王玉堂，牛雅杰，金宇梟，楊　燁，周寶龍，隋兆華，姜　莉*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.呼和浩特市第二中學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.陜西朱鹮酒業(yè)有限公司，陜西 洋縣 723300）

黑米酒揮發(fā)性成分分析及其變化規(guī)律研究

王玉堂1，牛雅杰1，金宇梟2，楊燁3，周寶龍3，隋兆華3，姜莉1*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.呼和浩特市第二中學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.陜西朱鹮酒業(yè)有限公司，陜西 洋縣 723300）

以不同釀造工藝制得的3種黑米酒為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)分析黑米酒中的揮發(fā)性成分，并對(duì)貯藏期間3種黑米酒香氣成分的變化規(guī)律進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，3種黑米酒共鑒定出66種香氣成分，其中10°半干黑谷酒46種、傳統(tǒng)型黑米酒51種、12°干紅黑谷酒36種，揮發(fā)性物質(zhì)主要包括醇類、酯類、醛酮類、酚類以及酸類物質(zhì)等（醇類最高，酯類次之）。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，3種黑米酒香氣成分含量均呈下降趨勢(shì)，傳統(tǒng)型黑米酒揮發(fā)性成分相對(duì)豐富且較為穩(wěn)定，而采用現(xiàn)代新技術(shù)生產(chǎn)的12°干紅黑谷酒風(fēng)味物質(zhì)變化最大且不穩(wěn)定。

頂空固相微萃??；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；黑米酒；揮發(fā)性成分

黑米在民間有“珍貢米”、“藥米”的美譽(yù)，它含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)，而且氨基酸組成齊全，同時(shí)富含多種微量元素和維生素、花色苷等生理活性成分，能調(diào)節(jié)人體的多種生理功能，具有抗氧化、抗炎、預(yù)防心腦血管疾病等作用，是發(fā)展天然保健食品、功能食品的理想原料。據(jù)《本草綱目》記載，黑米具有滋陰補(bǔ)腎、健脾暖肝、明目活血等功效［1-2］。

黑米酒以黑米為主要原料，通過(guò)傳統(tǒng)的發(fā)酵和勾兌工藝制成，富有保健功能，是一種甘甜醇和、酒香濃郁、營(yíng)養(yǎng)豐富的低度發(fā)酵飲料酒，受到越來(lái)越多消費(fèi)者的青睞［3-4］。已有文獻(xiàn)對(duì)黑米酒中酚類活性物質(zhì)的種類和含量進(jìn)行了研究［5］，其具有防齲齒、防輻射、抗過(guò)敏、抗癌、抗血小板凝聚等作用。黑米酒的香氣直接影響酒的感官評(píng)價(jià)與風(fēng)格鑒定，是黑米酒質(zhì)量的決定因素之一。其香氣成分主要來(lái)源于發(fā)酵原料、發(fā)酵微生物代謝物和陳釀過(guò)程，同時(shí)在整個(gè)釀造過(guò)程中不同物質(zhì)之間存在相互作用，使得香氣成分的組成更加復(fù)雜。采用頂空固相微萃?。╤eadspace-solidphase microextraction，HS-SPME）預(yù)處理樣品，其具有方便快捷、成本低、集采樣、萃取、濃縮和進(jìn)樣于一體的優(yōu)點(diǎn)，成為目前國(guó)內(nèi)外使用較多的對(duì)樣品進(jìn)行分離富集的方法之一，已在食品、生化、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［6-7］，且氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）法已經(jīng)成為酒類香氣成分最常見(jiàn)的分析技術(shù)之一，在果酒［8-12］、白酒［13-14］、啤酒［15-17］香氣成分分析上已有較多應(yīng)用。本研究采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析不同釀造工藝的3種黑米酒的香氣成分，為黑米酒品質(zhì)特性的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

