吉挺，張煥新，殷玲

1(揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225009)　2(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 食品科技學(xué)院，江蘇 泰州，225300)

?

油菜蜂花粉多肽飲料的研制及抗氧化活性評(píng)價(jià)

吉挺1*，張煥新2，殷玲2

1(揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225009)2(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 食品科技學(xué)院，江蘇 泰州，225300)

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，研究不同因素對(duì)復(fù)合蛋白酶水解油菜蜂花粉效果的影響，優(yōu)化了復(fù)合蛋白酶水解的最佳工藝、蜂花粉多肽飲料的最佳配方并分析了蜂花粉多肽飲料的抗氧化活性。酶解的最佳工藝條件為：10.0%油菜蜂花粉漿液，復(fù)合蛋白酶添加量3.5%(堿性蛋白酶與中性蛋白酶質(zhì)量比=2∶1)，pH8.5，酶解溫度55 ℃、時(shí)間200min；在該條件下，多肽的平均得率74.37%。油菜蜂花粉多肽飲料制作的最佳配方為：以油菜蜂花粉蛋白酶解液100%為基準(zhǔn)，分別添加0.10%檸檬酸，4.00%蔗糖，0.25%黃原膠。利用該配方制作的產(chǎn)品口感清爽，酸甜適中，味感協(xié)調(diào)，柔和；淺黃色，質(zhì)地均勻，無(wú)顆?；蛘咝鯛畛恋砦?；有油菜蜂花粉特有的香氣，無(wú)異味；多肽含量1.63%(m/V)，各項(xiàng)理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合相應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；該產(chǎn)品具有良好的抗氧化活性，對(duì)清除羥自由基和超氧陰離子分別為85.28%、46.52%。

油菜花粉；酶解；多肽飲料；抗氧化活性

蜂花粉是雄蜂采集花粉時(shí)加上特殊的腺體分泌物、唾液和花蜜等加工而成的花粉球，呈淡黃色或栗色，味微甜、微苦、略腥。蜂花粉含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、黃酮類化合物等物質(zhì)，不僅具有抗疲勞、抗氧化、增強(qiáng)體力和記憶力、改善組織缺氧等功能[1]，而且對(duì)癌癥、心臟病、高血壓、高血脂、高血糖等多種疾病有很好的預(yù)防和改善作用，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥效價(jià)值[2]。蜂花粉具有獨(dú)特的天然保健功能、醫(yī)療與美容價(jià)值，被越來(lái)越多的人所認(rèn)知。傳統(tǒng)直接吞咽的食用方法很難充分發(fā)揮蜂花粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，主要原因有：(1)結(jié)構(gòu)特殊，花粉具有由纖維素、果膠質(zhì)、半纖維素及蛋白質(zhì)構(gòu)成的堅(jiān)韌細(xì)胞壁，既影響了蜂花粉營(yíng)養(yǎng)成分的吸收利用，也阻止了提取時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放；(2)成分復(fù)雜，不溶性蛋白含量高，且某些蛋白質(zhì)引起部分人群的過(guò)敏性反應(yīng)[3]；(3)蜂花粉天然味重，口感略差，消費(fèi)者接受性差。生物活性多肽具有激素調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降血脂、抗疲勞、抗氧化等生理調(diào)節(jié)功能，是當(dāng)前國(guó)際醫(yī)藥界、食品界重要的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子[4]。谷胱甘肽[5]、大豆蛋白酶解物[6]、花生多肽[7]等已有相關(guān)研究證實(shí)它們都具有很強(qiáng)的抗氧化能力。國(guó)內(nèi)外對(duì)油菜蜂花粉的研究主要集中在破壁技術(shù)，對(duì)于蜂花粉多肽活性的研究開展相對(duì)較晚[8-9]，相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)甚少。本研究以油菜蜂花粉為原料，采用復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶∶中性蛋白酶質(zhì)量=2∶1)水解處理技術(shù)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，研究反應(yīng)各因素對(duì)多肽得率的影響，確定酶解的最佳工藝條件；以油菜蜂花粉蛋白酶水解液為原料，制備功能性油菜蜂花粉多肽飲料并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。旨在使水不溶性和難溶性蛋白降解為可溶性多肽，提高蜂花粉營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值；同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放，降低蛋白的過(guò)敏性；改善產(chǎn)品的感官特性，提高產(chǎn)品的可接受性。

