王　攀，隗程峰，蔡鳳嬌，汪江波*

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068）

酵母胞外酶的產(chǎn)酯發(fā)酵條件優(yōu)化研究

王攀，隗程峰，蔡鳳嬌，汪江波*

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068）

以觀音土曲中的一株酵母菌Y2為研究對(duì)象，將菌株Y2在發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后取其胞外酶，并將其運(yùn)用于酯化反應(yīng)體系中進(jìn)行催化反應(yīng)，以產(chǎn)酯能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，先后采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化菌株Y2產(chǎn)酯發(fā)酵條件。結(jié)果表明，當(dāng)酵母菌接種量為4%、培養(yǎng)基初始pH值為5、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時(shí)間為4 d時(shí)，菌株Y2具有最高產(chǎn)酯力1.24 g/L。

酵母；胞外酶；產(chǎn)酯發(fā)酵條件；優(yōu)化

酯化酶是脂肪酶和酯酶的統(tǒng)稱，它與短碳鏈酯類的合成有關(guān)。傳統(tǒng)白酒釀造所用曲含有大量的微生物，它們是白酒釀造的天然“發(fā)動(dòng)機(jī)”及“風(fēng)味調(diào)節(jié)師”。其中的產(chǎn)酯酵母就是非常重要的一類菌種，它們能代謝產(chǎn)生酯化酶。酯化酶能催化白酒發(fā)酵體系中的醇類與酸類發(fā)生酯化反應(yīng)而產(chǎn)生酯類物質(zhì)。酯類物質(zhì)是白酒體系的風(fēng)味調(diào)節(jié)劑，特別是乙酸乙酯，它在酯類物質(zhì)中處于主導(dǎo)地位，其含量高低很大程度決定著清香型白酒的質(zhì)量及風(fēng)格，是清香型小曲白酒的特征香味成分之一［1-5］。

有研究表明，清香型小曲酒中乙酸乙酯是由生香酵母在發(fā)酵過(guò)程中利用葡萄糖后首先代謝乙醇和乙酸，而后在酵母產(chǎn)生的酯化酶作用下生成的。因此，篩選適合清香型白酒釀造的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)酯酵母對(duì)清香型白酒優(yōu)質(zhì)高效釀造具有重要的實(shí)用價(jià)值。在清香型小曲酒的釀造過(guò)程中，小曲為白酒釀造提供各種酶類，這些酶促使原料所含的淀粉、蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)的水解，保證了黃酒發(fā)酵的正常進(jìn)行；同時(shí)生長(zhǎng)在小曲表面的產(chǎn)酯酵母一方面利用原料進(jìn)行酒精代謝，另一方面一些產(chǎn)酯酵母分泌酯化酶使得酒體用有以乙酸乙酯為主的酯類物質(zhì)，賦予白酒酒體獨(dú)特的風(fēng)格，保證了白酒的品質(zhì)。相比于提高酒體的酒精度，提高酒體的香味物質(zhì)濃度顯得更加重要［6-9］。

產(chǎn)酯酵母被廣泛用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品（如白酒、黃酒、葡萄酒、醬油、食醋等）當(dāng)中。而在白酒行業(yè)，與大曲酒相比，清香型小曲原酒中的酯含量較低，具有較大的提升空間。傳統(tǒng)工藝下生產(chǎn)的小曲就存在著品質(zhì)不穩(wěn)定及酒體酯類物質(zhì)含量低等問(wèn)題，而盲目的改動(dòng)生產(chǎn)工藝會(huì)增大生產(chǎn)成本，為企業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)壓力。本研究以觀音土曲中的一株產(chǎn)酯酵母Y2為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化提高其分泌胞外酯化酶的能力。這種方法不僅簡(jiǎn)單實(shí)用，而且對(duì)實(shí)際清香型小曲酒生產(chǎn)具有極強(qiáng)的指導(dǎo)意義，對(duì)小曲白酒傳統(tǒng)技術(shù)的改造和提升都有著積極的現(xiàn)實(shí)意義［10-15］。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

酵母菌Y2：湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，115℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸膏1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.1 g，KH2PO40.1 g，MgSO47H2O 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，115℃滅菌20 min。

