陳　果　李　蔚　李小惠

(四川省醫(yī)學科學院 四川省人民醫(yī)院，四川　成都　610072)

?

鴉膽子苦醇抑制人非小細胞肺癌A549細胞轉(zhuǎn)移的機制

陳果李蔚李小惠

(四川省醫(yī)學科學院 四川省人民醫(yī)院，四川成都610072)

目的探討鴉膽子苦醇對人非小細胞肺癌A549細胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用及其機制。方法采用Reed-Muench法計算鴉膽子苦醇對A549細胞的半數(shù)致死濃度(LC50)；通過CCK-8測定細胞活力繪制增殖曲線和流式細胞周期測定鴉膽子苦醇對A549細胞增殖能力的影響；采用Transwell法檢測鴉膽子苦醇對A549細胞株轉(zhuǎn)移的抑制情況，以及在半數(shù)致死濃度的鴉膽子苦醇濃度下不同時間對細胞轉(zhuǎn)移的抑制率；應用Western印跡法檢測細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達情況。結(jié)果非小細胞肺癌A549細胞的增殖能力在鴉膽子苦醇處理后基本沒有變化；鴉膽子苦醇處理后A549細胞的轉(zhuǎn)移能力與對照組相比明顯下降，且在一定作用時間范圍內(nèi)有時間依賴性；腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(BRF)2、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-2(IGFBP-2)、CD151的表達水平在鴉膽子苦醇處理后的細胞中明顯下調(diào)。結(jié)論鴉膽子苦醇是潛在的抗非小細胞肺癌的藥物，有必要進一步闡明其抗非小細胞肺癌的分子機制，為臨床治療提供一定的指導意義。

鴉膽子苦醇；非小細胞肺癌；A549細胞；轉(zhuǎn)移

隨著當今分子生物學技術(shù)和臨床治療水平的快速發(fā)展，非小細胞肺癌的臨床治療手段特別是新型的分子藥物靶向治療有了較明顯的進步，但是肺癌的易轉(zhuǎn)移性仍然是治療的主要難題〔1，2〕。鴉膽子苦醇(Brusatol)是一種苦木內(nèi)酯類化合物，從鴉膽子中提取獲得。鴉膽子性苦寒，具有殺蟲止痢和抗瘧、抗腫瘤等功效〔3〕。目前關(guān)于鴉膽子苦醇抗白血病、抗胰腺癌和前列腺癌中的重要作用均有報道，但未見有其對肺癌轉(zhuǎn)移能力抑制的研究〔4〕。本文初步探討鴉膽子苦醇對非小細胞肺癌A549細胞轉(zhuǎn)移的抑制能力及其相應的分子機制。

1　材料與方法

1.1試驗藥物鴉膽子苦醇，購自成都植標化純生物技術(shù)有限公司。

1.2試劑非小細胞肺癌A549細胞，購自中科院上海細胞所。膽囊收縮素八肽(CCK-8)，購自上海易色醫(yī)療科技有限公司；24孔，孔徑8.0 μm，Transwell板，購自北京樂博生物科技有限公司；1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2(BRF2)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-2(IGFBP-2)、CD151、β-actin單克隆抗體購自Proteintech公司；辣根過氧化酶標記的羊抗兔、羊抗鼠抗體購自北京中杉金橋。

1.3儀器倒置相差顯微鏡：德國Leica 公司；二氧化碳孵箱：美國Thermo Fisher 公司；垂直電泳系統(tǒng)、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)：北京六一；無菌操作臺：蘇凈集團安泰公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

1.4方法

1.4.1細胞培養(yǎng)A549細胞用5 ml含10%胎牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)基于含37℃、飽和濕度、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈單層貼壁生長，后續(xù)實驗取狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞進行。

1.4.2半數(shù)致死濃度計算將生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞按2 000個/孔的細胞量接種于96孔板中，鴉膽子苦醇用無血清培養(yǎng)基稀釋，按0.01～10 μmol/L十倍稀釋設(shè)置濃度梯度，每孔加100 μl。于培養(yǎng)箱中孵育，2 d后觀察細胞生長狀態(tài)，細胞發(fā)生壞死標記為陽性，細胞未有壞死標記為陰性。統(tǒng)計數(shù)據(jù)，用Reed-Muench算法進行計算。

1.4.3細胞增殖能力測定A549細胞經(jīng)半數(shù)細胞致死濃度的鴉膽子苦醇處理6 h和12 h后胰酶消化，按每孔2 000個細胞的量接種于96孔板中，用CCK-8法分別測定0、1、2、3、4、5 d的吸光值，數(shù)據(jù)繪制成曲線圖。半數(shù)細胞致死濃度的鴉膽子苦醇處理A549細胞6 h和12 h后胰酶消化，按每組樣品2×106的量收集細胞于EP管中，75%乙醇固定過夜，用含100 μg/ml RNA酶、30 μg/ml PI和2‰的TritonX-100染液染色，細胞流式儀分析，用ModFit處理數(shù)據(jù)。

1.4.4細胞轉(zhuǎn)移能力的測定A549細胞經(jīng)半數(shù)細胞致死濃度的鴉膽子苦醇分別處理2、6、12、24、48 h后用胰酶消化收集細胞，每個樣品孔200 μl，無血清1640培養(yǎng)基重懸5×104個細胞于Transwell上室中，下室采用含20%FBS的1640培養(yǎng)基900 μl，恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，用棉簽擦去上室殘留細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，甲醇中固定30 min，室溫吹干，用結(jié)晶紫染色1 min，PBS清洗，將上室薄膜用小刀切下，于載玻片上，固定，封片，觀察計數(shù)。

