趙國榮*，張衎，何宜榮*，艾碧琛，肖碧躍，賀又舜，左亞杰，熊焰，陳蘭玲，尹周安

（1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，湖南長沙410208；2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530023；3.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

清熱解毒化濁片對ETM兔肝組織CD14及TNF-α、IL-1表達的影響

趙國榮1*，張衎2，何宜榮1*，艾碧琛1，肖碧躍1，賀又舜1，左亞杰3，熊焰1，陳蘭玲3，尹周安1

（1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，湖南長沙410208；2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530023；3.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

目的探討清熱解毒化濁片對內(nèi)毒素血癥（Endotoxemia，ETM）模型兔肝功能、肝組織CD14和血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）的影響。方法將21只新西蘭大耳白兔隨機分為正常組、模型組、清熱解毒化濁片組（清化組），每組7只。將模型組及清化組兔沿耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素（LPS，10μg/kg），于造模后2 h干預(yù)，灌胃后2 h心臟采血檢測家兔的肝功能、TNF-α和IL-α的變化，采肝臟組織檢測CD14及觀察肝臟病理形態(tài)。結(jié)果（1）與模型組比較，清化組ALT、AST上升（P＜0.05），肝組織CD14表達及血清TNF-α、IL-1下降（P＜0.05）；（2）模型組肝細胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，有炎性細胞浸潤，且出現(xiàn)空泡樣改變，清化組及正常組改變不明顯。結(jié)論清熱解毒化濁片能下調(diào)ETM模型兔CDl4、TNF-α和IL-1的表達，具有多靶點、多效應(yīng)的干預(yù)作用，推測其有阻斷早期LPS誘導(dǎo)信號通路的作用。

內(nèi)毒素血癥；清熱解毒化濁片；CD14；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-1；茵陳；黃芩；滑石

Effect of Qingre Jiedu Huazhuo Tablets on Expression of CD14 in Liver Tissue，TNF-αand IL-1 of ETM Rabbits

〔Abstract〕Objective To investigate the effect of Qingre Jiedu Huazhuo（QJH）tablets on the expression of CD14，TNF-αand IL-1 in liver tissue of ETM rabbits.M ethods The 21 New Zealand big-eared rabbits were random ly divided into normal group，model group，QJH tablets group，7 in each group.The ear edge of model group and QJH group was given intravenous injection of 10μg/kg endotoxin.After 2 hours of modeling，the rabbites were given intervention.Then，the liver function，TNF-αand IL-1 were tested.The CD14 in liver tissue was determined and the pathological morphology was observed.Results（1）Compared with the model group，the ALT and AST of QJH tablets group were increased（P＜0.05）.The CD14 expression in liver tissue and serum TNF-αand IL-1 were decreased（P＜0.05）.（2）The liver cell array structure of model group was disorder with inflammatory cells infiltration and a cavity change，but the changes in QJH tablets group and blank group were not obvious.Conclusion Qingre Jiedu Huazhuo tablets with multi-point target and munti-effects can decrease CDl4，TNF-αand IL-1 in ETN rabbits，suggesting the tablets have an effect on the signaling pathway induced by LPS in the early days.

〔Keywords〕endotoxemia；Qingre Jiedu Huazhuo tablets；CD14；TNF-a；IL-1；oriental wormwood；radix scutellariae；talc

研究團隊前期對清熱解毒化濁片（簡稱化濁片）進行了大量臨床及實驗研究，證實其不僅可用于治療病毒性肝炎肝損傷，還可清除內(nèi)毒素［1-3］。本實驗以內(nèi)毒素血癥（Endotoxemia，ETM）兔為研究對象，觀察清熱解毒化濁片對家兔肝功能、CD14、TNF-α、IL-1及肝臟病理形態(tài)的影響，以期為該藥臨床運用提供新的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物普通級新西蘭大耳白兔，雌雄不限，體質(zhì)量1.8-2.5 kg，由長沙市東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部提供。動物許可證號：SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2藥物清熱解毒化濁片（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室提供，批號：20100908），規(guī)格為0.3 g/片，成人一般劑量為10片/次，3次/d，一天劑量為9 g。根據(jù)《中醫(yī)科研設(shè)計與統(tǒng)計學》［4］將清熱解毒化濁片配制成濃度為0.04 g/mL的藥液（下稱藥液）。兔灌胃量為0.4 g/kg。藥液放4℃冰箱保存。