10°半干黑谷酒、傳統(tǒng)型黑米酒和12°干紅黑谷酒：陜西朱鹮酒業(yè)公司。氯化鈉（分析純）：西安化學(xué)試劑廠。

1.2儀器與設(shè)備

手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器、100 μm聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取頭：美國(guó)Supelco公司；TRACE DSQ GC-MS聯(lián)用儀：美國(guó)Finnigan公司；DB-WAX彈性石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）：安捷倫科技有限公司；HW-SY21-K8C恒溫水浴鍋：北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表廠；FA2004電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1黑米酒釀造工藝流程

10°半干黑谷酒：洋縣黑米→黑米色素萃取→高溫蒸煮→恒溫糖化（采用純種生物酶和人工馴化酵母為糖化、發(fā)酵劑）→控溫控糖發(fā)酵→低溫貯存→除菌過(guò)濾→無(wú)菌冷灌裝

傳統(tǒng)型黑米酒：洋縣黑米→浸米→蒸煮→攤涼→雙邊發(fā)酵（采用多菌種曲和人工馴化酵母為糖化、發(fā)酵劑）→壓榨→澄清→貯存→冷凍→精濾→灌裝

12°干紅黑谷酒：洋縣黑米→黑米色素萃取→高溫糊化→恒溫糖化（采用純種生物酶為糖化、發(fā)酵劑）→控溫脫糖發(fā)酵→低溫貯存→除菌過(guò)濾→無(wú)菌冷灌裝

1.3.2樣品提取

準(zhǔn)確移取8 mL黑米酒樣于15 mL頂空瓶中，加入2.0 g NaCl，加蓋密封，振搖，置于40℃水浴中平衡10 min；進(jìn)樣前將固相微萃取的萃取頭在250℃氣相色譜儀的進(jìn)樣口老化1 h，并將老化好的固相微萃取器插在樣品瓶上，吸附40min后拔出，插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，于250℃解吸5min。

1.3.3GC-MS分析

色譜條件：DB-WAX彈性石英毛細(xì)管柱（60m×0.25mm× 0.25μm），程序升溫：起始溫度40℃，保持2.5min，以5℃/min升至230℃，保持8 min；進(jìn)樣口溫度250℃；傳輸線溫度230℃；載氣氦氣（He），流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI），電子能量70eV，離子源溫度250℃，質(zhì)量掃描范圍35～400 amu；發(fā)射電流100 μA，檢測(cè)電壓1.4 kV。

1.3.4數(shù)據(jù)處理

定性分析：利用隨機(jī)Xcalibur工作站美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）2002標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，參考有關(guān)文獻(xiàn)資料及標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)機(jī)檢結(jié)果進(jìn)行核對(duì)和確認(rèn)。

定量分析：采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分含量。

2　結(jié)果與分析

2.13種不同釀造工藝黑米酒揮發(fā)性風(fēng)味成分

3種不同釀造工藝所得黑米酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS總離子流色譜圖見(jiàn)圖1，所得成分經(jīng)譜庫(kù)檢索，分析鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1　10°半干黑谷酒（A）、傳統(tǒng)型黑米酒（B）和12°干紅黑谷酒（C）揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chromatogram of volatile components of semi dry black rice wine with alcohol 10%（A），traditional black rice wine（B）and dry red black rice wine with alcohol 12%（C）by GC-MS

由圖1和表1可知，采用HS-SPME-GC-MS提取分析3種不同釀造工藝所得黑米酒中揮發(fā)性成分，共檢測(cè)出66種揮發(fā)性成分，主要包括醇類（9種）、酯類（22種）、醛酮類（12種）、酸類（11種）、其他（12種），它們賦予了黑米酒豐富的味感和特有的香氣。

