展　濤　陳麗麗　顏　彬　曹　永　馬志紅　岳　輝

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江　牡丹江　157011)

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膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的內(nèi)皮分化和管腔形成能力

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(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江157011)

目的探討膠質(zhì)瘤干細(xì)胞內(nèi)皮分化和形成管腔的能力。方法以含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)U87人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，再用免疫磁珠法結(jié)合“懸浮克隆球形成法”分離膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，先行形態(tài)學(xué)觀察，然后采用免疫熒光方法檢測CD133、Nestin和GFAP表達(dá)，鑒定膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。將分離所得的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在添加20 μg/ml血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，1 μg/ml FGF和2 μg/ml胰島素樣生長因子(IGF)的10% DMEM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)3 d和7 d的細(xì)胞進(jìn)行Western印跡檢測內(nèi)皮特定蛋白的表達(dá)。同時(shí)將誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的細(xì)胞接種于涂有Matrigel的24孔板中，12 h和24 h后于倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。結(jié)果免疫磁珠法結(jié)合“懸浮克隆球形成法”分離出的膠質(zhì)瘤細(xì)胞團(tuán)呈現(xiàn)明顯的CD133和Nestin免疫熒光染色，但GFAP未顯示熒光染色；Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)被誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞隨著時(shí)間延長，CD133的表達(dá)逐漸減弱直至消失，而CD31和 vWF表達(dá)由弱到強(qiáng)；Matrigel 結(jié)果顯示被誘導(dǎo)7 d的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞明顯形成了完整的管腔。結(jié)論膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞生長條件下，可以分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞并且具有形成管腔的能力。

膠質(zhì)瘤干細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞；血管形成；膠質(zhì)瘤

膠質(zhì)瘤是最常見和死亡率最高的顱腦原發(fā)性惡性腫瘤，占腦腫瘤的大部分，而膠質(zhì)瘤的發(fā)展及治療與腫瘤中血管形成密切相關(guān)〔1〕。近年來又發(fā)現(xiàn)了一種與傳統(tǒng)腫瘤血管生長途徑完全不同的、不依賴內(nèi)皮細(xì)胞的全新血液供應(yīng)方式，即血管生成擬態(tài)(VM)〔2〕。因此，研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的內(nèi)皮分化和形成管腔能力對于開展膠質(zhì)瘤臨床新療法有著重要的意義。

1　材料與方法

1.1腫瘤細(xì)胞系及培養(yǎng)選用人U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為研究對象，細(xì)胞系由牡丹江醫(yī)學(xué)院病理教研室惠贈(zèng)。將細(xì)胞置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清、青霉素100 IU/ml、鏈霉素50 IU/ml的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2用免疫磁珠方法分離膠質(zhì)瘤干細(xì)胞參照齊玲等〔3〕報(bào)道，用免疫磁珠方法分離腦腫瘤干細(xì)胞，分離出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，并將其接種到含內(nèi)皮生長因子(EGF，20 μg/ml)，bFGF(20 μg/ml)，B27添加劑(1×)的無血清培養(yǎng)基中，平穩(wěn)置入5%CO237℃濕度條件飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后顯微鏡下觀察干細(xì)胞球形成情況并采集圖像。

1.3免疫熒光法鑒定膠質(zhì)瘤干細(xì)胞取培養(yǎng)至第5天的細(xì)胞球懸液用移液槍移至離心管中，1 000 r/min，離心5～10 min，用移液槍移除上清液，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，之后采用免疫熒光法進(jìn)行鑒定，實(shí)驗(yàn)中設(shè)立空白對照組和陰性對照組(CD133-細(xì)胞)，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并采集圖像。

1.4膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞被培養(yǎng)7 d后分為對照組及誘導(dǎo)組。對照組僅給10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；誘導(dǎo)組在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中分別添加20 μg/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)，1 μg/ml FGF和2 μg/ml胰島素樣生長因子(IGF)。培養(yǎng)期間每2～3 d換液并補(bǔ)充相應(yīng)生長因子。

1.5Western印跡檢測被誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞內(nèi)皮標(biāo)記物的表達(dá)取被誘導(dǎo)3 d和7 d的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞加入200 μl細(xì)胞裂解緩沖液〔100 mmol/L Tris/HCl，100 mmol/L氯化鈉，0.5%脫氧膽酸鈉，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1%NP40，0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)和蛋白酶抑制劑〕，提取內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的總蛋白并經(jīng) Lowrry法定量；取40 μg蛋白上樣到10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳(100 V，1.5 h)，待溴酚藍(lán)進(jìn)入凝膠底部后，把蛋白質(zhì)再印跡到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用抗CD133、CD31和血管性假血友病因子(vWF)抗體(1∶200)和抗β-actin(1∶500) 抗體孵育，最后加入用堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的相應(yīng)二抗，用 o-Dianisidine，tetrazotized 和β-naphthyl acid phosphate 顯色劑顯色后用凝膠成像儀分析圖像。