1　材料與儀器

1.1試驗(yàn)材料與主要試劑

油菜蜂花粉由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)提供，其中粗蛋白26.32%，粗脂肪13.74%，灰分3.21%，水分5.82%；堿性蛋白酶(120 000U/g)Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司；中性蛋白酶(100 000U/g)無(wú)錫杰能科生物工程有限公司；檸檬酸、蔗糖、黃原膠(食品級(jí)) 市售；其余試劑均為分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.2試驗(yàn)儀器設(shè)備

AL204分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；JM/GM-膠體磨，溫州昊星機(jī)械設(shè)備制造有限公司；DELTA-320精密pH計(jì)，梅特勒-托利多中國(guó)有限公司；80-2 離心機(jī)，上海浦東物理光學(xué)儀器廠；SP-2100UV紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；THZ-82A水浴恒溫振蕩器，江蘇榮華儀器制造有限公司；GJB-型高壓均質(zhì)機(jī)，常州市均質(zhì)機(jī)械有限公司；YXQ-LS-100G立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3分析方法

1.3.1多肽得率測(cè)定(TCA-NSI法)[10]

取2.5mL油菜蜂花粉酶解處理液，加入2.5mL10%(w/v)的三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻后靜置30min，然后在10 000×g下離心15min，將上清液全部轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，并用5%的TCA定容至刻度，搖勻。然后取6.0mL上述溶液轉(zhuǎn)移至另一試管中，加入雙縮脲試劑4.0mL，混合均勻，靜置30min，取上清液于540nm處測(cè)定OD值。按公式(1)計(jì)算多肽得率。

(1)

1.3.2清除羥自由基活性的測(cè)定：采用鄰二氮菲法比色法[11- 12]。

取0.6mL5mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液，加入0.4mL0.15mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)和0.6mL0.75mmol/L的FeSO4，加入樣品液2mL混勻后，加入0. 4mL體積分?jǐn)?shù)0.1%的H2O2搖勻，37 ℃條件下水浴60min，在波長(zhǎng)536nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度(A樣品)；以去離子水代替樣品和H2O2溶液重復(fù)上述操作，在536nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度(A未損傷)；以去離子水代替樣品液來(lái)重復(fù)以上操作，在536nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度(A損傷)。清除率按公式(2)進(jìn)行計(jì)算。

清除率/%=[(A樣品-A損傷)/(A未損傷-A損傷)]×100

(2)

1.3.3清除超氧陰離子的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[13]。

取樣液0.1mL，加入2.8mL0.1mol/LTris-HCl緩沖溶液(pH8.2)，震蕩混勻，以去離子水代替樣品作空白對(duì)照，25 ℃水浴10min后加入0.1mL3mmol/L鄰苯三酚溶液(25 ℃水浴預(yù)熱)，混勻后迅速在320nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每隔30s讀取吸光值(A)，5min后結(jié)束；以0.1mL去離子水加0.1mol/LTris-HCl(pH=8.2)緩沖溶液2.8mL調(diào)零。作吸光度隨時(shí)間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率V，按式(3)計(jì)算樣品對(duì)O2-·的清除率：

清除率(%)=[(V對(duì)照-V樣品)/V對(duì)照]×100

(3)

式中：V對(duì)照為未加入樣品的鄰苯三酚自氧化速率，ΔA/min；V樣品為加入樣品的鄰苯三酚自氧化速率，ΔA/min。

1.3.4感官評(píng)價(jià)[14]

優(yōu)選10位經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員組成評(píng)分小組，采用盲標(biāo)法對(duì)油菜蜂花粉多肽飲料的外觀、香氣、色澤和口感等品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)打分。以綜合得分為指標(biāo)，優(yōu)化油菜蜂花粉多肽飲料配方，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1　油菜蜂花粉多肽飲料感官質(zhì)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1工藝流程

油菜蜂花粉→破壁處理→酶解→滅酶→調(diào)配→均質(zhì)→脫氣→灌裝→滅菌→檢驗(yàn)→成品

1.4.2操作要點(diǎn)

1.4.2.1破壁處理[15]

稱取油菜蜂花粉，用高速組織搗碎機(jī)粉碎2min，-20 ℃凍藏24h，按1∶10(g∶mL)料液比加入80 ℃的熱水進(jìn)行解凍，經(jīng)過(guò)膠體磨磨漿后過(guò)120目篩。