酚酞指示劑、濃硫酸、氫氧化鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母浸膏、蛋白胨、葡萄糖、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

AR3130電子分析天平、FE20型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；T500普通工業(yè)天平：常熟市雙杰測(cè)試公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；ZWY-2102C雙層恒溫?fù)u床、ZXFD-B5250鼓風(fēng)干燥箱：上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-75KB高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3方法

1.3.1胞外粗酶液制備

（1）將試管斜面保藏的酵母菌Y2用10 mL無(wú)菌水溶解后，倒入盛有100mLPDA培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30℃、180 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)3 d，制成液態(tài)種子液，備用。

（2）按試驗(yàn)設(shè)計(jì)吸取一定量酵母菌Y2種子液，倒入裝液量為100 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，并按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)一段時(shí)間，離心取上清液（10 000 r/min、5 min），微膜過(guò)濾得胞外粗酶液，4℃條件下保存待用。

1.3.2酵母產(chǎn)脂能力測(cè)定

（1）酯化反應(yīng)

準(zhǔn)確吸取1 mL乙酸于100 mL容量瓶中，再取20 mL無(wú)水乙醇，再加20 mL微膜過(guò)濾后的粗酶液，加蒸餾水至刻度線，同時(shí)做空白對(duì)照，于35℃條件下酯化5 d，待測(cè)備用。

（2）總酯含量測(cè)定

將酯化完成的待測(cè)液置入500 mL具支口的平底蒸餾燒瓶，添加100 mL蒸餾水，加熱蒸餾提取，截取100 mL前餾出液，待測(cè)。

總酯含量測(cè)定采用皂化中和滴定法：準(zhǔn)確吸取上述餾出液50.0 mL于300 mL回流瓶中，加酚酞指示劑2滴，以0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至粉紅色，30 s不褪色，即為其終點(diǎn)，記錄消耗體積作為總酸含量計(jì)算。再準(zhǔn)確加入0.1 mol/L NaOH溶液25.0 mL，搖勻，裝上回流冷凝管，于沸水浴中回流30 min（冷凝回流滴下第一滴開始計(jì)時(shí)），取下冷卻至室溫。然后，用0.1 mol/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色剛好消失，30 s保持不變色，即為滴定終點(diǎn)，記錄消耗的0.1 mol/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積。以總酯含量反映菌株總酯含量，總酯含量計(jì)算公式如下：

式中：X為發(fā)酵液樣品中總酯含量，g/L；C為氧氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度，mol/L；V為皂化時(shí)，加入0.1mol/L氧氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C1為硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度，mol/L；V1為測(cè)定時(shí)，滴定消耗0.1 mol/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；50為取樣體積，mL；0.088為與1.00 mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（C=1.000 mol/L）相當(dāng)?shù)囊宜嵋阴サ馁|(zhì)量，g。

1.3.3產(chǎn)酯發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值分別為3、4、5、6、7，發(fā)酵培養(yǎng)溫度分別為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間分別為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，菌種接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%，考察培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間及菌種接種量對(duì)產(chǎn)酯酵母菌Y2總酯含量的影響。

1.3.4產(chǎn)酯發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，菌種接種量（A）、培養(yǎng)基初始pH（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為影響因素，以產(chǎn)酯酵母總酯含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1　產(chǎn)酯發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for esterproducing fermentation conditions optimization

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)酯發(fā)酵培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1菌種接種量對(duì)產(chǎn)酯酵母總酯含量的影響

圖1　接種量對(duì)酵母Y2產(chǎn)酯力的影響Fig.1 Effect of inoculum on ester-producing ability of yeast Y2

由圖1可知，菌種接種量不同，酵母總酯含量也所有不同，當(dāng)菌種接種量為4%左右時(shí)酵母總酯含量較高，測(cè)得總酯含量為1.02 g/L，在接種量為2%～4%時(shí)，酵母總酯含量隨著接種量的增加而增大；在接種量為4%時(shí)，總酯含量最高；而當(dāng)接種量＞4%時(shí)，酵母總酯含量又會(huì)緩慢降低?？赡苡捎谠谝欢ㄉL(zhǎng)環(huán)境中，菌種數(shù)量越多，所產(chǎn)總酯含量也越大，而當(dāng)接種量增加時(shí)，菌種之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)，進(jìn)而影響其總酯含量。因此，接種量4%為宜。