1.6被誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞體外管腔形成能力的檢測將Matrigel均勻滴涂于24孔板里，送培養(yǎng)箱里凝固30 min；取被誘導(dǎo)7 d的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞經(jīng)胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為 6×104個(gè)細(xì)胞/ml；按 0.5 ml/孔的量接種細(xì)胞懸液于Matrigel膠表面，培養(yǎng)24～48 h；顯微鏡觀察管腔樣結(jié)構(gòu)形成情況，拍照，計(jì)數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件，組間資料比較采用ANOVA和t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1膠質(zhì)瘤細(xì)胞系免疫磁珠分選前鏡下觀察U87細(xì)胞培養(yǎng)1 d后，大部分細(xì)胞貼壁，有梭形、星形等多種形態(tài)。培養(yǎng)3～5 d后細(xì)胞突起逐漸增多，細(xì)胞融合達(dá)70%～80%。見圖1。

圖1　U87細(xì)胞培養(yǎng)3 d后鏡下觀察

2.2免疫磁珠分選后的細(xì)胞生長狀況和形態(tài)學(xué)觀察U87細(xì)胞用CD133+磁珠分選后再用含bFGF+EGF+B27的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，結(jié)果與未分選而直接進(jìn)行培養(yǎng)的U87細(xì)胞相比，磁珠分選系統(tǒng)分離后的細(xì)胞接種后1～2 d內(nèi)細(xì)胞生長比較緩慢，幾無明顯增殖，培養(yǎng)第3天可見一些懸浮細(xì)胞形成多個(gè)細(xì)胞的圓形克??；第5～7天可見大量懸浮生長的由幾十個(gè)到幾百個(gè)圓球形細(xì)胞組成的細(xì)胞球。細(xì)胞形態(tài)均一，結(jié)合緊密，折光性好。吹打成單細(xì)胞懸液，經(jīng)過傳代培養(yǎng)可形成許多新的細(xì)胞球。見圖2。

2.3免疫熒光鑒定膠質(zhì)瘤干細(xì)胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)：4 h后貼壁的細(xì)胞團(tuán)呈明顯的CD133和Nestin熒光染色，但GFAP未顯示熒光染色。陰性對照組也未顯示熒光染色。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞核用DAPI(藍(lán)色)標(biāo)記。見圖3。

圖2　免疫磁珠分選結(jié)合無血清培養(yǎng)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長情況

A：CD133陽性細(xì)胞示紅色熒光；B：Nestin陽性細(xì)胞示綠色熒光；C：雙重染色陽性的細(xì)胞示黃色熒光，即膠質(zhì)瘤干細(xì)胞；D：A、B、C 圖 DAPI 細(xì)胞核染色；E：陰性對照組細(xì)胞DAPI 細(xì)胞核染色；F：陰性對照組細(xì)胞PE染色；G：陰性對照組細(xì)胞FITC染色；H：GFAP染色未顯示熒光圖3　磁珠分選結(jié)合懸浮克隆球培養(yǎng)分離的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞CD133、Nestin和GFAP表達(dá)(×100)

2.4誘導(dǎo)培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞形成管腔的能力接種于Matrigel上的細(xì)胞，未誘導(dǎo)的細(xì)胞未見明顯細(xì)胞條索形成，而被誘導(dǎo)的細(xì)胞在12 h后開始往凝膠里爬行生長，呈明顯條索；24 h后這些條索互相開始鏈接，融合成類似圓形、三角形和多邊形的管腔樣結(jié)構(gòu)。見圖4。

2.5膠質(zhì)瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后內(nèi)皮分化相關(guān)蛋白的表達(dá)Western印跡研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)細(xì)胞被誘導(dǎo)到第3天時(shí)，仍然有CD133表達(dá)，CD31和 vWF有微弱表達(dá)；但到第7天時(shí)，CD133的表達(dá)消失，說明被誘導(dǎo)的細(xì)胞已經(jīng)失去干/祖細(xì)胞的標(biāo)記，而CD31和 vWF的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01)。見圖5。

圖4　膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在Matrigel上形成管腔情況(×100)

與對照組(0 d)比較:1)P<0.01；組內(nèi)與3 d比較:2)P<0.01，3)P<0.05圖5　Western印跡檢測膠質(zhì)瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后CD133、CD31和 vWF表達(dá)

3　討　論

腫瘤內(nèi)在新生血管時(shí)，參與其中的內(nèi)皮細(xì)胞主要來源于：①腫瘤細(xì)胞以趨化的方式募集原有血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過出芽、運(yùn)動(dòng)和遷移進(jìn)入腫瘤組織當(dāng)中；②血液循環(huán)中祖細(xì)胞(EPC)定位和分化，從而產(chǎn)生新的血管內(nèi)皮。

