李曉東，趙 穎，徐宜宏，吳渺渺，姜玲玲，劉 瑜，金 雁

（沈陽出入境檢驗檢疫局，遼寧 沈陽 110016）

QuEChERS試劑盒—超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測畜禽肉中18種喹諾酮類獸藥殘留研究

李曉東，趙 穎，徐宜宏，吳渺渺，姜玲玲，劉 瑜，金 雁

（沈陽出入境檢驗檢疫局，遼寧 沈陽 110016）

建立了一種同時測定畜禽肉中18種喹諾酮類獸藥殘留的QuEChERS試劑盒—超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)1%乙酸乙腈水溶液（20∶80，V/V）振蕩離心后，取上清液于凈化管中凈化，再取上清液濃縮至干，甲醇水溶液（甲醇∶水=1∶4）溶解殘渣，過膜，待測。采用C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，以0.2%甲酸水溶液和0.2%甲酸乙腈溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，UPLC-MS/MS法同時定性、定量測定畜禽肉中18種喹諾酮類獸藥殘留。結(jié)果表明，18種喹諾酮類獸藥在0.5～80 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99；以5.0、10.0、50.0 μg/kg 3個濃度水平進(jìn)行添加回收實驗，18種喹諾酮類獸藥的平均回收率在60.5%～97.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～19.5%，該方法的檢出限為5.0 μg/kg。該方法重現(xiàn)性好、靈敏度高、分析時間短、確證能力強(qiáng)，適用于畜禽肉中18種喹諾酮類獸藥殘留的同時檢測。

畜禽肉；喹諾酮；QuEChERS試劑盒；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，以及全球生態(tài)環(huán)境不斷惡化引起的各種動物疾病的頻發(fā)，使得廣大養(yǎng)殖戶開始大量應(yīng)用藥物預(yù)防、治療疾病，然而，動物在使用藥物治療后，藥物的原型或其代謝產(chǎn)物可能蓄積、儲存在動物的細(xì)胞、組織或器官中，形成“獸藥殘留”。消費者在食用了含有獸藥殘留的肉、蛋等動物源性食品后，其體內(nèi)所殘留的藥物就會轉(zhuǎn)移到人體中，長期食用該類食品，會導(dǎo)致慢性中毒、胃腸道疾病、加重肝臟負(fù)擔(dān)等不良反應(yīng)，對人體健康極為不利［1-3］。

喹諾酮類獸藥作為一類廣譜、高效的人工合成抗菌劑被廣泛應(yīng)用，因此，建立一種快速、安全、可靠的喹諾酮類獸藥殘留量檢測方法已成為了發(fā)展趨勢和研究熱點，尤其對于樣品的前處理，已經(jīng)研究的方法有很多，如固相萃取法［4-7］、QuEChERS法［8-9］等。因此，筆者根據(jù)國內(nèi)外殘留限量要求，建立了畜禽肉中18種喹諾酮類獸藥殘留同時檢測的QuEChERS試劑盒—高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 實驗試劑：乙腈 （農(nóng)殘級，美國DiKMA公司）；甲醇（農(nóng)殘級，美國DiKMA公司）；甲酸（北京百靈威科技有限公司，純度>98.0%）；乙酸（分析純，國藥試劑）；超純水 （Milli-Q Water System純化制備）；QuEChERS試劑盒。

1.1.2 實驗儀器：ACQUITYTM超高效液相色譜儀（美國Waters公司），AB Sciex QTrap 6500四極桿—離子阱質(zhì)譜儀（美國AB公司），Millipore-Elix-QEQG超純水機(jī) （美國Millipore公司），CPA 225D，分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 樣品預(yù)處理

1.2.1 樣品提?。悍Q取雞肉糜樣品5.00 g（精確到0.01 g）放入50 mL萃取管中，加入20 mL 1%的乙酸乙腈水溶液（80%乙腈，20%水），渦旋振蕩3 min，5 000 r/min離心5 min。

1.2.2 樣品凈化：準(zhǔn)確移取5 mL上清液于凈化管中，渦旋混勻1 min，5 000 r/min離心3 min，取上清液，40 ℃濃縮至干，1 mL 甲醇水溶液（甲醇∶水=1∶4）溶解殘渣，過0.2 μm濾膜，待測。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件的選擇

1.3.1 液相色譜條件的選擇：色譜柱為Waters BEH C18，100 mm×2.1 mm（內(nèi)徑），1.7 μm；柱溫為 40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流動相A為0.2%甲酸水溶液；流動相B為0.2%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序見表1。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件的選擇：離子源為電噴霧離子源，掃描模式為正離子掃描，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），電噴霧電壓（IS）為 5 500 V，霧化氣壓力（GS1）為 50 psi，氣簾氣壓力（CUR）為 30 psi，輔助氣壓力（GS2）為 60 psi，離子源溫度（TEM）為550 ℃，去簇電壓（DP）為 80 V，入口電壓（EP）為10 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇 稱取2 g均質(zhì)后的雞肉糜，加入18種喹諾酮類獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成模擬加標(biāo)樣品，分別加入8 mL乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷，均質(zhì)提取1 min，離心，測定回收率，同時做空白對照，18種獸藥在不同提取溶劑下，回收率的大小差異顯著（見表2）。

表2 18種獸藥在不同提取溶劑下的回收率 %

乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷是實驗室常用極性化合物的提取溶劑，所考察的18種喹諾酮類獸藥均在以乙腈為提取溶劑時有較高的回收率，且乙腈有去蛋白的作用，故而提取液的澄清度也較好，有利于后續(xù)凈化步驟。且喹諾酮類獸藥在中性偏酸的環(huán)境中具有良好的穩(wěn)定性，因此在提取溶液中加入冰醋酸，有助于提高獸藥的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高獸藥的提取效率。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 經(jīng)過反復(fù)試驗、調(diào)試，得出18種喹諾酮類獸藥的最優(yōu)質(zhì)譜條件。各獸藥的檢測離子見表3。

