卓洋，王巧，楊聰穎，陳昊，李愛民

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院，江蘇連云港222000)

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10% EDTA、5%硝酸用于大鼠顳骨脫鈣處理的效果對比觀察

卓洋，王巧，楊聰穎，陳昊，李愛民

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院，江蘇連云港222000)

目的觀察并比較10%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)和5%硝酸脫鈣處理大鼠顳骨的效果。方法 SD大鼠10只，隨機(jī)分為EDTA組和硝酸組，取出大鼠顳骨后分別置于10% EDTA、5%硝酸脫鈣液中進(jìn)行脫鈣處理。觀察兩組脫鈣效果，記錄脫鈣時間，采用甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行顳骨組織形態(tài)學(xué)觀察，采用免疫熒光雙標(biāo)染色檢測α-tubulin蛋白、水通道蛋白1(AQP1)。結(jié)果 兩組取材過程中，顱骨硬度適當(dāng)，顳骨可輕松切下，無砂礫感，切下的顳骨無松散及組織脫落。硝酸組脫鈣所需時間分別為(11.20±0.83)d、(26.20±2.38)min，兩組相比，P<0.05。EDTA組顳骨整體形態(tài)保持完好，蝸管、鐙骨肌、巖動脈、神經(jīng)元、雪旺細(xì)胞、郎飛結(jié)、神經(jīng)干可清晰辨識；硝酸組顳骨整體結(jié)構(gòu)保存較理想，神經(jīng)元形態(tài)保持尚可，但存在骨質(zhì)染色不均、雪旺細(xì)胞崩解、軸突腫脹、郎飛結(jié)消失現(xiàn)象。EDTA組顳骨脫鈣后AQP1、α-tubulin蛋白定位準(zhǔn)確，組織區(qū)分度高；硝酸組由于細(xì)胞膜中AQP1遭受破壞、位于微管內(nèi)的α-tubulin蛋白漏出細(xì)胞，熒光消減明顯，組織形態(tài)保持較差。結(jié)論 10% EDTA和5%硝酸用于大鼠顳骨脫鈣處理效果均較好，兩種脫鈣液均適用于普通病理及結(jié)構(gòu)觀察，若用于蛋白定量及定性方面研究，應(yīng)首選10% EDTA。

骨脫鈣技術(shù)；乙二胺四乙酸二鈉；硝酸；顳骨

顳骨參與構(gòu)成頭顱的側(cè)部與顱底，其中穿行面神經(jīng)、腦膜中動脈及分支，顳骨同時容納聽覺器官及其附屬結(jié)構(gòu)，顳骨骨折可造成上述結(jié)構(gòu)損傷，引起相應(yīng)并發(fā)癥[1]。既往研究主要通過打開顳骨獲取目標(biāo)組織[2]，此法簡便快速，可獲取目標(biāo)組織進(jìn)行單獨(dú)研究，但易造成組織結(jié)構(gòu)破壞(尤其是血管、神經(jīng)等柔軟且難以取材的組織)。骨脫鈣技術(shù)成熟，為病理常規(guī)技術(shù)，但多用于單純的骨組織病理診斷。目前病理科常用的脫鈣液包括10%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)和5%硝酸等，但不同性質(zhì)的脫鈣液對脫鈣后顳骨內(nèi)部組織形態(tài)及蛋白定位、含量的影響少有報(bào)道。2015年6～10月，我們分別采用10% EDTA和5%硝酸對大鼠整個顱骨進(jìn)行脫鈣處理，觀察并比較脫鈣后顳骨內(nèi)結(jié)構(gòu)及蛋白定位、含量變化，為后期研究提供參考。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與材料正常成年健康雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量200～250 g，隨機(jī)分為EDTA組及硝酸組各5只。4%、10%多聚甲醛，0.25%甲苯胺藍(lán)染液，0.5%冰醋酸溶液，梯度乙醇，二甲苯，兔抗大鼠水通道蛋白1(AQP1)一抗，小鼠抗大鼠α-tubulin蛋白一抗，CY3標(biāo)記山羊抗兔二抗，F(xiàn)itc標(biāo)記山羊抗小鼠二抗，山羊血清工作液，DAPI工作液。Leica RM2235超薄切片機(jī)，奧林巴斯熒光顯微鏡。