1.1.3主要試劑與儀器（1）試劑大腸桿菌內(nèi)毒素（Esch erichia coil 0111∶B4，美國Sigma-Aldrich公司，批號：118K4052）、鰲試劑盒（美國ACC北京科德角生物技術(shù)有限公司代理，批號：249018）、兔Anti-NF-kBp65（批號：306428）、SABC免疫組化染色試劑盒（兔IgG批號：SA1022）、DAB顯色劑試劑盒（批號：AR1022）、抗體稀釋液（批號：C-0007）均購自武漢博士德生物工程有限公司。（2）儀器MK3酶標儀，芬蘭LABSYSTBA集團；TDZ5-4.0多管架自動平衡離心機，長沙天創(chuàng)儀器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1分組及造模［5］將21只兔隨機分為3組，即正常組、模型組、清熱解毒化濁片組（簡稱清化組），每組7只。家兔正常飼養(yǎng)3 d，每天測量肛溫3次，取平均值為基礎(chǔ)體溫，并記錄各組家兔的一般情況［5］，第3天開始造模，將模型組、清化組按10μg/kg經(jīng)耳緣靜脈注射內(nèi)毒素，正常組注入同體積無菌生理鹽水。

1.2.2藥物干預(yù)及標本采集根據(jù)前期實驗［6-7］，造模后至2 h每20分鐘測量體溫1次，并記錄開始發(fā)熱時間，兔在2 h內(nèi)，體溫升高，心率、呼吸增快，聳毛、發(fā)抖、噴嚏。造模2 h時，清化組用清熱解毒化濁片藥液10 mL/kg灌胃1次；正常組與模型組分別以10 mL/kg溫開水灌胃1次。灌胃后同樣每20分鐘測1次體溫，并記錄各組兔癥狀、體征。

灌胃后2 h，清化組體溫下降，心率、呼吸恢復(fù)正常，聳毛、發(fā)抖、噴嚏等消失，但與之相對應(yīng)的模型組體溫仍在升高，心率、呼吸恢復(fù)加快，聳毛、發(fā)抖、噴嚏等癥仍存，此時對正常組、模型組、清化組兔進行心臟采血，每只兔分別用肝素鈉抗凝管兩支各取血3 mL用于檢測肝功能、TNF-α、IL-1。取血完畢后，從耳緣靜脈注入烏拉坦3 mL/kg，在麻醉狀態(tài)下取肝臟右下葉組織，備做病理形態(tài)、免疫組化檢測CD14。

1.3檢測指標及方法

1.3.1肝功能測定由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科測定。

1.3.2TNF-α、IL-1檢測將各組血清標本，按照試劑盒說明書進行TNF-α、IL-1檢測。

1.3.3免疫組化檢測CD14將切片脫蠟至水。按照盒試劑盒說明書進行相關(guān)操作。最后蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化后自來水沖洗10-15 min，脫水、透明、封片、400倍光學顯微鏡下觀察拍片。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析得出CD14的平均光密度值。

1.3.4肝細胞HE染色取肝臟右葉組織，以4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋切片，然后使用平推式切片機連續(xù)切片，切片載入載玻片后予行HE染色，染色時間為10 min左右，切片厚度約5μm，400倍光學顯微鏡下隨機選取3個視野觀察拍片。

1.4統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。全部計量資料以“±s”表示，首先進行正態(tài)性、方差齊性檢驗。滿足正態(tài)性者，不同組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并進行組間的多重比較；方差齊時選擇LSD法，方差不齊時選擇Dunnett T3法；不滿足正態(tài)性時選擇秩和檢驗。以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1清熱解毒化濁片對家兔內(nèi)毒素血癥肝功能的影響