1.4.2.2酶解

稱取一定量的油菜蜂花粉漿液，在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上用堿性蛋白酶與中性蛋白酶按2∶1的質(zhì)量比配成復(fù)合酶進(jìn)行水解處理，對(duì)影響酶促反應(yīng)的各因子進(jìn)行分析，確定酶解的工藝參數(shù)。

1.4.2.3滅酶

到達(dá)所需時(shí)間反應(yīng)后，將酶解液置于沸水浴中滅酶10min。

1.4.2.4調(diào)配、均質(zhì)

將糖、酸和穩(wěn)定劑先配成溶液，然后按先后順序加入油菜花粉蛋白酶解液；調(diào)配好的漿液在60 ℃、25MPa條件下進(jìn)行2次均質(zhì)處理。

1.4.2.5脫氣、灌裝、

真空脫氣機(jī)的壓力為60～70kPa，脫氣溫度為70 ℃；脫氣后的料液及時(shí)裝瓶封口。

1.4.2.6滅菌、冷卻

在85 ℃滅菌30min，然后進(jìn)行三級(jí)冷卻，即70 ℃～50 ℃～30 ℃。

1.4.3蜂花粉蛋白肽酶解工藝的研究

1.4.3.1單因素試驗(yàn)

油菜蜂花粉濃度固定為料液比(g∶mL)=1∶1，基于堿性蛋白酶與中性蛋白酶在其他蛋白水解中的應(yīng)用條件[16-19]，單因素試驗(yàn)的基本條件設(shè)定為：加酶量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%(E/S，以底物質(zhì)量計(jì))，pH8.0，反應(yīng)溫度55 ℃，水解時(shí)間180min。反應(yīng)結(jié)束后，90 ℃水浴15min滅酶，測(cè)多肽得率。改變影響酶水解的其中一個(gè)因素，其他因素保持不變，分別考察復(fù)合酶添加量、pH值、反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)多肽得率的影響，每組處理重復(fù)3次。

1.4.3.2正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)確定因素水平范圍，以多肽得率為考察指標(biāo)，采用四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)，優(yōu)化油菜蜂花粉蛋白最佳水解條件組合，各因素與水平見(jiàn)表2。

表2　正交試驗(yàn)因素水平表

1.4.3油菜蜂花粉多肽飲料的配方設(shè)計(jì)

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)飲料感官品質(zhì)影響比較大的蔗糖量、檸檬酸量、黃原膠三個(gè)因素，各取三水平，按正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)L9(33)方案，以感官評(píng)分為參考指優(yōu)化產(chǎn)品配方，各因素與水平見(jiàn)表3。

表3正交試驗(yàn)因素水平表

2　結(jié)果與分析

2.1油菜蜂花粉蛋白水解單因素分析

2.1.1酶添加量對(duì)油菜蜂花粉蛋白水解效果的影響

用1mol/LNaOH調(diào)整10.0%油菜蜂花粉漿液pH值至8.0，分別加入堿性與中性復(fù)合蛋白酶1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0% (E/S，以底物質(zhì)量計(jì))，50 ℃水解時(shí)間180min。反應(yīng)結(jié)束后，90 ℃水浴15min滅酶，測(cè)多肽得率。油菜蜂花粉蛋白多肽得率隨復(fù)合蛋白酶添加量的變化如圖1所示。

圖1　復(fù)合蛋白酶添加量對(duì)多肽得率的影響Fig.1　Effect of enzyme-to-substrate ratio on TCA-NSI

由圖1可知，復(fù)合蛋白酶添加量在1.0%～3.0%內(nèi)，油菜蜂花粉蛋白多肽得率隨添加量升高迅速上升，當(dāng)添加量達(dá)到3.0% 時(shí)，多肽得率達(dá)到71. 6%，比1.0%時(shí)增加29.2%。酶添加量在4.0%～5.0%內(nèi)，多肽得率基本不變。水解過(guò)程中，隨著添加量的增大，大分子油菜蜂花粉蛋白在較短時(shí)間內(nèi)被降解成為小分子多肽，多肽得率迅速增加，體系反應(yīng)的初速度迅速增大。當(dāng)添加量較大時(shí)，酶的濃度不再是水解反應(yīng)的限速因素，因此，進(jìn)一步添加酶的用量對(duì)提高肽的得率已沒(méi)有明顯效果[20]。因此，確定最佳酶添加量在2.0%～4.0%。

2.1.2pH值對(duì)油菜蜂花粉蛋白水解效果的影響

復(fù)合蛋白酶在pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 條件下水解油菜蜂花粉蛋白時(shí)多肽得率的變化如圖2所示。

