使用Martin培養(yǎng)基平板，分離篩選醋廠發(fā)酵24 h的酒醅中的霉菌，進(jìn)而進(jìn)行產(chǎn)糖化酶篩選，分離出5株霉菌產(chǎn)糖化酶能力高于公認(rèn)且應(yīng)用廣泛的AS3.4309。

為了使分離出的菌株能更好的適應(yīng)生產(chǎn)，根據(jù)老陳醋的實(shí)際生產(chǎn)條件，考察該菌株對生產(chǎn)環(huán)境的耐受能力。其中耐乙醇濃度以及耐酸能力是兩個(gè)考察耐受力的重要指標(biāo)，分離出的5株霉菌不僅產(chǎn)糖化酶能力高于公認(rèn)且應(yīng)用廣泛的AS3.4309，并且耐6%的乙醇濃度和pH 3.5的酸性環(huán)境。

此外，實(shí)際生產(chǎn)發(fā)酵過程存在溫度變化，因此溫度也是一個(gè)考察的因素。根據(jù)醋廠生產(chǎn)工藝參數(shù)可知，酒精發(fā)酵室室溫為20～25 ℃，而酒精發(fā)酵階段的實(shí)測溫度范圍15～30 ℃，因此考察該溫度范圍高產(chǎn)糖化酶菌株的生長狀況，發(fā)酵初期品溫較低，分離得到5株高產(chǎn)糖化酶菌株均在15 ℃培養(yǎng)條件下生長速率最快，符合實(shí)際生產(chǎn)要求，菌種入發(fā)酵池即可快速生長。糖化發(fā)酵階段產(chǎn)生一定的生物熱，短時(shí)間使品溫升高，可達(dá)25～30 ℃，為了適應(yīng)生產(chǎn)，選擇30 ℃下培養(yǎng)篩選高產(chǎn)糖化酶菌株，考察菌株在30 ℃下的產(chǎn)酶能力，作用于發(fā)酵中后期。并且考察5株高產(chǎn)菌株在15～30 ℃范圍內(nèi)的生長狀況，其在該溫度范圍均可生長，可耐受老陳醋整個(gè)發(fā)酵過程。

本研究成功從酒精發(fā)酵24 h的酒醅中分離得到5株高產(chǎn)糖化酶且耐受性強(qiáng)的菌株，可適應(yīng)山西老陳醋整個(gè)釀造環(huán)境，符合實(shí)際生產(chǎn)要求，為強(qiáng)化大曲，提高原料利用率奠定基礎(chǔ)，也可用于其他發(fā)酵工業(yè)和酶制劑生產(chǎn)。

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(編輯：馬榮博)

Isolation of high amyloglucosidase-producing strains from Daqu and their environmental tolerance abilities

Zhang Lin1, Zhang Ye1, Wang Rufu1, Huo Nairui2*

(1．CollegeofFoodScience,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China, 2．CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective] Aboriginal mould strains with high ability to produce amyloglucosidase isolated from Daqu can be reinforced into Daqu again to lower Daqu consumption and increase the utilization rate of the material during vinegar fermentation and and improve the product quality. [Methods]The alcoholic fermenting matrix fermented for 24 hours was treated and cultured on Martin medium for mould isolation. Preliminary and second-time screening work was carried out according to the size of the transparent circle on the medium and the measured enzymatic activity. Environmental tolerant ability were evaluated through growth mass.[Results] Preliminary screening obtained 10 mould strains that can produce amyloglucosidase. The results of enzyme activity suggested that M2、M5、M6、M8 and M15 were superior to the well-known high amyloglucosidase producing strain AS3.4309(M0). Their enzyme activity(U·mL-1) were M6 (3912.08(32.11)> M5 (1413.16 ( 13.92)>M8(1233.63(71.07)>M15(1152.47(21.96)>M2(923.86(22.421)>M0(828.88(22.23). Tolerant ability analysis showed that all the 5 strains were tolerant to 6% ethanol concentration, grew well at pH3.5,some even survived pH2.0, could grow at 15～30 ℃.[Conclusion] The obtained 5 mould strains has higher ability to produce amyloglucosidase than the well-known and widely used AS3.4309 and can survive the wholeprocess of Shanxi aged vinegar fermentation.

Shanxi Aged Vinegar; Fermented matrix; High glucoamylase-producing strains; Environmental tolerance

2016-06-11

2016-07-27

張琳(1991-)，女(漢)，山西聞喜人，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)

霍乃蕊，教授，博士。Tel:13935452616; E-mail: tgnrhuo@163.com

山西省科技重點(diǎn)研發(fā)(指南)項(xiàng)目(2015-TN-10-2)；863計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA1009040102)

Q939.97

A

1671-8151(2016)10-0740-05