唐富波，鄭金光，張文靜，胡　森，白曉東

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丁酸鈉對嚴重燙傷大鼠小腸黏膜血流量和微血管通透性的影響

唐富波1,2，鄭金光1，張文靜3，胡森4，白曉東1

目的探討丁酸鈉(sodium butyrate，BTR)對嚴重燙傷大鼠小腸黏膜血流量和微血管通透性的影響。方法雄性SD大鼠48只，體重240～260 g，隨機分為假燙組、燙傷組和丁酸鈉組,每組16只。燙傷組和丁酸鈉組采用沸水燙傷背部15 s、腹部8 s，造成50%總體表面積(TBSA)Ⅲ度燙傷；假燙組采用37 ℃溫水浸泡相同部位及時間。于燙傷后立即腹腔注射丁酸鈉(400 mg/kg)或等體積生理鹽水。燙傷后3 h和6 h測定小腸黏膜血流量；檢測血漿二胺氧化酶(DAO)活性；取小腸組織檢測含水率及微血管通透性。結(jié)果假燙組大鼠小腸黏膜血流量豐富，血漿DAO活性正常，小腸微血管通透性和含水率為正常水平。大鼠嚴重燙傷后，小腸黏膜血流量迅速降低，DAO活性顯著增強，小腸微血管通透性和含水率明顯增高。燙傷后3 h，丁酸鈉組與燙傷組比較，小腸組織微血管通透性[(4.26±0.98)μg/mlvs(5.53±1.31)μg/ml]、含水率[(63.67±3.35)%vs(74.32±3.74)%]、血漿DAO[(43.76±9.34)U/Lvs(73.29±11.34) U/L]均顯著降低，小腸黏膜血流量明顯升高[(67.21±9.47)BPUvs(55.18±10.48)BPU](均P<0.05)。燙傷后6 h，丁酸鈉組與燙傷組比較，小腸微血管通透性[(6.89±1.12)μg/mlvs(8.92±1.69) μg/ml]、含水率[(68.45±4.52)%vs(80.76±3.94)%]、血漿DAO[(47.59±10.71)U/Lvs(89.87±11.93) U/L]均明顯降低，小腸黏膜血流量明顯升高[(47.77±8.93)BPUvs(25.64±7.42)BPU](均P<0.05)。結(jié)論丁酸鈉能增加嚴重燙傷大鼠小腸黏膜血流量，降低小腸微血管內(nèi)皮通透性和組織水腫，對小腸組織具有保護作用。

丁酸鈉；燙傷；小腸；含水率；血管通透性

嚴重燒傷后，全身循環(huán)血液重新分布，腸道明顯缺血、缺氧，炎性因子等刺激引起腸道微血管內(nèi)皮細胞代謝功能障礙，結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變，甚至發(fā)生細胞壞死或凋亡，進而引起內(nèi)皮細胞間隙增寬和腸道微血管通透性迅速增加，大量體液經(jīng)過細胞間隙進入組織，使全身血量進一步減少，造成小腸組織水腫和功能損傷[1]。因此，降低腸道微血管通透性對于減少體液進入小腸組織引起腸水腫和功能損傷，減少全身循環(huán)血量丟失具有重要意義。組蛋白去乙酰化酶抑制藥(histone deacetylase inhibitors, HDACIs)是近年來缺氧和休克后細胞保護藥物的研究熱點，HDACIs通過提高機體細胞的抗炎、抗缺氧等能力，能有效保護心、肝、肺、腦、腎等臟器[2-6]。研究表明，短鏈脂肪酸類HDACIs丁酸鈉，具有一定的抗炎和保護臟器的功能[7]。本研究的目的是利用嚴重燙傷大鼠模型觀察丁酸鈉對腸道微血管通透性和腸黏膜血流量的影響。

