張花治，劉　瑩，李桂珍，金智生

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

紅芪多糖對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF和Ets-1表達(dá)的影響*

張花治，劉瑩，李桂珍，金智生

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

目的：觀察紅芪多糖(hedisari polysacchcaide，HPS)對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和E26轉(zhuǎn)錄因子-1(Ets-1)蛋白表達(dá)水平的影響，并探討其機(jī)制。方法：用60 μg/g一次性腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型。將糖尿病模型大鼠分為模型對(duì)照組、多貝斯組[90 mg/(kg·d)]和HPS高(200 μg/g)、中(100 μg/g )、低劑量(50 μg/g)組，另設(shè)正常對(duì)照組，每組10只。均灌胃給藥，1 d 1次，藥物組給予相應(yīng)藥物，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組給予等劑量生理鹽水，連續(xù)8周。8周后采用免疫組織化學(xué)法和qRT-PCR方法檢測(cè)Ets-1、VEGF的蛋白表達(dá)和mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組視網(wǎng)膜VEGF、Ets-1的蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，視網(wǎng)膜VEGF和Ets-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，HPS高、中、低劑量組和多貝斯組的VEGF和Ets-1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05), VEGF和Ets-1 mRNA相對(duì)表達(dá)含量也明顯降低(P<0.05)；HPS高劑量組最接近正常對(duì)照組。結(jié)論：HPS對(duì)DM大鼠視網(wǎng)膜有保護(hù)作用，推測(cè)其機(jī)制可能是通過(guò)降低視網(wǎng)膜中VEGF、Ets-1的含量來(lái)阻遏糖尿病性視網(wǎng)膜病變進(jìn)程中新生血管生成與增殖，且HPS高劑量組的效果最好。

糖尿病大鼠模型；紅芪多糖；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；E26轉(zhuǎn)錄因子-1；視網(wǎng)膜；動(dòng)物；大鼠

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常見(jiàn)、嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是全世界20～60歲人群中致盲的首要原因[1-2]。近年來(lái)，許多學(xué)者認(rèn)為DR主要病理過(guò)程為新生血管形成及增殖，而新生血管發(fā)生、發(fā)展與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 和E26轉(zhuǎn)錄因子-1(Ets-1)有著密切的關(guān)系[3-4]。Ets-1在血管生成中起著重要的調(diào)控作用，可通過(guò)誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)來(lái)調(diào)控血管發(fā)生過(guò)程，而VEGF可以反過(guò)來(lái)上調(diào)Ets-1的表達(dá)。這個(gè)正調(diào)控系統(tǒng)在血管發(fā)生中起了主要作用。前期研究[5-6]表明：紅芪多糖(hedisari polysacchcaide，HPS)能顯著改善糖尿病胰島素抵抗大鼠模型的相關(guān)指標(biāo)，并保護(hù)胰腺和腎臟組織。本研究采用qRT-PCR法和免疫組化法進(jìn)一步觀察HPS對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF及Ets-1表達(dá)的影響，探討HPS阻遏DR進(jìn)程中新生血管生成、增殖的可能性以及其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物

雄性SPF級(jí)Wistar大鼠60只, 體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001。

1.2藥品、試劑與儀器

紅芪多糖[7]由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院按照文獻(xiàn)方法[8]制備，純度 70%；多貝斯，西安利君制藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號(hào)1305066-1。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)S0130-1G； Ets-1鼠抗人多克隆抗體，Lab Vision公司產(chǎn)品，批號(hào)DS-2562-GO；兔抗人VEGF多克隆抗體，Abcam公司產(chǎn)品，批號(hào) ab411545；DAB顯色試劑盒(批號(hào)K145615B)和免疫組化試劑盒(批號(hào)13155A11)，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；總 RNA提取試劑盒II，OMEGA公司產(chǎn)品，批號(hào)R6945 ；TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒(批號(hào)RT120430)、2×Taq PCR MasterMix(批號(hào)KT201-05)，為天根生化科技有限公司產(chǎn)品。穩(wěn)豪倍優(yōu) One Touch血糖測(cè)定儀，美國(guó)強(qiáng)生Lifescan公司產(chǎn)品；OSE-Y10微量電動(dòng)組織勻漿器，Tiangen 公司產(chǎn)品；CT14RD臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司產(chǎn)品；D1008型掌上離心機(jī)，美國(guó) SCILOGEX 公司產(chǎn)品；Q5000型超微量紫外分析儀，美國(guó) Quawell 公司產(chǎn)品；7500型RT-PCR 熱循環(huán)儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.3模型的建立、分組與給藥