1.2顱骨的取材及固定兩組大鼠以10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉，劍突下剪開皮膚、暴露心臟，生理鹽水于左心室內(nèi)灌注至大鼠四爪及雙肺顏色變白，換用新鮮配制的4%多聚甲醛經(jīng)左心室灌注、固定，灌注成功的標(biāo)志為大鼠全身僵硬，所灌注的大腦色白、質(zhì)硬。于頸枕交界處將大鼠斷頭，銳性清除頭顱皮膚、外耳、肌肉等附屬組織，暴露出完整顱骨；自枕骨大孔處向前去除頂骨，掀起大腦，剪斷顱神經(jīng)，去除大腦；將顱骨置于10%多聚甲醛溶液內(nèi)，4 ℃冰箱內(nèi)固定4 h，0.9%生理鹽水沖洗后進(jìn)行脫鈣處理。

1.3脫鈣液配制及顱骨脫鈣方法EDTA脫鈣液：EDTA 10 g加入100 mL的雙蒸水中，加入NaOH(1 mmol/L)將pH調(diào)至9.0。硝酸脫鈣液：將濃硝酸5 mL緩慢加入95 mL的雙蒸水中。EDTA組和硝酸組分別采用10% EDTA、5%硝酸脫鈣液進(jìn)行脫鈣處理。將固定好的頭顱標(biāo)本置于相當(dāng)于10倍顱骨體積的脫鈣液中。加蓋放入4 ℃冰箱，定期更換脫鈣液，觀察脫鈣情況，以切片機(jī)刀片切割顱骨柔軟且無砂礫感為脫鈣終點(diǎn)。

1.4顳骨石蠟切片的制備取兩組脫鈣完全后的頭顱以蒸餾水沖洗10 min，去除標(biāo)本中的脫鈣液，將大鼠頭顱置于頭顱模具中，分別沿頭顱正中及雙眼眶后緣連線取出顳骨。常規(guī)脫水、透明、包埋，沿矢狀位做厚度10 μm連續(xù)切片，制備好的石蠟切片置于70 ℃烤箱中烘烤4 h，常規(guī)脫蠟及梯度乙醇水化后分別進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色及免疫熒光雙標(biāo)染色。

1.5顱骨組織形態(tài)觀察采用甲苯胺藍(lán)染色法。將標(biāo)本置于37 ℃的0.25%甲苯胺藍(lán)染缸內(nèi)3 min，流水洗去浮色，0.5%冰醋酸溶液1 min，梯度乙醇脫水5 s，二甲苯透明30 s，封片，顯微鏡下拍照。

1.6顱骨組織中AQP1、α-tubulin蛋白檢測采用免疫熒光雙標(biāo)染色。將標(biāo)本以0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3次，浸入抗原修復(fù)液中，100 ℃水浴鍋內(nèi)水浴10 min；0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3次；加入山羊血清工作液37 ℃封閉60 min，傾去，不洗；加入AQP1(1∶500)及α-tubulin(1∶1 000)一抗，濕盒，4 ℃過夜；恢復(fù)室溫，0.01 mol/L PBS浸洗5 min×5次；加入CY3(1∶1 000)及Fitc(1∶500)標(biāo)記的二抗，濕盒，避光，37 ℃ 120 min；恢復(fù)室溫，0.01 mol/L PBS浸洗5 min×5次；DAPI復(fù)染，濕盒，避光，室溫5 min；0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3次；防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。AQP1、α-tubulin蛋白分別定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，鏡下選取膝狀神經(jīng)節(jié)為目標(biāo)結(jié)構(gòu)，分別使用紅色、綠色通道觀察膝狀神經(jīng)節(jié)中2種蛋白的熒光強(qiáng)度，將熒光信號通過攝像機(jī)轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像，在計(jì)算機(jī)上使用Image J軟件測算兩種熒光的平均熒光強(qiáng)度，代表目的蛋白相對表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

兩組取材過程中，顱骨硬度適當(dāng)，顳骨可輕松切下，無砂礫感，切下的顳骨無松散及組織脫落。EDTA組、硝酸組脫鈣所需時間分別為(11.20±0.83)d、(26.20±2.38)min，兩組相比，P<0.05。