2.1.2培養(yǎng)基初始pH對(duì)酯化酵母總酯含量的影響

圖2　初始pH對(duì)酵母Y2產(chǎn)酯力的影響Fig.2 Effect of initial pH on ester-producing ability of yeast Y2

由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值在3～7范圍內(nèi)時(shí)，酵母的總酯含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH值為3～5時(shí)，酵母的總酯含量隨著pH的升高而增加；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為5左右時(shí)，該菌株總酯含量達(dá)到最高，測(cè)定得總酯含量為1.01 g/L；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值＞5之后，菌株總酯含量有所下降。因此，選擇培養(yǎng)基最佳初始pH值為5。

2.1.3發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酯酵母總酯含量的影響

圖3　發(fā)酵溫度對(duì)酵母Y2產(chǎn)酯力的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on ester-producing ability of yeast Y2

由圖3可知，發(fā)酵溫度在一定范圍內(nèi)，酵母的總酯含量先升高再降低。當(dāng)發(fā)酵溫度為26～28℃時(shí)，酵母的總酯含量隨溫度增高而增加；當(dāng)發(fā)酵溫度為28℃時(shí)，酵母的總酯含量達(dá)到最高，測(cè)定得總酯含量為1.12 g/L；當(dāng)發(fā)酵溫度＞28℃之后，酵母的總酯含量有所下降?？赡苁且环矫娈?dāng)發(fā)酵溫度升高時(shí)，微生物體內(nèi)的生化反應(yīng)和產(chǎn)酶速率都有所提升，所以總酯含量會(huì)有一定的提升；而另一方面，溫度超過(guò)微生物最適宜生長(zhǎng)的范圍，則會(huì)使微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酯都受到影響，從而總酯含量下降。因此，選擇28℃為最佳的發(fā)酵溫度。

2.1.4發(fā)酵時(shí)間對(duì)酯化酵母總酯含量的影響

圖4　發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母Y2產(chǎn)酯力的影響Fig.4 The effect of fermentation time on ester-producing ability of yeast Y2

由圖4可知，發(fā)酵時(shí)間在1～5 d時(shí)，酵母總酯含量也隨之增加。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間到達(dá)4 d時(shí)，酵母總酯含量達(dá)到相對(duì)最高，測(cè)定得總酯含量為1.21 g/L；發(fā)酵時(shí)間＞4 d之后，酵母總酯含量雖然有所增加，但極其平緩?？赡茈S著發(fā)酵時(shí)間的增加，產(chǎn)酯酵母快速的生長(zhǎng)繁殖并大量的分泌酯化酶，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)到4 d左右時(shí)，生長(zhǎng)最為旺盛，酵母總酯含量也相對(duì)最高，隨后繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗殆盡，菌株生長(zhǎng)減緩甚至凋亡，故基本喪失總酯含量。因此，發(fā)酵時(shí)間4 d較為適宜。

2.2產(chǎn)酯發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇菌種接種量（A）、培養(yǎng)基初始pH（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）4個(gè)因素，以產(chǎn)酯酵母總酯含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2　產(chǎn)酯發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for esterproducing fermentation conditions optimization

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，4個(gè)因素對(duì)產(chǎn)酯酵母總酯含量的影響由大到小依次為培養(yǎng)基初始pH＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞菌種接種量。由極差分析結(jié)果表明，酵母接種量、培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間最優(yōu)的水平組合為A2B2C3D2，即菌種添加量為4%、培養(yǎng)基初始pH為5、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時(shí)間為4 d。在此最佳發(fā)酵條件下，總酯含量為1.24 g/L。由表3可知，各因素對(duì)酯化酵母總酯含量的影響均不顯著（P＞0.05）。

3　結(jié)論

產(chǎn)酯酵母不僅能卓有成效的提高出酒率，且其分泌的酯化酶能促進(jìn)酯化反應(yīng)，使酒體協(xié)調(diào)，進(jìn)而突出了清香型白酒乙酸乙酯的主體香味，提高清香型白酒的品質(zhì)。以酯化酵母的總酯含量為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)得到最佳發(fā)酵條件為接種量4%、培養(yǎng)基初始pH值為5、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間4 d。在此最佳條件下，產(chǎn)酯酵母Y2具有最高的總酯含量1.24 g/L。

［1］王曉丹，班世棟，胥思霞，等.濃香型大曲中酶系與白酒品質(zhì)關(guān)系研究［J］.中國(guó)釀造，2014，33（1）：44-47.