圖2　pH 值對(duì)多肽得率的影響Fig.2　Effect of pH on TCA-NSI

酶促反應(yīng)中，酶活力受pH值影響較大。由圖2可知，pH值在6.0～7.0內(nèi)，油菜蜂花粉蛋白多肽得率較低(37.8%)。隨著pH(>7.0)值的升高，多肽得率迅速增大；當(dāng)體系pH值達(dá)到8. 0時(shí)，多肽得率達(dá)到最大值68.9%。當(dāng)體系pH> 9. 0時(shí)，多肽得率呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，主要原因?yàn)樵谶^(guò)堿性環(huán)境中，酶的構(gòu)象發(fā)生改變，降低了酶的活性[21]，由此表明復(fù)合蛋白酶適合于弱堿性的環(huán)境。選擇pH8. 0～9. 0作為油菜蜂花粉蛋白水解的最佳pH值。

2.1.3溫度對(duì)油菜蜂花粉蛋白水解效果的影響

復(fù)合蛋白酶在40～60 ℃內(nèi)水解油菜蜂花粉蛋白時(shí)多肽得率的變化如圖3所示。

圖3　反應(yīng)溫度對(duì)多肽得率的影響Fig.3　Effect of hydrolysis temperature on TCA-NSI

蛋白酶分子穩(wěn)定性與酶解溫度的高低密切相關(guān)。反應(yīng)溫度過(guò)高，酶分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，次級(jí)鍵解離，致使酶的活性降低甚至喪失催化活性。但反應(yīng)溫度過(guò)低，體系內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)速度緩慢，降低了酶與蛋白分子的碰撞幾率[22]。由圖3可知，溫度由40 ℃ 升至55 ℃ 過(guò)程中油菜蜂花粉蛋白多肽得率逐漸上升，55 ℃時(shí)，多肽得率達(dá)到最大值(70.5%)；進(jìn)一步升高反應(yīng)溫度(>55 ℃)后，多肽得率迅速下降。選擇52～58 ℃作為油菜蜂花粉蛋白水解的最佳溫度范圍。

2.1.4時(shí)間對(duì)油菜蜂花粉蛋白水解效果的影響

復(fù)合蛋白酶在120～240min內(nèi)水解油菜蜂花粉蛋白時(shí)的多肽得率的變化如圖4所示。

圖4　反應(yīng)時(shí)間對(duì)多肽得率的影響Fig.4　Effect of hydrolysis time on TCA-NSI

由圖4可知，在水解時(shí)間120～180min內(nèi)，油菜蜂花粉蛋白多肽得率逐漸上升，水解180min時(shí)，多肽得率達(dá)到最大值(70.9%)。隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽得率則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。堿性蛋白酶和中性蛋白酶均可用于多肽的生產(chǎn)，中性蛋白酶是一種蛋白質(zhì)水解內(nèi)切酶，它能快速地將蛋白質(zhì)從分子內(nèi)部切割成小分子多肽，堿性蛋白酶兼具內(nèi)切和外切特性。由于不同蛋白酶的水解位點(diǎn)不同，二者復(fù)配后可以提高多肽的得率。水解過(guò)程中隨著內(nèi)切位點(diǎn)逐漸減少外切的活力逐漸顯現(xiàn)，體系中的一些多肽分子被水解為氨基酸[23]。因此，在酶解180min后，體系多肽得率略有降低。由此可見(jiàn)，復(fù)合蛋白酶確定最佳水解時(shí)間應(yīng)在160～200min。

2.2油菜蜂花粉蛋白水解最佳工藝條件的確定

根據(jù)正交設(shè)計(jì)L9(34)確定試驗(yàn)方案，在不同因素水平組合條件下，用復(fù)合蛋白酶對(duì)油菜蜂花粉進(jìn)行水解處理，測(cè)定多肽的得率，結(jié)果與分析見(jiàn)表4及表5。