10°半干黑谷酒中主要檢出異丁醇、異戊醇、2，3-丁二醇、苯乙醇等9種醇類物質(zhì)（70.92%）；傳統(tǒng)型黑米酒中主要檢出異丁醇、異戊醇、苯乙醇等8種醇類物質(zhì)（69.31%）；12°干紅黑谷酒中主要檢出異丁醇、異戊醇、2，3-丁二醇、苯乙醇和丙三醇等7種醇類物質(zhì)（64.7%）。酯類和酚類物質(zhì)是黑米酒香氣的重要成分，10°半干黑谷酒中主要檢出乙酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸異戊酯、乳酸乙酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、琥珀酸二乙酯、醋酸苯乙酯、棕櫚酸乙酯等17種酯類物質(zhì)（8.69%）和2，4-二叔丁基苯酚（3.76%）；傳統(tǒng)型黑米酒中主要檢出乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、琥珀酸二乙酯、棕櫚酸乙酯等16種酯類物質(zhì)（14.68%）和2，4-二叔丁基苯酚（1.00%）；12°干紅黑谷酒中主要檢出乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、琥珀酸二乙酯、醋酸苯乙酯、棕櫚酸乙酯等9種酯類物質(zhì)（3.16%）和2，4-二叔丁基苯酚（2.45%）。醛酮類物質(zhì)是黑米酒中重要的微量風(fēng)味成分，影響其呈香呈味，10°半干黑谷酒中主要檢出的醛酮類物質(zhì)有糠醛、苯甲醛、5-羥甲基-2-呋喃甲醛和紫羅蘭酮等8種（2.27%）；傳統(tǒng)型黑米酒中主要檢出乙縮醛、糠醛、苯甲醛、5-羥甲基-2-呋喃甲醛等11種醛酮類物質(zhì)（4.39%）；12°干紅黑谷酒中主要檢出乙縮醛、糠醛、苯甲醛、5-羥甲基-2-呋喃甲醛等6種醛酮類物質(zhì)（1.32%）。結(jié)果表明，3種不同釀造工藝黑米酒揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量存在較大差異，其中10°半干黑谷酒和傳統(tǒng)型黑米酒中檢測(cè)到揮發(fā)性成分較多，這是因?yàn)樵趥鹘y(tǒng)生產(chǎn)工藝中，發(fā)酵溫度低、周期長(zhǎng)（傳統(tǒng)型黑米酒），有利于酯類物質(zhì)的合成，同時(shí)酵母的代謝會(huì)產(chǎn)生更多的風(fēng)味物質(zhì)（傳統(tǒng)型黑米酒、10°半干黑谷酒），而隨著新工藝、新技術(shù)的飛速發(fā)展，采用純種生物酶使得發(fā)酵周期短，造成高級(jí)醇含量上升，揮發(fā)性酯類的含量下降（12°干紅黑谷酒）。

表1　3種不同釀造工藝所得黑米酒揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果Table 1 Analysis results of GC-MS for volatile components in black rice wine with three different brewing processes

續(xù)表

2.23種不同釀造工藝黑米酒香氣成分隨貯藏時(shí)間的變化

圖2　10°半干黑谷酒（A）、傳統(tǒng)型黑米酒（B）和12°半干黑谷酒（C）貯藏過(guò)程中香氣成分的變化Fig.2 Changes of aroma components in semi dry black rice wine with alcohol 10%（A），traditional black rice wine（B）and dry red black rice wine with alcohol 12%（C）during storage

由圖2A可知，10°半干黑谷酒中含量最高的酯類物質(zhì)為乙酸乙酯和琥珀酸二乙酯，兩者均隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低，異丁酸乙酯、乙酸異戊酯和乳酸乙酯也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，棕櫚酸乙酯有升高趨勢(shì)。除乙醇外，異戊醇和苯乙醇含量高，其中異戊醇隨貯藏期延長(zhǎng)先升高后降低，苯乙醇變化規(guī)律不穩(wěn)定，異丁醇、乙酸和2，4-二叔丁基苯酚均呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。結(jié)果說(shuō)明，由于酯酶的水解作用在貯藏過(guò)程中占主導(dǎo)，會(huì)造成酯類物質(zhì)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