［2］張中義，暢曉霞，鐘其頂.酒曲酶系、菌系特征及釀造過(guò)程中微生物動(dòng)態(tài)變化［J］.釀酒，2008（5）：24-29.

［3］羅惠波，黃治國(guó)，李浩，等.濃香型大曲原核微生物群落PCR-SSCP解析［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2009（9）：1363-1367.

［4］隋延鐸.產(chǎn)酯酵母在白酒生產(chǎn)過(guò)程中的應(yīng)用［J］.釀酒，2004，31（3）：16-17.

［5］陸振群，薛正蓮.紫外誘變選育高產(chǎn)酯酵母［J］.中國(guó)釀造，2012，31（5）：111-113.

［6］徐柏田，吳生文，林培.大曲不同尺寸對(duì)特香型大曲儲(chǔ)存期間相關(guān)酶活影響的研究［J］.釀酒，2015，42（6）：38-40.

［7］董士偉，吳興權(quán)，王德良，等.豉香型白酒產(chǎn)酯酵母的篩選及應(yīng)用［J］.中國(guó)釀造，2012，31（2）：125-128.

［8］陳清嬋，簡(jiǎn)清梅，王勁松，等.從自然發(fā)酵小麥醬中篩選曲霉及制曲工藝研究［J］.中國(guó)釀造，2015，34（4）：86-89.

［9］胡家俊，李銳利，陳茂彬，等.高產(chǎn)乙酸乙酯酵母的菌種選育［J］.食品與發(fā)酵科技，2010，46（6）：81-83.

［10］唐潔.清香型小曲酒微生物菌落結(jié)構(gòu)及功能的研究［D］.無(wú)錫：江南大學(xué)，2012.

［11］艾金忠，馬美榮，聶建光，等.高酯化酶活性紅曲霉及生香酵母在二鍋頭白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)釀造，2013，32（4）：37-38.

［12］王和才，李金生，錢菊根.中國(guó)釀酒小曲生產(chǎn)現(xiàn)狀的調(diào)查與分析［J］.中國(guó)釀造，2011，30（5）：13-15.

［13］姜濤，任國(guó)軍，楊玉珍，等.高酸高酯發(fā)酵液的制備［J］.釀酒，2015（4）：37-44.

［14］吳赫川，馬瑩瑩，楊建剛，等.川法小曲白酒發(fā)展現(xiàn)狀及其瓶頸問(wèn)題分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（33）：50-56.

［15］劉源才，郭圣祥，李銳利，等.高產(chǎn)乙酸乙酯酵母的產(chǎn)酯條件研究［J］.食品與發(fā)酵科技，2011，47（2）：22-24.

Optimization of fermentation conditions for producing ester of extracellular enzyme of yeast

WANG Pan，WEI Chengfeng，CAI Fengjiao，WANG Jiangbo*
（Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation，College of Biological Engineering and Food Science，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

With the yeast Y2 from the Guanyintu koji as the research object，the extracellular enzyme fermented by strain Y2 fermentation medium was applied in esterification reaction system for catalytic reaction.Using the ester-producing ability as evaluation index，the ester-producing fermentation conditions of the strain Y2 were optimized by single factor and orthogonal experiments.The results showed that in the conditions of yeast inoculum 4%，medium initial pH 5，fermentation temperature 30℃and time 4 d，the strain Y2 had the highest ester-producing ability（1.24 g/L）.

yeast；extracellular enzyme；ester-producing fermentation conditions；optimization

TS261

0254-5071（2016）09-0055-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.013

2016-04-30

湖北省科技支撐計(jì)劃（2013BBA010）

王攀（1992-），男，本科生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

汪江波（1962-），男，副教授，本科，研究方向?yàn)獒勗旒熬企w設(shè)計(jì)。