表4　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合及試驗(yàn)結(jié)果

表5　正交試驗(yàn)方差分析

注：將極差最小的因素D作為誤差項(xiàng)。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，由表4可知：各因素對(duì)多肽得率的影響大小依次為：酶解溫度(C)﹥酶解pH(B)﹥復(fù)合蛋白酶添加量(A)﹥酶解時(shí)間(D)，復(fù)合蛋白酶對(duì)油菜蜂花粉水解處理的最優(yōu)組合為：A3B2C2D3。由表5(方差分析)可知：在試驗(yàn)選定的水平范圍內(nèi)，復(fù)合蛋白酶添加量對(duì)多肽的得率影響較小(P>0.05)，而反應(yīng)溫度和pH值對(duì)多肽得率具有顯著影響(P<0.05)。因此，利用復(fù)合蛋白酶水解油菜蜂花粉蛋白時(shí)，溫度和pH值的控制是獲得高得率多肽的關(guān)鍵因素。復(fù)合蛋白酶水解油菜蜂花粉蛋白的最佳工藝條件為：復(fù)合蛋白酶添加量3.5%、pH8.5、酶解溫度55 ℃、時(shí)間200min。在此工藝條件下，利用復(fù)合蛋白酶對(duì)油菜蜂花粉進(jìn)行水解處理，測(cè)得多肽得率分別為72.90%、74.58%、75.62%，平均得率74.37%，相對(duì)誤差小于2.0%，說(shuō)明采用正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的工藝參數(shù)具有較高可信度。

2.3油菜蜂花粉多肽飲料配方的確定

以油菜蜂花粉蛋白酶解液100%為基準(zhǔn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按正交設(shè)計(jì)確定的不同試驗(yàn)組合制作油菜蜂花粉多肽飲料，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)打分，結(jié)果與分析見(jiàn)表6及表7。

表6　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合及試驗(yàn)結(jié)果

表7　正交試驗(yàn)方差分析

由表6可知，各因素對(duì)多肽飲料的影響大小依次為：黃原膠(C)﹥檸檬酸(A)﹥蔗糖添加量(B)，功能性油菜蜂花粉多肽飲料的最優(yōu)組合為A1B2C3。由方差分析表7可知，飲料配方中，黃原膠添加量對(duì)其感官品質(zhì)影響極顯著(P<0.01)，主要原因?yàn)辄S原膠對(duì)不溶性固體和油滴具有良好的懸浮作用，顯示出很強(qiáng)的乳化穩(wěn)定作用和高懸浮能力，使產(chǎn)品質(zhì)地均勻，避免顆粒或者絮狀沉淀物的產(chǎn)生，從而極大的改善了產(chǎn)品的外觀和口感品質(zhì)。同時(shí)，檸檬酸、蔗糖添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)也具有顯著影響(P<0.05)。因此，制作功能性油菜蜂花粉多肽飲料的最佳配方為：油菜蜂花粉蛋白酶解液100%計(jì)，檸檬酸添加量0.10%，蔗糖添加量4.00%，黃原膠添加量0.25%。

2.4油菜蜂花粉多肽飲料品質(zhì)分析

利用優(yōu)化后的最佳工藝和配方制作功能性油菜蜂花粉多肽飲料，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官、理化、微生物指標(biāo)和抗氧化性能評(píng)價(jià)。

2.4.1油菜蜂花粉多肽飲料感官特性

口感清爽，酸甜適中，味感協(xié)調(diào)，柔和；淺黃色，質(zhì)地均勻，無(wú)顆?；蛘咝鯛畛恋砦?；有油菜蜂花粉特有的香氣，無(wú)異味。

2.4.2油菜蜂花粉多肽飲料理化、微生物指標(biāo)

多肽含量16.3mg/mL，可溶性固形物148.2mg/mL。

2.4.3微生物指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)46.0CFU/mL；大腸菌群3.0CFU/mL；致病菌沒(méi)有檢出。

2.4.4油菜蜂花粉多肽飲料抗氧化活性

以未經(jīng)復(fù)合蛋白酶處理的油菜蜂花粉為原料(其他配方、工藝處理相同)，制作油菜蜂花粉飲料作為對(duì)照組，分別測(cè)定對(duì)照組和試驗(yàn)組對(duì)羥自由基和超氧陰離子清除活性，對(duì)功能性油菜蜂花粉多肽飲料抗氧化特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。