EDTA組甲苯胺藍(lán)染色均一，顳骨整體形態(tài)保持完好，蝸管、鐙骨肌、巖動脈、神經(jīng)元、雪旺細(xì)胞、郎飛結(jié)、神經(jīng)干可清晰辨識。硝酸組顳骨整體結(jié)構(gòu)保存較理想，神經(jīng)元形態(tài)保持尚可，但存在骨質(zhì)染色不均、雪旺細(xì)胞崩解、軸突腫脹、郎飛結(jié)消失現(xiàn)象。詳見圖1。

EDTA組熒光清晰明亮，背景干凈，邊緣清楚，AQP1、α-tubulin蛋白定位準(zhǔn)確，組織區(qū)分度高，硝酸組三種熒光都存在消減，尤其是紅色熒光最為嚴(yán)重，綠色熒光暈染，邊緣模糊，組織形態(tài)保持較差。EDTA組、硝酸組綠色熒光強(qiáng)度分別為30.23±7.32、17.56±6.58，紅色熒光強(qiáng)度分別為42.84±8.24、12.85±4.11，藍(lán)色熒光強(qiáng)度分別為35.69±6.58、20.47±5.75，兩組相比，P均<0.05。詳見圖2。

注：A、B、C為EDTA組；D、E、F為硝酸組。

圖1兩組顳骨脫鈣后組織形態(tài)觀察

注：A、B、C、D分別為EDTA組α-tubulin、AQP1、DAPI及三種熒光Merge后圖像；a、b、c、d分別為硝酸組α-tubulin、AQP1、DAPI及三種熒光Merge后圖像。

圖2兩組脫鈣后顳骨中α-tubulin、AQP1蛋白定位及表達(dá)

3　討論

骨組織中富含鈣鹽，硬度較高，直接切片難度較大。目前通行的方法是使用脫鈣法將其中的鈣鹽去除，待骨質(zhì)變軟后進(jìn)行切片。脫鈣技術(shù)是目前最常用的骨組織處理方法，主要用于質(zhì)硬的骨組織或含有骨組織的腫瘤的預(yù)處理[3]。脫鈣液的選擇對于后期制片及診斷具有重要意義。脫鈣試劑大致可分為酸性脫鈣液(硝酸、鹽酸、硫酸、甲酸等)及鈣絡(luò)合劑(EDTA、檸檬酸鈉)兩種[4～6]。

酸性脫鈣液能與鈣鹽迅速反應(yīng)，由于所選酸性脫鈣液溶劑濃度及骨質(zhì)質(zhì)地不同，至脫鈣終點(diǎn)所需的時間也存在差異，在數(shù)分鐘至數(shù)小時不等[5，7]。酸性脫鈣液中的酸與鈣鹽反應(yīng)迅速，可實(shí)現(xiàn)快速脫鈣，且酸性脫鈣液具有配置簡單、對反應(yīng)條件要求不高等優(yōu)勢，能夠滿足常規(guī)病理尤其是快速病理的需求。近年來，酸性脫鈣液出現(xiàn)許多改進(jìn)，如將兩種或兩種以上的脫鈣液進(jìn)行混合，或化學(xué)脫鈣和物理方法結(jié)合等[8,9]，但其基本化學(xué)反應(yīng)本質(zhì)并沒有發(fā)生改變，仍為酸性溶液與鈣鹽反應(yīng)。蛋白質(zhì)及核酸與酸性脫鈣液進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)可出現(xiàn)不可逆的變性，可能對后期分子定位及定量評價造成影響；另外，酸與鈣鹽的反應(yīng)為分解反應(yīng)，期間產(chǎn)生的小氣泡及熱量易造成組織結(jié)構(gòu)變形、破壞，難以做到原位觀察[10]。因此，酸性脫鈣液的適用范圍僅限于普通染色進(jìn)行大體形態(tài)學(xué)觀察，若進(jìn)行分子或細(xì)胞結(jié)構(gòu)(細(xì)胞膜、細(xì)胞核)研究，則需要尋找一種對抗原親和力高且對組織形態(tài)影響小的脫鈣方法。絡(luò)合劑能與骨質(zhì)中的鈣離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，形成可溶的非離子螯合物從而實(shí)現(xiàn)脫鈣目的。與酸性脫鈣液最大的不同之處在于，上述螯合反應(yīng)在中性條件下進(jìn)行，過程溫和，不產(chǎn)生氣泡，對蛋白質(zhì)親和性較高[11]。但螯合反應(yīng)進(jìn)行緩慢，其最大的缺點(diǎn)在于脫鈣周期較長(需兩周至一個月)，在脫鈣過程中需不斷更換脫鈣液且每天判斷脫鈣終點(diǎn)才能獲得良好的脫鈣效果[12]。