建模前對(duì)大鼠進(jìn)行全身及眼部檢查以排除原發(fā)性疾病。隨機(jī)選取50只大鼠禁食12 h，一次性腹腔注射STZ(60 μg/g ，溶于新配制的0.1 mol/L、pH值4.5的檸檬酸鈉緩沖液中)，72 h后尾靜脈取血測(cè)血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol/L以上、尿量和飲水明顯增多者為糖尿病模型誘導(dǎo)成功。另外10只腹腔注入等量檸檬酸鈉緩沖液，72 h后測(cè)量空腹血糖均<5.6 mmol/L，設(shè)為正常對(duì)照組。將造模成功的50只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組、多貝斯組和HPS高、中、低劑量組，每組10只。多貝斯組每日灌胃多貝斯 90 μg/g，HPS高、中、低劑量組分別灌胃HPS 200，100，50 μg/g，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃等體積的生理鹽水，1 d 1次，連續(xù)8周。各組大鼠均給標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，定期測(cè)血糖、體質(zhì)量。

1.4檢測(cè)指標(biāo)

采用免疫組織化學(xué)法和qRT-PCR方法檢測(cè)VEGF、Ets-1的蛋白表達(dá)和mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)灌胃8周后，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)100 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，斷頸處死，摘取眼球；右眼球去除眼前節(jié)，剝離視網(wǎng)膜組織，液氮速凍，置于EP管中，于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?；左眼置?0 g/L多聚甲醛(4 ℃，24 h)固定。其中每組的5只眼球切除眼前節(jié)并剝離視網(wǎng)膜后再放入固定液中固定(用于檢測(cè)VEGF)；另外5只眼球直接放入固定液中固定，48 h后將整個(gè)眼球的部分切除眼前節(jié)(用于檢測(cè)Ets-1)，然后與剝離的視網(wǎng)膜一起進(jìn)行梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋。最后將平行于視神經(jīng)矢狀軸且以其為平面的視網(wǎng)膜進(jìn)行3 μm厚連續(xù)切片，每只眼球選取10個(gè)面(去掉有視神經(jīng)斷面的切面)，貼于涂有多聚賴(lài)氨酸的載玻片，行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.4.1VEGF和Ets-1蛋白表達(dá)的檢測(cè)

提取視網(wǎng)膜總RNA及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) Trizol一步法提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總RNA 3 μg，OligodT 1 μL，dNTP 1 μL，5×Buffer 4 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，加入經(jīng)DEPC處理的無(wú)菌水至20 μL。反應(yīng)條件：45 ℃反應(yīng)1 h，95 ℃ 5 min終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。qRT-PCR反應(yīng)：從GenBank獲得目的基因mRNA的全長(zhǎng)序列，利用引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物序列。經(jīng)過(guò)Blast分析，引物序列具有特異性。以β-actin為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行qPCR反應(yīng)引物序列。β-actin：上游引物5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。VEGF：上游引物5′-CTGTACCTCCACCATGCCAAG-3′ ，下游引物5′-ACAAGGCTCACAGT-3′。Ets-1：上游引物5′-GGGGCCAGGACTCTTTTGAG-3′，下游引物5′-TTGAATTCCCAGCCGTCTCC-3′。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上游引物(20 pmol/μL)0.5 μL，下游引物(20 pmol/μL)0.5 μL，2×SYBR Green 1 μL，2×mix 12.5 μL。加無(wú)菌水至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，退火溫度30 s(β-actin 54 ℃、VEGF 55 ℃，Ets-1 55 ℃)，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，得到每份樣品中VEGF進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)達(dá)到閾值時(shí)的Ct值。按目前通用的方法是2-△△CT計(jì)算各組間目標(biāo)基因的表達(dá)量的差別，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次，取平均值為CT值。以模型組目標(biāo)基因的表達(dá)量為1，2-△△CT值即為處理后目的基因表達(dá)較處理前的倍數(shù)。