由圖2B可知，傳統(tǒng)型黑米酒酯類物質(zhì)中琥珀酸二乙酯含量最高，且隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)顯著變化，乙酸乙酯含量較低，前期有上升趨勢(shì)，一年后含量較低。丁酸乙酯、乳酸乙酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯隨貯藏期延長(zhǎng)有升高趨勢(shì)，棕櫚酸乙酯有所下降；異戊醇隨貯藏期延長(zhǎng)先升高后降低，苯乙醇較穩(wěn)定，變化不大；異丁醇、乙酸和5-羥甲基-2-呋喃甲醛隨貯藏期延長(zhǎng)無(wú)顯著變化。結(jié)果說(shuō)明，采用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，同時(shí)加入多菌種曲和酵母發(fā)酵，其風(fēng)味物質(zhì)含量較多，且在貯藏期間酯類和醇類物質(zhì)變化相對(duì)穩(wěn)定，酒香更為濃郁。

由圖2C可知，12°半干黑谷酒中兩種含量最高的酯類物質(zhì)乙酸乙酯和琥珀酸二乙酯，且隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低。乳酸乙酯和醋酸苯乙酯含量相對(duì)穩(wěn)定；棕櫚酸乙酯、苯乙醇和丙三醇變化不穩(wěn)定，有待進(jìn)一步研究。異丁醇和異戊醇隨貯藏期延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

3　結(jié)論

本研究通過(guò)頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)10°半干黑谷酒、傳統(tǒng)型黑米酒和12°干紅黑谷酒中的香氣成分進(jìn)行了分析，并對(duì)其貯藏期間香氣成分的變化規(guī)律進(jìn)行了研究。3種黑米酒中共鑒定出香氣成分66種，其中10°半干黑谷酒46種、傳統(tǒng)型黑米酒51種、12°干紅黑谷酒36種。研究表明，黑米酒中含有醇類、酯類、醛酮類、酚類以及酸類物質(zhì)等，它們賦予了黑米酒豐富的味感和特有的香氣。貯藏過(guò)程中醇類及酯類等香味物質(zhì)因發(fā)酵工藝不同呈現(xiàn)的變化趨勢(shì)有所不同。采用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，同時(shí)加入多菌種曲和酵母發(fā)酵，發(fā)酵周期長(zhǎng)，其風(fēng)味物質(zhì)含量較多，且在貯藏期間酯類和醇類物質(zhì)變化小，相對(duì)比較穩(wěn)定，酒香更為濃郁。而采用現(xiàn)代新型純種生物酶發(fā)酵工藝，可以大大縮短發(fā)酵時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率，但是較快的發(fā)酵周期，會(huì)造成風(fēng)味物質(zhì)不豐富，且會(huì)造成產(chǎn)品在貯藏期其揮發(fā)性成分變化較大且不穩(wěn)定等情況。研究不同釀造工藝所得黑米酒及其在貯藏過(guò)程中主要香氣成分含量變化的規(guī)律，對(duì)黑米酒加工生產(chǎn)中，嚴(yán)格把控、改善香氣、提高產(chǎn)品品質(zhì)具有一定的理論指導(dǎo)意義。

［1］賴來(lái)展.黑色食品開(kāi)拓的研究［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995：12-89.

［2］趙成璋.應(yīng)用無(wú)性系變異技術(shù)培育黑珍米的研究［J］.中國(guó)水稻科學(xué)，1993，7（2）：120-122.

［3］SHEN F，NIU X Y，YANG D T，et al.Determination of amino acids in Chinese rice wine by fourier transform near-infrared spectroscopy［J］.J Agr Food Chem，2010，58（17）：9809-9816.

［4］XU C L，RUO L H，F(xiàn)ANG C，et al.Bacterial community dynamics during the traditional brewing of Wuyi Hong Qu glutinous rice wine as determined byculture-independent methods［J］.Food Control，2013，34（2）：300-306.

［5］姜莉，周寶龍，楊燁，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定黑米酒中11種酚類物質(zhì)［J］.中國(guó)釀造，2014，33（2）：134-137.

［6］司波，陳野.固相微萃取技術(shù)及其在食品分析上的作用［J］.中國(guó)釀造，2012，31（11）：4-7.

［7］李欣，劉登勇，李亮，等.SPME-GC-MS法分析金華火腿風(fēng)味物質(zhì)的條件優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2014，35（4）：122-126.