表8　產(chǎn)品抗氧化特性測(cè)定結(jié)果

注：*，同列上角標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著(P<0.01)。

由表8知，對(duì)照組油菜蜂花粉飲料本身具有一定的抗氧化活性，但活性較弱。對(duì)羥自由基，超氧陰離子清除率分別為29.34%，16.35%。油菜蜂花粉多肽飲料(試驗(yàn)組)則展現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)羥自由基，超氧陰離子清除率分別到達(dá)85.28%，46.52%，與對(duì)照組抗氧化活性差異極顯著。油菜蜂花粉多肽飲料對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基清除能力明顯優(yōu)于普通油菜蜂花粉飲料，表明經(jīng)過(guò)復(fù)合蛋白酶解所得到的多肽生物活性得到大幅度提高，其機(jī)理可能是油菜蜂花粉蛋白被酶解為分子量較小的多肽，使更多的活性位點(diǎn)暴露出來(lái)，從而提高了其抗氧化的能力[24-25]。同時(shí)，結(jié)果還表明油菜蜂花粉蛋白多肽清除羥自由基的能力優(yōu)于清除超氧陰離子。

3　結(jié)論

(1) 油菜蜂花粉是一種富含蛋白質(zhì)的重要功能性食品資源。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定了復(fù)合蛋白酶水解油菜蜂花粉的最佳工藝：10.0%油菜蜂花粉漿液，復(fù)合蛋白酶添加量3.5%(堿性蛋白酶∶中性蛋白酶質(zhì)量=2∶1)，pH8.5、酶解溫度55 ℃、時(shí)間200min。在此工藝條件下，多肽的平均得率74.37%。

(2) 結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，確定了油菜蜂花粉多肽飲料的配方：以油菜蜂花粉蛋白酶解液100%為基準(zhǔn)，分別添加0.10%檸檬酸，4.00%蔗糖，0.25%黃原膠。利用此配方制作的產(chǎn)品口感清爽，酸甜適中，味感協(xié)調(diào)，柔和；淺黃色，質(zhì)地均勻，無(wú)顆?；蛘咝鯛畛恋砦?；有油菜蜂花粉特有的香氣，無(wú)異味；各項(xiàng)理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合相應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

(3) 油菜蜂花粉多肽飲料具有良好的抗氧化活性，對(duì)清除羥自由基和超氧陰離子分別為85.28%、46.52%，對(duì)羥自由基的清除效果優(yōu)于清楚超氧陰離子，而對(duì)于其它生物活性則有待于進(jìn)一步的研究。

[1]任向楠, 張紅城, 董 捷.蜂花粉破壁的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2009, 21(30):380-383

[2]阮征, 賴富饒. 油菜花粉中黃酮類物質(zhì)提取工藝的優(yōu)化研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(7):133-137.

[3]JOHNSONSA,NICOLSONSW.Pollendigestionbyflower-feedingScarabaeidae:proteabeetles(Cetoniini)andmonkeybeetles(Hopliini) [J].InsectPhysiology, 2000, 47:725-733.

[4]BYUNHG,KIMSK.PurificationandcharacterizationofangiotensinⅠconvertingenzyme(ACE)inhibitorypeptidesfromAlaskapollack(Theragra chalcogramma)skin[J].ProcessBiochemistry, 2001, 36:1155-1162.

[5]胡文琴, 王恬, 孟慶利. 抗氧化活性肽的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)油脂, 2004, 29(5):42-45.

[6]陳美珍, 余杰, 郭慧敏. 大豆分離蛋白酶解物清除羥自由基作用的研究[J]. 食品科學(xué), 2002, 23(1):43-46.

[7]胡志和, 郭嘉. 利用冷榨花生餅制備花生多肽飲料[J]. 食品科學(xué), 2011, 20(32):335-340.

[8]朱曉麗, 孫麗萍, 董 捷. 油菜蜂花粉酶解物抗氧化性能的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(5):74-76.

[9]朱曉麗, 孫麗萍, 董捷. 油菜蜂花粉中不同分子量級(jí)分清除羥自由基的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(8):565-568.

[10]CHAVANVD,MCKENZIEDB,SHAHIDIF.Functionalpropertiesofproteinisolatesfrombeachpea(Lathyrus maritimusL.)[J].FoodChem, 2001, 74:177-187.

[11]JINM,CAIY,LIJ,etal. 1,10-Phenanthroline-Fe2+oxidativeassayofhydroxylradicalproducedbyH2O2/Fe2+[J].ProgressinBiochemistryandBiophysics, 1996, 23(6):553-555.

[12]DEAVELLARIG,MAGALHAESMM，SILVAAB，etal.Reevaluatingtheroleof1,10-phenanthrolineinoxidativereactionsinvolvingferrousionsandDNAdamage[J].BiochimBiophysActa, 2004, 1 675:46-53.

