許云華，馬　波，，張　衡，羅　麗，張　雷，鄭　霞

（1.連云港師范高等專(zhuān)科學(xué)校 生命科學(xué)系，江蘇 連云港 222006；2.南京理工大學(xué) 化學(xué)生物功能材料研究所江蘇 南京 210094）

葡糖醋桿菌RZS01發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素的研究

許云華1，馬波1，2，張衡2，羅麗1，張雷1，鄭霞1

（1.連云港師范高等專(zhuān)科學(xué)校 生命科學(xué)系，江蘇 連云港 222006；2.南京理工大學(xué) 化學(xué)生物功能材料研究所江蘇 南京 210094）

采用葡糖醋桿菌（Komagataeibacter nataicola）RSZ01進(jìn)行細(xì)菌纖維素發(fā)酵試驗(yàn)，利用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，并研究了菌株保藏時(shí)間、接種量和培養(yǎng)基初始pH對(duì)BC產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，保藏期限在30 d以?xún)?nèi)的菌種可基本保證BC產(chǎn)量；在接種量為8%、初始pH值為5.2時(shí)，最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖2.50%，蔗糖3.00%，玉米漿2.2%，磷酸二氫鉀0.35%，硫酸銨0.125%。在此條件下，葡糖醋桿菌RSZ01發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量為12.05 g/L。

葡糖醋桿菌RSZ01；細(xì)菌纖維素；發(fā)酵；條件優(yōu)化

近十多年來(lái)，由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的純天然細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）獲得了生物、材料、食品等實(shí)驗(yàn)室研究人員的密切關(guān)注［1-3］。它具有的許多優(yōu)良的特性使其已應(yīng)用于食品［4］、造紙［5-6］、組織工程［7］、醫(yī)用敷料［8-9］等行業(yè)。然而，更高附加值的動(dòng)態(tài)發(fā)酵絮狀細(xì)菌纖維素的廣泛應(yīng)用卻嚴(yán)重地受制于其易突變不穩(wěn)定的菌株及較低的產(chǎn)量［10］。目前，BC的靜態(tài)發(fā)酵工藝較為成熟，海南等地已可小批量進(jìn)行工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。相對(duì)動(dòng)態(tài)發(fā)酵，靜態(tài)發(fā)酵的BC產(chǎn)量較高，但同時(shí)存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、占地面積大、產(chǎn)品應(yīng)用范圍較小等缺點(diǎn)，導(dǎo)致其生產(chǎn)成本高，工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模受限。而對(duì)于BC的純動(dòng)態(tài)發(fā)酵，盡管已有研究人員通過(guò)小試和中試試驗(yàn)研究解決搖瓶產(chǎn)量較低的問(wèn)題，但迄今為止尚未完全形成細(xì)菌纖維素純動(dòng)態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。究其原因，不難發(fā)現(xiàn)影響B(tài)C動(dòng)態(tài)發(fā)酵的主要問(wèn)題如產(chǎn)量低、成本高、高產(chǎn)穩(wěn)定生產(chǎn)菌種缺乏、生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定等仍未被完全解決。國(guó)內(nèi)外的研究人員已從產(chǎn)BC的菌種篩選與復(fù)壯［11-13］和培養(yǎng)基組成與培養(yǎng)條件［14-16］等方面開(kāi)展了大量的研究工作，最近國(guó)內(nèi)有關(guān)研究主要集中在廉價(jià)碳源和氮源的應(yīng)用［17-19］等方面，然而其產(chǎn)量基本集中在5 g/L以下，不利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此，為進(jìn)一步提高其纖維素動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量、探究如何保持菌株高產(chǎn)特性，本研究采用實(shí)驗(yàn)室保藏菌株葡糖醋桿菌（Komagataeibacter nataicola）RSZ01進(jìn)行產(chǎn)細(xì)菌纖維素的動(dòng)態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)研究，以期為實(shí)現(xiàn)我國(guó)細(xì)菌纖維素的動(dòng)態(tài)發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

葡糖醋桿菌（Komagataeibacter nataicola）RZS01（保藏編號(hào)為CGMCC 10961）：南京理工大學(xué)化學(xué)生物功能材料研究所篩選并保藏。

1.1.2試劑

葡萄糖、蔗糖、硫酸銨、冰乙酸、檸檬酸、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、羧甲基纖維素鈉（分析純）、蛋白胨、酵母粉（生化試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米漿（生化試劑）：上海西王淀粉糖有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基［20］

斜面保藏培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，檸檬酸1.5 g/L，磷酸二氫鈉2.5 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂18 g/L，酵母粉0.1 g/L，pH 6.0；

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，硫酸銨6 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，蛋白胨3 g/L，酵母粉2.25 g/L，羧甲基纖維素鈉0.4 g/L，自然pH；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖22 g/L，蔗糖27 g/L，玉米漿18 g/L，硫酸銨1 g/L，磷酸二氫鉀4 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，檸檬酸0. 6 g/L，醋酸1.0 mL/L，pH 5.2。

在進(jìn)行培養(yǎng)或發(fā)酵前，上述培養(yǎng)基均應(yīng)在滅菌鍋中以121℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.2儀器與設(shè)備

YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；QHZ-98A恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉(cāng)市華美生化儀器廠；PH5-3CpH計(jì)：雷磁儀電科學(xué)儀器廠；XZ-21K離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；XMTD-8222烘箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LWD300-38LT顯微鏡：上海測(cè)維光電技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)方法

將保藏于斜面培養(yǎng)基上的菌種接種至滅菌并冷卻的種子培養(yǎng)基中，于30℃、160r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩箱中培養(yǎng)2 d，制備得到葡糖醋桿菌種子液。將種子液以一定比例的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、160 r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩箱中培養(yǎng)7 d，過(guò)濾除去殘留的發(fā)酵液。

1.3.2菌株保藏時(shí)間對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

以實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱中菌種的不同保藏時(shí)間（0、10d、20d、30 d、40 d、50 d、60 d）進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，30℃、以160 r/min的轉(zhuǎn)速下動(dòng)態(tài)發(fā)酵7 d，測(cè)定細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，考察菌種保藏時(shí)間對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響。

1.3.3單因素試驗(yàn)

考察不同碳源（其中葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0到3.50%，間隔0.25%；蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.75%到4.00%，間隔0.25%）、氮源（其中玉米漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0到2.2%，間隔0.2%；硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0到0.300%，間隔0.025%）、無(wú)機(jī)鹽（其中磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0到0.50%，間隔0.05%）；接種量（6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%）、初始pH值（4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0）對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響。

1.3.4正交試驗(yàn)

為考察不同培養(yǎng)基組分對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取葡萄糖、蔗糖、玉米漿、硫酸銨和磷酸二氫鉀為考察因素，以細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)5因素4水平正交優(yōu)化試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1　培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium components optimization

1.3.5細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的測(cè)定［24］

從發(fā)酵培養(yǎng)基中取細(xì)菌纖維素，過(guò)濾除去發(fā)酵液，收集絮狀BC并分散在含3‰NaOH和3‰H2O2的水溶液中，于80℃水浴鍋中處理2～4 h。用流動(dòng)的自來(lái)水將細(xì)菌纖維素中殘留的堿液沖洗干凈，至pH值為中性后，將BC放置于80℃的干燥箱中干燥12 h，至質(zhì)量恒定，計(jì)算每升發(fā)酵液中所含有的BC干質(zhì)量即為BC產(chǎn)量。

2　結(jié)果與分析

2.1菌種保藏時(shí)間對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

菌種保藏時(shí)間對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　菌種保藏時(shí)間對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of strain preservation time on the yield of bacterial cellulose

由表2可知，該菌種在4℃條件下，保藏超過(guò)30 d時(shí)，菌種產(chǎn)細(xì)菌纖維素滯后，且產(chǎn)量也有所減少。即實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該使用新復(fù)壯的、保藏時(shí)間在1個(gè)月內(nèi)的菌種較為合適。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

分別選用葡萄糖、蔗糖為唯一碳源，考察發(fā)酵液中碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量呈先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.25%時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量達(dá)到最大，為12 g/L；繼續(xù)增加葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量逐漸下降。這可能是由于葡萄糖在發(fā)酵合成細(xì)菌纖維素過(guò)程中作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能源物質(zhì)，被菌體快速利用，滿(mǎn)足菌體的代謝，促進(jìn)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)生；隨著葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，滲透壓增大，不利于菌體的新陳代謝，從而限制細(xì)菌纖維素的產(chǎn)生；蔗糖的加入對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量影響相對(duì)葡萄糖較小，可能是由于蔗糖屬于遲緩型碳源，較難被菌體利用，在有葡萄糖存在的培養(yǎng)液中隨蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量增加相對(duì)緩慢。因此選擇葡萄糖和蔗糖最佳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.75%、2.25%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1　發(fā)酵液中碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of carbon source concentration in fermentation liquid on the yield of bacterial cellulose

2.2.2氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

選用玉米漿、硫酸銨為唯一氮源，考察發(fā)酵液中氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，以硫酸銨為無(wú)機(jī)氮源時(shí)，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.100%時(shí)，BC產(chǎn)量達(dá)到最大；繼續(xù)增加發(fā)酵液中硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)，可能導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中pH的下降，進(jìn)而抑制菌體的生長(zhǎng)和細(xì)菌纖維素的合成。

圖2　發(fā)酵液中無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of inorganic and organic nitrogen source concentration in fermentation liquid on the yield of bacterial cellulose

以玉米漿為氮源時(shí)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量在一定范圍內(nèi)隨玉米漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增加，可能是因?yàn)橛衩诐{中含有多種氨基酸、肽及生長(zhǎng)因素，有利于菌體生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)物的積累，當(dāng)玉米漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%時(shí)，BC產(chǎn)量達(dá)到最大值；繼續(xù)增加玉米漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)，BC產(chǎn)量不再增加，可能是有機(jī)氮太多，菌種生長(zhǎng)旺盛而不利于產(chǎn)物積累。因此確定硫酸銨和玉米漿的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.100%和1.8%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.3發(fā)酵液中無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