造模后，模型組與正常組比較，模型組ALT、AST均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療后，清化組與模型組比較，清化組ALT、AST均上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1　清熱解毒化濁片對肝功能的影響（±s，n=7，U/L）

表1　清熱解毒化濁片對肝功能的影響（±s，n=7，U/L）

注：與正常組比，△P＜0.05；與模型組比，▽P＜0.05。

組別ALT AST正常組55.2±3.49 50.3±4.25模型組49.6±4.83△45.2±3.82△清化組56.7±1.2▽49.6±2.1▽

2.2清熱解毒化濁片對家兔內(nèi)毒素血癥肝臟組織CD14及血清細胞因子的影響

造模后，模型組與正常組比較，模型組肝臟組織CD14、血清TNF-α、IL-1水平均上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經(jīng)過治療后，清化組與模型組比較，清化組肝臟組織CD14、血清TNF-α、IL-1水平均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

從免疫組化圖中可見，正常組肝臟沒有CD14陽性表達（圖1-A），模型組周圍肝血竇及肝細胞有CD14陽性大量表達（圖1-B）；清化組有少量CD14陽性表達（圖1-C）。

表2　清熱解毒化濁片對肝臟組織CD14以及血清TNF-α、IL-1的影響（±s，n=7）

表2　清熱解毒化濁片對肝臟組織CD14以及血清TNF-α、IL-1的影響（±s，n=7）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別CD14 TNF-α（ng/L）IL-1（ng/L）正常組1.17±0.29 56.7±8.4 4.40±0.96模型組2.56±0.22△75.8±16.3△9.94±2.40△清化組1.28±0.41▲58.7±7.0▲5.30±1.01▲

圖1　肝臟組織CD14表達光鏡圖（免疫組化×400）

2.3清熱解毒化濁片對家兔ETM肝損傷肝臟病理形態(tài)學的影響

正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常，未見變性、壞死炎細胞浸潤（圖2-A）；模型組肝細胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，有炎性細胞浸潤，且肝細胞出現(xiàn)空泡樣改變（圖2-B）；清化組炎細胞浸潤、肝細胞腫大及空泡樣變性不明顯（圖2-C）。

圖2　肝臟病理形態(tài)學光鏡圖（HE×400）

3　結(jié)論

LPS進入機體刺激并促發(fā)細胞上TLR4信號通路CDl4等表達引起細胞內(nèi)信號傳遞，編碼一系列炎癥因子，釋放TNF-α、IL-1等炎癥介質(zhì)。本實驗中清化組的CDl4、TNF-α、IL-1較模型對照組明顯降低，且有顯著性差異，與正常組比較無顯著性差異，說明清熱解毒化濁片可以下調(diào)CDl4的表達，減少LPS的識別及跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使促炎因子TNF-α的表達減少，可避免后續(xù)細胞因子的瀑布式釋放及抗炎/促炎失衡。清化組下游促炎因子IL-1的合成減少，也證實清熱解毒化濁片對信號通路中CDl4、TNF-α、IL-1起到調(diào)控作用。

肝臟作為人體內(nèi)唯一代謝內(nèi)毒素的器官，內(nèi)毒素及各種炎癥介質(zhì)直接或間接造成肝功能損傷，而出現(xiàn)肝功能改變，但因為此實驗為急性試驗，攻毒時間不長，故肝功能損傷不是很重。但從肝臟病理形態(tài)上發(fā)現(xiàn)其損傷還是較重，病理形態(tài)圖片顯示：模型組肝細胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，有炎性細胞浸潤，且肝細胞出現(xiàn)空泡樣改變。經(jīng)過清熱解毒化濁片治療后清化組炎細胞浸潤、肝細胞腫大及空泡樣變性不明顯。實驗結(jié)果還顯示，在內(nèi)毒素血癥早期使用清熱解毒化濁片干預(yù)后，內(nèi)毒素水平下降，肝細胞ALT、AST升高恢復(fù)活性，血漿內(nèi)毒素及肝臟組織結(jié)構(gòu)受損呈平行關(guān)系。由于清熱解毒化濁片可使CDl4表達下調(diào)，從而減少前炎癥細胞因子生成與釋放，內(nèi)皮細胞激活受限，致使白細胞浸潤和微血栓不能形成及炎癥反應(yīng)進一步放大被阻斷；清化組TNF-α、IL-1下降，ALT、AST活性恢復(fù)升高。因此清熱解毒化濁片治療內(nèi)毒素血癥肝損傷調(diào)控TLR4信號通路是多靶點的整體調(diào)節(jié)。