1　材料與方法

1.1動物模型及分組清潔級雄性SD大鼠48只(北京華阜康生物科技股份有限公司)，60～70日齡，體重240～260 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，自由飲食飲水，實驗前12 h禁食，4 h禁飲。隨機分為假燙組、燙傷組、丁酸鈉組，每組16只大鼠。使用戊巴比妥鈉注射液(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，行頸、背、腹部備皮，并予頸靜脈置管。丁酸鈉組和燙傷組采用沸水燙傷背部15 s，腹部8 s，造成50%總體表面積(TBSA)Ⅲ度燙傷，假燙組采用37 ℃溫水浸泡相同時間。丁酸鈉組傷后立即腹腔注射丁酸鈉(400 mg/kg，美國sigma公司)，燙傷組和假燙組均腹腔注射等體積生理鹽水。以燙傷后3、6 h作為觀察點，每個點含8只大鼠，各觀察點前30 min經(jīng)頸靜脈注入FITC-dextran葡聚糖(70 ku，美國sigma公司)2.5 mg，30 min后處死動物，測定各項指標。

1.2指標檢測及方法

1.2.1小腸黏膜血流量采用激光多普勒血流儀(瑞典PERIMED公司)檢測，沿大鼠腹白線無菌開腹，選擇暴露小腸黏膜的部位，鑷子使其平鋪，防止扭轉(zhuǎn)。紅外探頭的中心移至小腸黏膜表面，自動監(jiān)測血流量，時間約45 s，儀器自動輸出血流量平均值。血流灌注單位為BPU(BPU表示數(shù)碼信號)。

1.2.2小腸組織微血管通透性通過測定燙傷后由血管內(nèi)滲透到組織中的經(jīng)異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(FITC-dextran)含量表示。選取燙傷后3 h和6 h作為觀察點，在觀察點前30 min經(jīng)頸靜脈注入葡聚糖，在30 min后行血管灌洗至灌洗液清亮為止，灌洗時間控制在5 min以內(nèi)。取小腸組織制作勻漿，5000 r/min離心10 min，提取上清液后使用熒光酶標儀(發(fā)射光480 nm，接收光560 nm)檢測小腸組織內(nèi)標記物熒光度，與標準曲線對照后計算濃度。

1.2.3小腸組織含水率采用干濕重法檢測。取適量小腸組織，濾紙將小腸組織表面液體吸干，迅速將其放置于電子天平準確稱重，將組織放入電烤箱中80 ℃烘烤72 h，稱重烘干后的組織并記錄數(shù)值。小腸組織含水率(%)=(烘干前質(zhì)量-烘干后質(zhì)量)/烘干前質(zhì)量×100%。

1.2.4血漿二胺氧化酶(DAO)活性DAO的活性采用DAO試劑盒(南京建成科技有限公司)測定。在燙傷后3、6 h，心臟穿刺取血，4 ℃條件下3000 r/min離心10 min，提取80 μl上清液和800 μl試劑混勻，倒入比色皿，波長設(shè)定為340 nm，在20 s時觀察并記錄吸光度值A(chǔ)1, 37 ℃水浴10 min后，記錄吸光度值A(chǔ)2。按照說明書所列公式計算DAO值。

2　結(jié)　　果

2.1小腸黏膜血流量與假燙組比較，燙傷組和丁酸鈉組血流量均降低，燙傷組3、6 h分別降低54%(P<0.05)和79%(P<0.05)，丁酸鈉組3、6 h分別降低44%(P<0.05)和61%(P<0.05)；與燙傷組比較，丁酸鈉組明顯緩解燙傷引起的小腸黏膜血流量降低，維持血流量相對穩(wěn)定(均P<0.05，表1)。

2.2小腸組織微血管通透性和含水率見表1。與假燙組比較，燙傷3 h后燙傷組、丁酸鈉組小腸組織葡聚糖含量及含水率均有所升高(均P<0.05)；丁酸鈉組與燙傷組比較，均有所降低(均P<0.05)。與假燙組比較，燙傷6 h后燙傷組、丁酸鈉組小腸組織葡聚糖含量及含水率均明顯升高(均P<0.05)；丁酸鈉組明顯低于燙傷組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

2.3血漿DAO活性的變化與假燙組比較，燙傷組和丁酸鈉組血漿DAO水平均升高，燙傷組3、6 h分別升高211%(P<0.05)和270%(P<0.05)，丁酸鈉組3、6 h分別升高85%(P<0.05)和96%(P<0.05)。與燙傷組比較，丁酸鈉組明顯抑制大鼠燙傷引起的血漿DAO的水平增高，減輕小腸損傷(均P<0.05，表1)。