選用磷酸二氫鉀為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，考察發(fā)酵液中無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，BC產(chǎn)量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.40%時(shí)，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量達(dá)到最高值（11.3 g/L）；而當(dāng)磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí)，BC產(chǎn)量開(kāi)始下降。其原因可能是由于磷、鉀參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成，并與能量轉(zhuǎn)移等功能有關(guān)，添加適量的磷酸二氫鉀能促進(jìn)菌體的代謝，可以提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量。因此選擇磷酸二氫鉀的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.40%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3　發(fā)酵液中磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of monopotassium phosphate concentration in fermentation liquid on the yield of bacterial cellulose

2.2.4接種量和發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

圖4　發(fā)酵液接種量和初始pH對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of inoculum and initial pH of fermentation liquid on the yield of bacterial cellulose

考察接種量和初始pH值對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著培養(yǎng)基的初始pH值的增大，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量先增加，在初始pH值為5.2時(shí)，BC產(chǎn)量達(dá)到最大值（11.2 g/L）。當(dāng)初始pH值繼續(xù)增加時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量略有下降。此外，發(fā)酵液的初始pH高易出現(xiàn)染菌現(xiàn)象。因此選擇最佳初始pH值為5.2。當(dāng)接種量由6%逐漸增加至8%時(shí)，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量也呈現(xiàn)逐步升高趨勢(shì)，當(dāng)接種量為8%時(shí)，BC產(chǎn)量達(dá)到最大值11.5g/L；繼續(xù)加大接種量，BC產(chǎn)量開(kāi)始下降，其原因可能是接種量過(guò)大時(shí)，培養(yǎng)液的菌濃度較高，對(duì)基質(zhì)消耗過(guò)多，不利于產(chǎn)物的積累，從而使得細(xì)菌纖維素產(chǎn)量降低。因此確定最佳初始pH為5. 2，最佳接種量為8%。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果分析

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取葡萄糖、蔗糖、玉米漿、硫酸銨、磷酸二氫鉀5因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3　培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for medium components optimization

表4　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3中R值的大小得知，各因素對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量影響的順序依次為C＞D＞A＞E＞B，即葡萄糖的影響最大，蔗糖次之，之后是玉米漿、磷酸二氫鉀和硫酸銨。葡糖醋桿菌RSZ01發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素的最優(yōu)方案為A4B4C4D3E2，即葡萄糖2.50%、蔗糖3.00%、玉米漿2.2%、磷酸二氫鉀0. 35%、硫酸銨0.150%。由表4可知，葡萄糖對(duì)BC產(chǎn)量影響最顯著（P＜0.1），與極差分析結(jié)果相一致。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，葡糖醋桿菌RSZ01發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量為12.05 g/L。

3　結(jié)論

本研究為提高葡糖醋桿菌（Komagataeibacternataicola）RSZ01發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化，并研究了菌株保藏時(shí)間、接種量和培養(yǎng)基初始pH對(duì)BC產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，保藏期限在30 d以?xún)?nèi)的菌種可基本保證其穩(wěn)定地發(fā)酵產(chǎn)BC產(chǎn)量的水平；在接種量為8%、初始pH值為5.2時(shí)，最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖2.50%，蔗糖3.00%，玉米漿2.2%，磷酸二氫鉀0.35%，硫酸銨0.150%。在此條件下，葡糖醋桿菌RSZ01發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量為12.05g/L，較S-H培養(yǎng)基BC產(chǎn)量（1.02g/L）提高了約12倍。為細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株及其工業(yè)化應(yīng)用研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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Fermentation of Komagataeibacter nataicola RZS01 for bacterial cellulose production

XU Yunhua1，MA Bo1，2，ZHANG Heng2，LUO Li1，ZHANG Lei1，ZHENG Xia1
（1.Department of Life Sciences，Lianyungang Normal College，Lianyungang，222006，China；2.Chemicobiology and Functional Materials Institute of Nanjing University of Science and Technology，Nanjingm，210094，China）

Komagataeibacter nataicolaRSZ01 was used to bacterial cellulose（BC）fermentation tests.The components of fermentation medium were optimized by single factor and orthogonal experiments，and the effects of strain preservation time，inoculum and medium initial pH on BC yield were researched.The results showed that bacteria can guarantee the BC yield basically within preservation time 30 d.In the conditions of inoculum 8%，initial pH 5.2，the optimal fermentation medium components were glucose 2.50%，sugar 3.00%，corn starch 2.2%，monopotassium phosphate 0.35% and ammonium sulfate 0.125%，the BC yield withK.nataicolaRSZ01 fermentation was 12.05 g/L.

Komagataeibacter nataicolaRSZ01；bacterial cellulose；fermentation；conditions optimization

Q939.97

0254-5071（2016）09-0038-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.009

2016-05-16

國(guó)家自然科學(xué)基金（21206076）；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（16KJB180034）；江蘇省高等職業(yè)院校國(guó)內(nèi)高級(jí)訪(fǎng)問(wèn)學(xué)者計(jì)劃項(xiàng)目（2015FX032）

許云華（1968-），女，副教授，碩士，主要從事微生物及生理學(xué)研究工作。