3 方法學(xué)驗證

3.1 回收率及精密度 在豬肉、牛肉、雞肉中添加不同含量水平（5.0、10.0、50.0 μg/kg）的 18 種喹諾酮類獸藥混標(biāo)，制成模擬加標(biāo)樣品，按上述實驗方法操作，同時做空白對照。所得到的樣品中各待測獸藥的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4、表 5、表 6。

實驗結(jié)果表明，在所考察的豬肉、牛肉、雞肉中，18種喹諾酮類獸藥的回收率在60.5%～97.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～19.5%，待測獸藥均能得到較理想的回收率，該方法符合檢測方法對精密度的要求。

表3 待測獸藥的質(zhì)譜參數(shù)

3.2 線性關(guān)系和檢出限 用空白樣品溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，制備成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定色譜和質(zhì)譜條件下，用混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，在5.0～80 ng/mL范圍內(nèi)繪制6點標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r）見表7。向空白樣品中添加不同質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法進(jìn)行測定，得出18種喹諾酮類獸藥的檢出限均為5.0 g/kg。

4 結(jié)論

該實驗建立了畜禽肉中18種喹諾酮類獸藥殘留的樣品前處理和儀器定性定量方法。以1%乙酸乙腈水溶液提取，提取液經(jīng)QuEChERS試劑盒法凈化UPLC-MS/MS確證檢測。該方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性好、靈敏度高，完全滿足畜禽肉中18種喹諾酮類獸藥檢測需要，具有一定的創(chuàng)新性和可推廣應(yīng)用的價值。

［1］胡梁及，朱盛山，彭亮，等.水產(chǎn)養(yǎng)殖中藥物濫用的危害及問題分析［J］.水產(chǎn)學(xué)雜志，2015，28（2）：47-54.

［2］施杏芬，陸國林.獸用喹諾酮類藥物殘留的危害及對策［J］.中國動物檢疫，2008，25（9）：16-17.

［3］張彩云，劉小靜，宋瑞，等.動物性食品獸藥殘留的危害及其控制［J］.今日畜牧獸醫(yī)，2011（S1）：83-86.

［4］楊方，龐國芳，劉正才，等.液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中15種喹諾酮類藥物殘留量［J］.分析試驗室，2008，27（12）：27-33.

表4 豬肉中18種獸藥不同添加水平下的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

表5 牛肉中18種獸藥不同添加水平下的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

［5］楊衛(wèi)軍，李曼，曹秀梅，等.超高效液相色譜法檢測雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2016（4）：6-10.

［6］喬坤云，孫濤，劉圣紅，等.高效液相色譜熒光法檢測雞肉中 4 種氟喹諾酮藥物殘留［J］.分析儀器，2015（6）：43-46.

［7］郭偉，劉永，劉寧.超高效液相色譜—電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法同時分析雞肉中7種氟喹諾酮類藥物殘留［J］.色譜，2009，27（4）：406-411.

［8］楊金易，張燕，曾道平，等.基于QuEChERS前處理技術(shù)的水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物多殘留ELISA檢測方法的建立［J］.食品工業(yè)科技，2015（1）：292-298.

表6 雞肉中18種獸藥不同添加水平下的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

表7 18種獸藥的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）、檢出限

［9］曹慧，陳小珍，朱巖，等.QuEChERS-超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時測定乳制品中磺胺類和喹諾酮類抗生素殘留［J］.食品科技，2013，38（6）：323-329.

Simultaneous Determination of 18 Quinolone Residues in Livestock and Poultry Meat by QuEChERS Kit-UPLC/MS/MS

LI Xiao-dong，ZHAO Ying，XU Yi-hong，WU Miao-miao，JIANG Ling-ling，LIU Yu，JIN Yan
（Shenyang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenyang 110016，China）

A QuEChERS Kit-UPLC/MS/MS method for simultaneously determination of 18 quinolone residues in livestock and poultry meat was developed in this study.The samples were oscillated and centrifuged in a 1%aqueous solution of acetic acid and acetonitrile （20∶80,V/V）.The obtained supernatant was purified after transferring to purification pipe and was then concentrated to dry.The residues were dissolved in aqueous solution of methanol （methanol∶water=1 ∶4） and were then filtered.The C18chromatographic column （100 mm×2.1 mm,1.7 μm） was used to isolate,and the 0.2%aqueous solution of formic acid and acetonitrile solution containing 0.2%formic acid were used as mobile phase to gradient elute.The 18 quinolone residues in livestock and poultry meat were qualitatively and quantitatively determined by UPLC/MS/MS.A good linear relationship of the 18 quinolone in the range of 0.5-80 ng/mL was observed,and the correlation coefficient （r） was all above 0.99.Recovery test was performed with three concentration levels of 5.0,10.0,50.0 μg/kg.The average recovery of the 18 quinolone ranged from 60.5%to 97.0%,the relative standard deviation ranged from 2.1%to 19.5%,and the detection limit of the method was 5.0 μg/kg.The developed method with good reproducibility,high sensitivity,short analysis time and strong ability of confirmation was suitable for the simultaneous determination of 18 quinolone residues in livestock and poultry meat.

livestock and poultry meat；quinolone；QuEChERS kit；UPLC/MS/MS

S859.84

A文章順序編號：1672-5190（2016）12-0012-05

2016-11-22

項目來源：沈陽市科技局項目（F15-168-4-00）。

李曉東（1986—），男，工程師，主要從事農(nóng)獸藥殘留檢測工作。

（責(zé)任編輯：慕宗杰）