表1　丁酸鈉對嚴重燙傷大鼠小腸微血管通透性、含水率、黏膜血流量、血漿DAO活性的影響　(n=8；±s)

注：與假燙組比較，①P<0.05；與燙傷組比較，②P<0.05

3　討　　論

腸道是消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的器官，也是體內(nèi)和體外相聯(lián)系的最大空腔臟器，含有數(shù)量、種類繁多的細菌，是人體最大的“細菌儲存庫”[8]。這些細菌形成較為穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，在生理條件下對機體無明顯損害。嚴重燒傷后，各種炎性因子、缺血、缺氧、內(nèi)毒素等因素影響，導(dǎo)致腸道微血管內(nèi)皮缺血、缺氧，腸道細菌由內(nèi)皮細胞間隙入血形成膿毒血癥和多臟器衰竭等。因此，研究保護燒傷后腸道微血管內(nèi)皮屏障的藥物，減少微血管通透性，對于減輕腸道損傷、減少細菌入血形成膿毒血癥和多臟器衰竭十分重要[9,10]。

本實驗采用嚴重燙傷大鼠模型觀察燙傷后小腸微血管內(nèi)皮屏障、黏膜血流量和小腸損傷的關(guān)系。DAO是腸絨毛上皮細胞內(nèi)的標記酶，檢測血漿DAO活性的變化，能反映小腸黏膜的損傷情況。與Luo等[11]的研究結(jié)果類似，本實驗數(shù)據(jù)表明，嚴重燙傷后大鼠微血管通透性明顯升高，血管內(nèi)液體向組織內(nèi)滲出，導(dǎo)致小腸組織含水率的增加和黏膜血流量的持續(xù)下降，進而引起血漿DAO活性增高及嚴重的小腸損傷。

HDACIs具有改善心血管病、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性病變預(yù)后的功能[12-14]，也是一種新型的靶向抗癌藥物[15]。丁酸鈉是一種短鏈脂肪酸類HDACIs，具有廣泛的生物調(diào)節(jié)作用，如抗抑郁與抗焦慮作用[16]、抑制神經(jīng)凋亡作用[17-19]、抑制炎性反應(yīng)的作用等[7,20]。Ma等[21]報道，在IPEC-J2細胞模型中，丁酸鈉對緊密連接蛋白ZO-1的表達具有促進作用。Wang等[22]的實驗表明，丁酸鈉具有促進緊密連接蛋白Claudin-1轉(zhuǎn)錄的作用，從而保護腸屏障。Han等[23]采用腹膜炎小鼠模型證實，丁酸鈉可以降低腸道通透性，保護近端消化道。此外，Xun 等[24]在嚴重燒傷動物實驗中發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可以抑制炎性反應(yīng)和中性粒細胞浸潤，減輕嚴重燒傷引起的急性肺損傷，保護肺臟功能。

本實驗結(jié)果表明，丁酸鈉治療3 h后，與燙傷組大鼠比較，小腸黏膜血流量明顯升高，小腸微血管通透性、含水率及血漿DAO均有所降低。這一結(jié)果在丁酸鈉治療6 h后更為明顯，與燙傷組比較有統(tǒng)計學(xué)差異。說明丁酸鈉能夠明顯緩解嚴重燙傷引起的小腸黏膜血流量降低，抑制小腸微血管通透性增加和水腫，降低血漿DAO活性，對小腸功能具有一定的保護作用。

Saito等[25]的研究表明，在體外細胞和膿毒癥小鼠實驗中，微血管內(nèi)皮細胞α-微管蛋白降解，引起肌球蛋白輕鏈2(myosin light chain 2，MLC2)磷酸化，導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細胞收縮和細胞間隙增寬，進而使內(nèi)皮屏障遭受破壞，血管內(nèi)液體向組織內(nèi)滲出，引起組織水腫和器官功能障礙。組蛋白去乙?；?(histone deacetylase6, HDAC6)可以調(diào)節(jié)α-微管蛋白的去乙?；?，促進其降解[26]。丁酸鈉對嚴重燙傷大鼠小腸微血管內(nèi)皮通透性和黏膜血流量的保護作用可能與丁酸鈉抑制HDAC6的去乙?；接嘘P(guān)。其具體作用機制還需進一步實驗研究明確。

[1]盛志勇. 嚴重燒傷后多器官功能衰竭綜合征的防治[J]. 創(chuàng)傷外科雜志, 2001,1(1):1-3.