在涉及動物模型的研究中，常常需對蛋白進(jìn)行原位標(biāo)記和觀察，在處理組織過程中，保持組織形態(tài)及抗原完整顯得尤為重要。顳骨內(nèi)骨質(zhì)不均一，結(jié)構(gòu)精細(xì)，包含神經(jīng)、肌肉、血管等不同質(zhì)地的組織[13]。脫鈣前對顳骨進(jìn)行取材將不可避免地?cái)D壓、震動顳骨，造成其內(nèi)部結(jié)構(gòu)移位、碎裂，取材也難以做到精確。因此我們在顳骨取材前對大鼠整個頭顱骨進(jìn)行脫鈣處理，保證顳骨內(nèi)結(jié)構(gòu)完整。脫鈣前清除顱骨附著的骨膜、肌肉等附屬組織，有利于顱骨與脫鈣液接觸，加快脫鈣進(jìn)程，保證脫鈣效果。另外，由于大鼠頭顱骨之間結(jié)合疏松，骨質(zhì)較軟，清除顱骨附著組織時應(yīng)避免牽拉和擠壓而造成顱骨結(jié)構(gòu)破壞，宜使用鋒利的剪刀、刀片小心修剪，避免暴力牽拉。由于EDTA脫鈣周期較長，我們在脫鈣前使用多聚甲醛對大鼠顱骨進(jìn)行固定，可進(jìn)一步保護(hù)顳骨內(nèi)蛋白質(zhì)，最大限度保存蛋白質(zhì)的抗原性[14]。我們利用顳骨解剖學(xué)特點(diǎn)，選擇定位于細(xì)胞膜內(nèi)的AQP1[15]及定位于胞質(zhì)內(nèi)的α-tubulin[16]作為目標(biāo)蛋白，實(shí)現(xiàn)對顳骨內(nèi)不同組織結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的觀察。

我們發(fā)現(xiàn)，兩組取材過程中，顱骨硬度適當(dāng)，顳骨可輕松切下，無砂礫感，切下的顳骨無松散及組織脫落。EDTA組脫鈣所需時間長于硝酸組。EDTA組顳骨整體形態(tài)保持完好，蝸管、鐙骨肌、巖動脈、神經(jīng)元、雪旺細(xì)胞、郎飛結(jié)、神經(jīng)干可清晰辨識；硝酸組顳骨整體結(jié)構(gòu)保存較理想，神經(jīng)元形態(tài)保持尚可，但存在骨質(zhì)染色不均、雪旺細(xì)胞崩解、軸突腫脹、郎飛結(jié)消失現(xiàn)象。EDTA組顳骨脫鈣后AQP1、α-tubulin蛋白定位準(zhǔn)確，組織區(qū)分度高；而硝酸組由于細(xì)胞膜中AQP1遭受破壞、位于微管內(nèi)的α-tubulin蛋白漏出細(xì)胞，熒光消減明顯，組織形態(tài)保持較差。結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，10% EDTA和5%硝酸脫鈣處理各有優(yōu)點(diǎn)，對于脫鈣液的選擇應(yīng)結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)條件及目的。硝酸脫鈣液適用于時間緊張的解剖學(xué)研究，對于時間寬松且對圖片質(zhì)量要求較高的實(shí)驗(yàn)，不論是形態(tài)學(xué)還是分子學(xué)定位及定量研究，應(yīng)首選EDTA脫鈣液。

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江蘇省衛(wèi)生廳重大項(xiàng)目(H201259)。

李愛民(E-mail: liaimin6529@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.013

R446.6

A

1002-266X(2016)31-0043-03

2016-01-30)