1.4.2VEGF和Ets-1蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)

按照兔抗人VEGF和鼠抗人Ets-1多克隆抗體免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色試劑盒操作說(shuō)明對(duì)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。每個(gè)組織塊均取3 μm 厚的切片用于免疫組織化學(xué)染色，梯度酒精水化，體積分?jǐn)?shù)30 mL/L的H2O2去離子水孵育，微波(95 ℃，3 min)抗原修復(fù)。正常山羊血清封閉，依次加入一抗、生物素化二抗，SP復(fù)合物，DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。各組大鼠隨機(jī)選取4張切片，每張切片在400倍鏡下隨機(jī)采集陽(yáng)性染色最強(qiáng)的5個(gè)視野，輸入計(jì)算機(jī)后運(yùn)用 Image-Pro-Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行系統(tǒng)測(cè)定視網(wǎng)膜 VEGF和Ets-1的免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性信號(hào)的光密度值，取平均值(平均光密度OD值)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和 Ets-1 mRNA相對(duì)表達(dá)含量對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組的VEGF和Ets-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，HPS各劑量組及多貝斯組的VEGF和Ets-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量有不同程度降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中HPS高劑量組VEGF和Ets-1 mRNA表達(dá)接近正常對(duì)照組。見(jiàn)表1。

組 別劑量/(g·kg-1)VEGFmRNAEts-1mRNA正常對(duì)照組—0.2938±0.12*0.1471±0.09*模型對(duì)照組—11多貝斯組0.090.3499±0.18**0.2160±0.13*HPS低劑量組0.050.7067±0.08**##0.6109±0.12**##HPS中劑量組0.100.5856±0.11**#0.5278±0.15**#HPS高劑量組0.200.3825±0.14**0.2396±0.13*F值25.55339.919P值0.0000.000

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05，**P<0.01；與HPS高劑量組對(duì)比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2各組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和Ets-1蛋白表達(dá)的平均光密度值對(duì)比

免疫組織化學(xué)結(jié)果中VEGF和Ets-1免疫陽(yáng)性反應(yīng)呈棕色，定位于胞漿內(nèi)。正常對(duì)照組視網(wǎng)膜VEGF和Ets-1免疫陽(yáng)性反應(yīng)主要見(jiàn)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)叢狀層細(xì)胞，內(nèi)核層少有表達(dá)。HPS各治療組、多貝斯組和模型對(duì)照組陽(yáng)性反應(yīng)增強(qiáng)，大鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞的胞漿內(nèi)均可見(jiàn)棕色的陽(yáng)性顆粒，陽(yáng)性部位主要位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層及內(nèi)外叢狀層。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組對(duì)比，VEGF和Ets-1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；多貝斯組，HPS高、中、低劑量組 VEGF蛋白表達(dá)水平明顯低于模型對(duì)照組 (P<0.05)；HPS高劑量組與多貝斯組，HPS中、低劑量組對(duì)比，VEGF和Ets-1蛋白表達(dá)水平明顯降低 (P<0.05)。見(jiàn)表2。

組 別劑量/(g·kg-1)VEGFEts-1正常對(duì)照組—9.31±3.60**0.61±0.10**模型對(duì)照組—17.24±4.206.84±1.20多貝斯對(duì)照組0.0912.35±8.24**#2.35±1.24**#HPS低劑量組0.0515.15±7.84*##3.15±1.84**##HPS中劑量組0.1013.45±4.25**#2.15±1.25**#HPS高劑量組0.2010.68±5.61**1.02±0.61**F值2.49738.048P值0.0420.000

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05，**P<0.01；與HPS高劑量組對(duì)比，#P<0.05，##P<0.01。