[2]Gonzales E R, Chen H, Munuve R M,etal. Hepatoprotection and severeity rescue by histone deacetylase inhibitor valproic acid in fatal hemorrhagic shock [J]. J Trauma, 2008, 65(3): 554-565.

[3]Granger A, Abdullah I, Huebner F,etal. Histone deacetylase inhibition reduces myocardial ischemia-reperfusion injury in mice [J]. FASEB J, 2008, 22(10): 3549-3560.

[4]Cianciolo C C, Skrypnyk N I, Brilli L L,etal. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI [J]. J Am Soc Nephrol, 2013, 24(6): 943-953.

[5]Fessler E B, Chibane F L, Wang Z,etal. Potential roles of HDAC inhibitors in mitigating ischemia-induced brain damage and facilitating endogenous regeneration and recovery [J]. Curr Pharm Des, 2013, 19(28): 5105-5120.

[6]周國勇. 丙戊酸鈉對燒傷休克大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞活化和通透性的影響[J]. 解放軍醫(yī)藥雜志, 2013, 25(1):11-15.

[7]Zhang T, Xia M, Zhan Q,etal. Sodium butyrate reduces organ injuries in mice with severe acute pancreatitis through inhibiting HMGB1 expression [J]. Dig Dis Sci, 2015, 60(7): 1991-1999.

[8]Magnotti L J, Deitch E A. Burns, bacterial translocation, gut barrier function, and failure[J]. J Burn Care Rehabil, 2005, 26(5): 383-391.

[9]Birukova A A, Adyshev D, Gorshkov B,etal. GEF-H1 is involved in agonist-induced human pulmonary endothelial barrier dysfunction[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2006, 290(3): 540-548.

[10]Saito S, Lasky J A, Guo W,etal. Pharmacological inhibition of HDAC6 attenuates endothelial barrier dysfunction induced by thrombin [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 408(4): 630-634.

[11]Luo H M, Du M H, Lin Z L,etal. Valproic acid treatment inhibits hypoxia-inducible factor 1alpha accumulation and protects against burn-induced gut barrier dysfunction in a rodent model [J]. PLoS One, 2013, 8(10): e77523.

[12]D’Mello S R. Histone deacetylases as targets for the treatment of human neurodegenerative diseases[J]. Drug News Perspect, 2009, 22(9): 513-524.

[13]Hancock W W, Akimova T, Beier U H,etal. HDAC inhibitor therapy in autoimmunity and transplantation [J]. Ann Rheum Dis, 2012, 71(2): 46-54.

[14]Colussi C, Illi B, Rosati J,etal. Histone deacetylase inhibitors: keeping momentum for neuromuscular and cardiovascular diseases treatment [J]. Pharmacol Res, 2010, 62(1): 3-10.

[15]Jazirehi A R. Regulation of apoptosis-associated genes by histone deacetylase inhibitors: implications in cancer therapy [J].Anticancer Drugs,2010,21(9):805-813.

[16]Gundersen B B, Blendy J A. Effects of the histone deacetylase inhibitor sodium butyrate in models of depression and anxiety [J]. Neuropharmacology, 2009, 57(1): 67-74.

[17]Chuang D M, Leng Y, Marinova Z,etal. Multiple roles of HDAC inhibition in neurodegenerative conditions [J]. Trends Neurosci, 2009, 32(11): 591-601.

[18]Kilgore M, Miller C A, Fass D M,etal. Inhibitors of class 1 histone deacetylases reverse contextual memory deficits in a mouse model of Alzheimer[J]. Neuropsychopharmacology, 2010, 35(4): 870-880.

[19]Sun J, Wang F, Li H,etal. Neuroprotective effect of sodium butyrate against cerebral ischemia/reperfusion injury in mice [J]. Biomed Res Int, 2015, 2015(1): 395895-395895.

[20]Vieira E L, Leonel A J, Sad A P,etal. Oral administration of sodium butyrate attenuates inflammation and mucosal lesion in experimental acute ulcerative colitis [J]. J Nutr Biochem, 2012, 23(5): 430-436.