在前期的實驗研究中，無論是急性、慢性肝病，基本病機為“濕、熱、毒、濁”［2］。因此有人研究發(fā)現(xiàn)溫病衛(wèi)、氣、營、血階段中均存在內(nèi)毒素血癥［7］，并且與溫病衛(wèi)氣營血辨證具有相關(guān)性［6］，故本研究攻毒后2 h相當于衛(wèi)分證階段，在該時期初期使用清熱解毒，化濁利濕之法，以達到驅(qū)邪外出并促進機體自身免疫功能恢復(fù)的目的。清熱解毒化濁片中有茵陳、滑石、黃芩三藥清熱利濕；石菖蒲、藿香辟穢和中，宣濕濁之壅滯；白蔻仁芳香悅脾，令氣暢而濕行；木通清利濕熱，導(dǎo)濕熱從小便而去；連翹、貝母清熱解毒、散結(jié)消腫。諸藥合用，重在清熱利濕，使?jié)裥暗萌?，熱毒得清，氣機調(diào)暢。

［1］趙國榮，曹軍連，謝靜，等.不同劑量清熱解毒化濁片對大鼠免疫性肝損傷治療作用的對比研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2004，l4（1）：23-25.

［2］謝靜，趙國榮，熊焰，等.清熱解毒化濁片對慢性病毒性肝炎濕熱內(nèi)蘊證、肝郁脾虛證療效的研究［J］.湖南中醫(yī)學院學報，2003，23（6）：33-35.

［3］肖碧躍，越國榮，艾碧琛，等.清熱解毒化濁片對病毒性肝炎肝損害療效觀察［J］.湖南中醫(yī)藥大學學報，2010，30（7）：49-50.

［4］賀石林，王建，王凈凈.中醫(yī)科研設(shè)計與統(tǒng)計學［M］.長沙：湖南科學技術(shù)出版社，2003：20-21.

［5］艾碧琛，趙國榮，賀又舜，等.探討內(nèi)毒素血癥兔復(fù)制衛(wèi)氣營血可能性的實驗體會［J］.中醫(yī)藥信息，2011，28（5）：23-25.

［6］趙國榮，艾碧琛，賀又舜，等.內(nèi)毒素血癥兔癥狀、體征動態(tài)變化與衛(wèi)氣營血傳變的相關(guān)性［J］.中醫(yī)雜志，2011，52（15）：1305-1307.

［7］楊愛東，曾蘭，屠燕捷，等.不同治法對內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織細胞因子的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2007，34（3）：358-360.

（本文編輯楊瑛）

ZHAO Guorong1*，ZHANG Kan2，HE Yirong1*，AI bichen1，XIAO Biyue1，HE Youshun1，ZUO Yajie3，XIONG Yan1，Chen Lanling3，YIN Zhouan1
（1.College of TCM，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2．The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530023，China；3.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.09.006

2015-12-06

湖南省教育廳重點項目資助（12A101）；湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床基礎(chǔ)重點學科資助；湖南中醫(yī)藥大學校級青年基金（校行科字［2013］4號）資助。

*趙國榮，女，二級教授，主任醫(yī)師，E-mail：zhaoguorong1116@sina.com；何宜榮，男，講師，主治醫(yī)師，E-mail：260124907@qq.com。