[13]鄧乾春, 陳春艷, 潘雪梅, 等. 白果活性蛋白的酶法水解及抗氧化活性研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2005, 21(11):155-159.

[14]俞益芹, 張煥新. 澄清枇杷果汁飲料加工工藝[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(3):257-259.

[15]隋華嵩, 趙倩輝, 薛龍, 等.金絲梅花粉可溶性多肽提取工藝研究[J]．食品與發(fā)酵科技, 2012, 48(2):40-43.

[16]張宇昊, 王強(qiáng).Alcalase酶水解花生蛋白制備花生短肽的研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2007, 23(4):258-263.

[17]ADAMSONNJ,REYNOLDSEC.Characterizationofcaseinphosphopeptidespreparedusingalcalase:determinationofenzymespecificity[J].EnzymeandMicrobialTechnology, 1996, 19:202-209.

[18]何莉萍, 劉良忠. 中性蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)玉米蛋白水解作用的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(3):152-157.

[19]吳建中. 大豆蛋白的酶法水解及產(chǎn)物抗氧化活性的研究[D]. 廣州：華南理工大學(xué), 2002.

[20]劉紅梅,師廣波,李向東,等. 復(fù)合酶法水解花生粕制備抗氧化肽的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào), 2014, 32(3):59-64.

[21]MUNILLA-NORANR,SABORIDO-REYF.Digestiveenzymesinmarinespeies.1:Proteaseactivitiesingutfromredfish(Sebastes mentella),seabream(Sparusaarata)andturbot(Scophthalmus inaximus)[J].CompBiochemPhysiol, 1996, 113 (2):395-402.

[22]WANGH,NGTB.Pleureryn,anovelproteasefromfreshfruitingbodiesoftheediblemushroomPleurotuseryngii[J].BiochemBiophysResCommun, 2001, 289(3):750-755.

[23]段旭昌, 白艷紅, 徐懷德, 等. 酶解牛乳蛋白多肽復(fù)合果汁乳酒工藝研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2006, 22(3):138-142.

[24]KLOMPONGV,BENJAKULS,KANTACHOTED,etal.Antioxidativeactivityandfunctionalpropertiesofproteinhydrolysateofyellowstripetrevally(Selaroides leptolepis)asinfluencedbythedegreeofhydrolysisandenzymetype[J].FoodChemistry, 2007, 102(2): 1 317-1 327.

[25]JAMDARSN,RAJALAKSHMIV,PEDNEKARMD,etal.Influenceofdegreeofhydrolysisonfunctionalproperties,antioxidantactivityandACEinhibitoryactivityofpeanutproteinhydrolysates[J].FoodChemistry, 2010, 121(1):178-184.

Developmentandantioxidantactivityvaluationofrapepollenpolypeptidebeverage

JITing1*,ZHANGHuanxin2,YINLing2

1(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)2(SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangsuAgri-animalHusbandryVocationalCollege,Taizhou225300,China)

Inthisstudy,acombinationofAlcalaseandNeutrasewasusedtohydrolyzerapepollentoobtainpolypeptideanddeveloprapepollenpolypeptidebeverage.Withthepeptideyieldastheindex,single-factorandorthogonalexperimentswereemployedtooptimizethehydrolysisconditions.Resultsindicatedthattheoptimalprocessingconditionsforhydrolyzingrapepollenwereasfollows: 10.0%rapepollen, 3.5%AlcalaseandNeutrase(2:1),pHvalues8.5,temperature55℃.Undertheseconditions,thepolypeptideyieldreachedto74.37%.Theoptimumformulaofrapepollenpolypeptidebeveragewasadditonal0.10%citricacid, 0.10%sugar, 0.25%xanthangum.Thebeveragehadanicetasteandspecialflavorofrapepollenanditspolypeptidecontent(m/V)wasmorethan1.53%,allthephysicochemicalandhealthindicesmetnationalstandards.Moreover,theproductshowedsignificantantioxidantactivitywith,thescavengingrateofhydroxylradicalandsuperoxideanionradicalof85.28%and46.52%,respectively.

rapepollen;enzymatichydrolysis;polypeptidebeverage;antioxidantactivity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608024

博士，研究員(本文通訊作者，E-mail：tji@yzu.edu.cn)。

國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-45-SYZ6)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372382)； 江蘇省科技支撐計(jì)劃(SBE201230535)；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院科技橫向合作(NSFPT201520)

2015-11-15，改回日期：2016-01-24