[21]Ma X, Fan P X, Li L S,etal. Butyrate promotes the recovering of intestinal wound healing through its positive effect on the tight junctions [J]. J Anim Sci, 2012, 90(4): 266-268.

[22]Wang H B, Wang P Y, Wang X,etal. Butyrate enhances intestinal epithelial barrier function via up-regulation of tight junction protein Claudin-1 transcription [J]. Dig Dis Sci, 2012, 57(12): 3126-3135.

[23]Han X, Song H, Wang Y,etal. Sodium butyrate protects the intestinal barrier function in peritonitic mice[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(3): 4000-4007.

[24]Liang X, Wang R S, Wang F,etal. Sodium butyrate protects against severe burn-induced remote acute lung injury in rats [J]. PloS one, 2013, 8(7):191-195.

[25]Saito S, Lasky J A, Guo W,etal. Pharmacological inhibition of HDAC6 attenuates endothelial barrier dysfunction induced by thrombin[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 408(4): 630-634.

[26]Kim D J, Martinez-Lemus L A, Davis G E. EB1, p150Glued, and Clasp1 control endothelial tubulogenesis through microtubule assembly, acetylation, and apical polarization[J].Blood,2013,121(17):3521-3530.

(2015-08-20收稿2015-11-29修回)

(責任編輯武建虎)

Effects of sodium butyrate on intestinal micro-vascular permeability and blood flow in rats with severe scald injury

TANG Fubo1,2，ZHENG Jinguang1， ZHANG Wenjing3，HU Sen4，and BAI Xiaodong1.

1. Department of Burn and Plastic Surgery，3. Department of Infectious Diseases, General Hospital of the Chinese People’s Armed Police Force，Beijing 100039，China； 2. Graduate Term, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force，Tianjin 300309，China；4. Laboratory of Shock and Organ Dysfunction，Burns Institute，The First Affiliated Hospital of PLA General Hospital，Beijing 100048，China

ObjectiveTo investigate the small intestine micro-vascular permeability and blood flow protective effects of sodium butyrate on rats following 50%TBSA full-thickness burns. Methods48 SD rats, weighing 240-260 g, were randomly divided into three groups: sham group, scald group, scald + BTR group. Rats in scald group and scald + BTR group were subjected to 50% TBSA third-degree burns by immersing the back for 15 seconds and the abdomen for 8 seconds in boiling water. The sham group was immersed in 37 ℃ water instead. And then 1ml BTR (400 mg/kg) or 1ml normal saline was intraperitoneally injected, respectively. Blood flow in small intestine was measured by Doppler 3 and 6 hours after injury. Blood was drawn from the heart at 3 and 6 hours after injury for measurement of serum diamine oxidase (DAO); the small intestine tissues were harvested for the measurement of micro-vascular permeability and the changes in tissue water content. ResultsCompared with scald group, the activity of DAO [(43.76±9.34)U/Lvs(73.29±11.34) U/L], the micro-vascular permeability [(4.26±0.98)μg/mlvs(5.53±1.31) μg/ml] and the rate of tissue water [(63.67±3.35)%vs(74.32±3.74)%] in scald + BTR group were significantly lower at 3 hours after scald injury (allP<0.05). In addition, BTR was shown to significantly increase the IMBF level [(67.21±9.47)BPUvs(55.18±10.48)BPU] induced by scald injury at 3 hours (P<0.05). The result at 6 hours after scald injury was similar to 3 hours. ConclusionsSodium butyrate has significant protective effects on small intestinal micro-vascular permeability and blood flow in rats with severe scald injury.

sodium butyrate; scald; small intestine; tissue water content; vascular permeability

1. 國家發(fā)改委衛(wèi)星示范專項[發(fā)改辦高技(2013)2140號]; 2. 國家自然科學(xué)基金(81471872)

唐富波，碩士，醫(yī)師。

100039北京，武警總醫(yī)院：1. 燒傷整形科，3. 感染性疾病科； 2.300309天津，武警后勤學(xué)院研究生大隊;4.100048北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷研究所休克與器官障礙實驗室

白曉東,E-mail: baixiaotmu@126.com

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