［8］楊華，劉亞娜，郭德軍.紅豆越橘果汁及發(fā)酵果酒香氣成分的GC-MS分析［J］.中國(guó)釀造，2014，33（12）：133-138.

［9］張妮，肖作兵，于海燕，等.頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定櫻桃酒中揮發(fā)性成分［J］.食品科學(xué)，2011，32（10）：97-102.

［10］MAURIZIO P，DANIELA B，MASSIMO G，et al.Quantification by solid phase micro extraction and stable isotope dilution assay of norisoprenoid compounds in red wines obtained from Piedmon rare varieties［J］.Food Chem，2012，135（4）：2483-2489.

［11］SAGRATINI G，MAGGI F，CAPRIOLI G，et al.Comparative study of aroma profile and phenolic content of Montepulciano monovarietal red wines from the Marches and Abruzzo regions of Italy using HS-SPMEGC-MS and HPLC-MS［J］.Food Chem，2012，132（3）：1592-1599.

［12］李美萍，苗瀟瀟，張生萬(wàn).HS-SPME-GC-MS分析石榴酒中易揮發(fā)性成分［J］.食品科學(xué)，2014，35（8）：263-268.

［13］張明霞，趙旭娜，楊天佑，等.頂空固相微萃取分析白酒香氣物質(zhì)的條件優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2011，32（12）：49-53.

［14］王志娟，張生萬(wàn)，趙景龍，等.竹葉青酒易揮發(fā)性成分頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜分析［J］.食品科學(xué)，2014，35（8）：253-258.

［15］BARROS E P，MOREIRA N，PEREIRA G E，et al.Development and validation of HS-SPME with a gas chromatography-ion trap/mass spectrometry method for analysis of volatile in wines［J］.Talanta，2012，101（22）：177-186.

［16］RIU-AUMATELL M，MIRO P，SERRA-CAYUELA A，et al.Assessment of the aroma profiles of low-alcohol beers using HS-SPMEGC-MS［J］.Food Res Int，2014，57（1）：196-202.

［17］RODRIGUEZ-BENCOMO J J，MUNOZ-GONZALEZ C，MARTIN-ALVAREZ P J，et al.Optimization of a HS-SPME-GC-MS procedure for beer volatile profiling using response surface methodology：application to follow aroma stability of beers under different storage conditions［J］.Food Anal Method，2012，5（6）：1386-1397.

Analysis of volatile components in black rice wine and the change rules

WANG Yutang1，NIU Yajie1，JIN Yuxiao2，YANG Ye3，ZHOU Baolong3，SUI Zhaohua3，JIANG Li1*
（1.College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Yangling 712100，China；2.Hohhot No.2 High School，Hohhot 010010，China；3.Shaanxi Crested Ibis Rice Wine Co.，Ltd.，Yangxian 723300，China）

With three kinds of black rice wine obtained by different brewing process as experimental object，the volatile components in black rice wine were analyzed by HS-SPME-GC-MS，and the change rules of aroma components in the rice wines were researched during the storage.The results showed that 66 kinds of aroma components in three kinds of black rice wine were identified，46 kinds of aroma components in 10°semi dry black rice wine，51 kinds of aroma components in the rice wine and 36 kinds of aroma components in dry red black rice wine with alcohol 12%，mainly includes alcohols，esters，aldehydes，ketones，phenols，acids and so on（alcohols content was the highest，and then esters）.The contents of aroma components in the rice wines were decreased with the prolonged storage time.The volatile components in traditional black rice wine were rich relatively and the contents were relatively stable，but the volatile components in dry red black rice wine with alcohol 12%obtained by modern new technology had greatest changes and the contents were unstable.

HS-SPME；GC-MS；black rice wine；volatile components

O657.63

0254-5071（2016）09-0059-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.014

2016-03-31

中國(guó)博士后基金面上項(xiàng)目（K3080215804）

王玉堂（1980-），男，副教授，博士，主要從事食品化學(xué)與分析的教學(xué)與研究工作。

姜莉（1968-），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事食品化學(xué)與分析的教學(xué)與研究工作。