3　討　論

缺氧和高血糖可導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織供血不足，機(jī)體會(huì)通過(guò)增加 VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)新生血管形成來(lái)改善供血、供氧不足；但新生血管的形成可加速DR病程發(fā)展[9]。VEGF 不僅能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，還可以增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，使大量血漿蛋白溢出，進(jìn)一步為新血管的生成提供良好的基質(zhì)[10]。Caldwell[11]認(rèn)為高血糖介導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)VEGF的表達(dá)和活性的影響，導(dǎo)致一系列細(xì)胞和分子改變，最終促成了新生血管和增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變的形成；臨床研究也證實(shí)DR患者的玻璃體液體中VEGF的含量明顯上升，并且與視網(wǎng)膜新生血管化的進(jìn)程一致[12]。Ets-1表達(dá)參與了血管發(fā)生和損傷修復(fù)過(guò)程，血管發(fā)生需要Ets-1的參與。體外實(shí)驗(yàn)證明在培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，VEGF可以誘導(dǎo)Ets-1表達(dá)，VEGF結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體，形成異源二聚體介導(dǎo)這一作用[13]。Ets-1在血管生成中起著重要的調(diào)控作用，可通過(guò)誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)來(lái)調(diào)控血管發(fā)生過(guò)程，而VEGF可以反過(guò)來(lái)上調(diào)Ets-1的表達(dá)，這個(gè)正調(diào)控系統(tǒng)在血管發(fā)生中起了重要作用；因此，抑制VEGF及Ets-1的表達(dá)為目前治療DR的靶方向。

研究顯示：黃芪具有益氣活血、養(yǎng)陰散瘀之功效，可以改善視網(wǎng)膜微循環(huán)，提高機(jī)體免疫力，抑制視網(wǎng)膜周細(xì)胞的凋亡[14]；而黃芪多糖具有調(diào)節(jié)免疫功能和抗氧化的作用，能減少自由基的生成，增加自由基的清除，還可明顯地?cái)U(kuò)張血管，降低血黏度，促進(jìn)血液循環(huán)，改善微循環(huán)，能夠降低糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞Kir2.1蛋白表達(dá)下降，從而起到減少DR發(fā)病率的作用[15]。甘肅地道藥材紅芪是豆科植物多巖黃芪的干燥根，與黃芪同科異屬，與黃芪性味、歸經(jīng)、功效、主治基本相同，藥理作用相似。前期研究表明：HPS對(duì)糖尿病胰島素抵抗大鼠模型血糖、血脂、TNF-α、IL-6等指標(biāo)均有改善作用，并可以保護(hù)胰腺和腎臟組織[5-6]。本研究進(jìn)一步觀察了HPS對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF及Ets-1表達(dá)的影響。各組大鼠灌胃8周后對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行qRT-PCR法檢測(cè)和采用計(jì)算機(jī)運(yùn)用圖像分析軟件測(cè)定視網(wǎng)膜 VEGF和Ets-1的免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性信號(hào)的光密度值發(fā)現(xiàn)：模型對(duì)照組與正常對(duì)照組對(duì)比，視網(wǎng)膜VEGF和Ets-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；經(jīng)多貝斯和HPS干預(yù)后，多貝斯組和HPS高、中、低劑量組的VEGF和Ets-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白表達(dá)明顯較模型對(duì)照組低(P<0.05或P<0.01)；HPS高劑量組最接近正常對(duì)照組。結(jié)果表明：HPS能降低VEGF、Ets-1在糖尿病視網(wǎng)膜中的表達(dá)，且HPS高劑量效果最理想。據(jù)此推測(cè)黃芪多糖可能是通過(guò)降低視網(wǎng)膜中VEGF、Ets-1的含量來(lái)阻遏DR進(jìn)程中新生血管生成與增殖，從而緩解DR發(fā)展進(jìn)程；因此其在預(yù)防和治療DR方面有一定的應(yīng)用前景。當(dāng)然，對(duì)于將黃芪多糖運(yùn)用于預(yù)防和治療DR方面還需大量的實(shí)驗(yàn)及臨床隨機(jī)對(duì)照研究，這也是課題組今后進(jìn)一步研究的目標(biāo)和方向。

此外，筆者在進(jìn)行免疫組織化學(xué)法實(shí)驗(yàn)時(shí)，在眼球2種處理方法的比較中發(fā)現(xiàn)剝離的視網(wǎng)膜在浸蠟、包埋和切片時(shí)難度都較大，而且圖片上色素上皮層缺失；因此，建議今后在做眼球的免疫組織化學(xué)法時(shí)不要?jiǎng)冸x視網(wǎng)膜。

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(編輯陶珠)

1001-6910(2016)02-0060-04

R587.1

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.02.30

金智生，教授，博士生導(dǎo)師，jzsgszy@ 126.com

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中青年基金(BH2012-025)

2015-07-14；

2015-11-30