以往研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在膠質(zhì)瘤血管生成過程中的作用主要是集中在分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞如何通過分泌促血管形成因子來刺激血管形成，而在本研究中則是分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞能否直接分化為內(nèi)皮細(xì)胞并具有管腔形成的能力。目前分離腫瘤干細(xì)胞(TSCs)的主要方法為熒光激活細(xì)胞分選術(shù)和磁性激活細(xì)胞分選術(shù)。也有研究者根據(jù)干細(xì)胞高表達(dá)ATP結(jié)合盒超家族(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體的特點(diǎn)，通過流式細(xì)胞儀從膠質(zhì)瘤細(xì)胞系內(nèi)分離出側(cè)群干細(xì)胞(SP細(xì)胞)，并證實(shí)這類細(xì)胞具有 TSCs 特性〔4〕。流式細(xì)胞技術(shù)分選細(xì)胞對細(xì)胞損傷較大，而且容易受到污染，不易控制。免疫磁珠分選技術(shù)利用包被有單克隆抗體的納米級球形磁性微粒特異性地與靶物質(zhì)相結(jié)合，使之具有磁響應(yīng)性，應(yīng)用外部建立的磁場，分離出具有活性的靶細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)以免疫磁珠分選法，利用膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表面具有干細(xì)胞特有的表面標(biāo)志物 CD133 的特點(diǎn)〔5〕，選用 CD133 抗體包被的免疫磁珠，從人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤懸液中有效地分離只占腫瘤細(xì)胞總數(shù) 0.1%～1%的TSCs。進(jìn)一步利用公認(rèn)的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物CD133、Nestin同時(shí)陽性表達(dá)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性GFAP陰性表達(dá)作為判斷膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果成功獲得了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，同時(shí)也為繼續(xù)研究其能否被誘導(dǎo)成具有內(nèi)皮標(biāo)記的細(xì)胞和參與管腔形成奠定了基礎(chǔ)。

干細(xì)胞在分子水平，通過細(xì)胞-細(xì)胞間、細(xì)胞-間質(zhì)及各種分子的相互作用，使一些關(guān)鍵基因表達(dá)發(fā)生改變，產(chǎn)生特異的蛋白質(zhì)，從而調(diào)整其分化，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能等方面發(fā)生變化，造成表型出現(xiàn)變化。在本實(shí)驗(yàn)中，通過其形態(tài)學(xué)變化，表明膠質(zhì)瘤干細(xì)胞已經(jīng)從形態(tài)學(xué)接近了內(nèi)皮細(xì)胞。

本研究顯示，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在內(nèi)皮條件下培養(yǎng)到第3天時(shí)，仍然有CD133的表達(dá)，而CD31和 vWF開始有較弱的表達(dá)；但到第7天時(shí)，CD133的表達(dá)消失，說明被誘導(dǎo)的細(xì)胞已經(jīng)失去干/祖細(xì)胞的標(biāo)記，而CD31和 vWF的表達(dá)明顯增強(qiáng)。這也說明隨著細(xì)胞被誘導(dǎo)時(shí)間延長，其內(nèi)皮特定蛋白的表達(dá)也逐漸增加且趨于穩(wěn)定；同時(shí)也表明膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在內(nèi)皮環(huán)境下完全可以被誘導(dǎo)成內(nèi)皮樣的細(xì)胞。將經(jīng)過內(nèi)皮誘導(dǎo)7 d的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞接種于Matrigel上，結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在內(nèi)皮培養(yǎng)基中不但可以分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞，而且從功能上也具備了形成管腔的能力，據(jù)此也可以推斷這種膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境適宜的情況下也可能通過內(nèi)皮分化而直接參與腫瘤血管的形成。但是，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在體內(nèi)如何參與血管形成，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞又如何向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過程中涉及了哪些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這都還有待于進(jìn)一步研究。

1楊世強(qiáng)，李蘊(yùn)潛.CD105與人腦膠質(zhì)瘤腫瘤血管生成關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(12)：3504-6.

2Maniotis AJ，F(xiàn)olberg R，Hess A，etal.Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro：vasculogenic mimicry 〔J〕.Am J Pathol，1999；155(3)：739-52.

3齊玲，金宏，丁麗娟，等.CD133免疫磁珠分選腦腫瘤干細(xì)胞及其生物學(xué)特性〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011；37(3)：441-4，572.

4Kondo T，Setoguchi T，Taga T.Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cell in the C6 glioma call line〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2004;101(3):781-6.

5Holland EC.Glioblastoma multiforme：the terminator〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2000；97(12)：6242-4.

〔2015-11-29修回〕

(編輯袁左鳴)

黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目(No.12541849)

陳麗麗(1979-)，女，主治醫(yī)師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

展?jié)?1981-)，男，碩士，講師，主要從事病理學(xué)研究。

R739.4

A

1005-9202(2016)16-3910-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.018