1.4.5Western印跡檢測細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達上步驟中同批次細胞，經(jīng)PBS清洗后，加入RIPA細胞裂解液，冰上裂解細胞30 min，12 000 r/min離心10 min，用考馬斯亮藍染色法進行蛋白質(zhì)濃度測定。同樣量的蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳進行蛋白分離，蛋白電泳完成后通過蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將PAGE膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到適當大小的硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉進行封閉，按1∶1 000的稀釋倍數(shù)配置抗體，4℃孵育過夜，第2天取出后洗去殘余的一抗，按1∶5 000的稀釋倍數(shù)配置二抗，室溫孵育2 h后洗去殘余的二抗，用增強化學發(fā)光法(ECL)顯色，對比轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達變化。

1.5統(tǒng)計學方法應用SSPS17.0和Graphpad prism 5統(tǒng)計軟件進行處理。

2　結(jié)　果

2.1梯度濃度鴉膽子苦醇處理A549細胞觀察細胞生長狀態(tài)，采用Reed-Muench算法計算得出半數(shù)致死濃度為(0.70 ± 0.06)μmol/L。0.01μmol/L濃度的鴉膽子苦醇處理A549細胞后細胞生長狀態(tài)良好，10 μmol/L濃度的鴉膽子苦醇處理A549細胞后細胞多數(shù)發(fā)生壞死。見圖1。

2.2CCK-8實驗結(jié)果半數(shù)致死濃度的鴉膽子苦醇處理A549細胞6 h和12 h后，與未處理前相比其增殖能力沒有明顯變化；細胞流式周期分析結(jié)果顯示，半數(shù)致死濃度的鴉膽子苦醇處理A549細胞6 h和12 h后與未處理前相比其細胞周期變化不明顯。見圖2，圖3。

2.3Transwell實驗結(jié)果0.70 μmol/L的鴉膽子苦醇處理A549細胞6 h后，A549細胞的轉(zhuǎn)移能力略有下降；處理12 h后，細胞的轉(zhuǎn)移能力明顯下降。見圖4。

圖1　A549細胞生長狀態(tài)(×200)

圖2　A549細胞增殖曲線圖

A：對照組；B：鴉膽子苦醇處理處理6 h；C：鴉膽子苦醇處理處理12 h；下圖同圖3　A549細胞周期

圖4　0.70 μmol/L的鴉膽子苦醇處理A549細胞不同時間細胞遷移能力(×200)

2.4Western印跡檢測結(jié)果細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白BRF2、IGFBP-2、CD151的表達水平均有不同程度的下調(diào)。與細胞轉(zhuǎn)移能力相應，在鴉膽子苦醇處理6 h后蛋白表達量開始下降，在12 h后蛋白表達明顯下調(diào)。見圖5。

圖5　鴉膽子苦醇處理A549細胞不同時間段細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達

3　討　論

目前發(fā)現(xiàn)，天然抗腫瘤藥物通過不同的作用方式抑制腫瘤生長，如抑制腫瘤細胞的增殖；或者通過誘導腫瘤細胞的分化而使腫瘤細胞失去干性；誘導腫瘤細胞的凋亡以及抑制腫瘤細胞的黏附能力從而抑制腫瘤的遷移、侵襲和浸潤轉(zhuǎn)移等。本研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇能夠抑制非小細胞肺癌A549細胞的遷移能力，而且在一定范圍內(nèi)藥物對腫瘤細胞遷移能力抑制的效果具有時間和劑量依賴性。半數(shù)致死濃度(0.70 μmol/L)的鴉膽子苦醇處理A549細胞后其遷移能力發(fā)生明顯下降，進一步檢測發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦醇可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)遷移相關(guān)蛋白的表達而影響細胞的遷移。

在腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中腫瘤微血管網(wǎng)絡(luò)的形成對轉(zhuǎn)移的進程起著非常關(guān)鍵的作用。腫瘤中微血管網(wǎng)絡(luò)的存在不僅能夠為腫瘤細胞的生長提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，而且能夠促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移提供必要的通道〔5〕。肺癌組織內(nèi)的微血管極為豐富，造成其更易發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移，這也是目前肺癌治療困難的主要原因之一。因此，研究肺癌腫瘤組織中微血管網(wǎng)絡(luò)的形成機制，并針對其相應的機制采取有效的干預措施，能夠抑制肺癌中微血管網(wǎng)絡(luò)的形成，進而降低肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，從而在一定程度上降低肺癌的死亡率。

本研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦醇能夠下調(diào)細胞中IGFBP-2的表達。IGFBP-2是屬于胰島素樣生長因子家族的蛋白成員之一，能通過與胰島素生長因子(IGF)相互作用而發(fā)揮其生物學功能〔6〕。已有研究證實非小細胞肺癌組織中IGFBP-2的表達有明顯的上調(diào)，而且其與非小細胞肺癌腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)〔7〕。BRF2主要參與RNA聚合酶Ⅲ催化的miRNA的產(chǎn)生。BRF2基因與miRNA的相互關(guān)系決定了其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中所起的重要作用〔8〕。研究表明BRF2基因在肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等過程存在密切的關(guān)系〔9〕。CD151是四跨膜蛋白(TM4SF)家族的成員之一〔10〕，主要參與調(diào)控信號傳導，細胞的激活、發(fā)展、增殖和運動、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移等多種生物學功能〔11，12〕。臨床研究表明，CD151蛋白在多種人類常見的惡性腫瘤中表達水平均有一定上調(diào)，且與這些腫瘤的預后關(guān)系緊密〔13〕。這與本研究發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌A549細胞中CD151蛋白的表達也受鴉膽子苦醇的影響相符合。

綜上所述，鴉膽子苦醇通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達而對非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移能力有明顯的抑制作用。鴉膽子苦醇可以作為潛在的治療非小細胞肺癌的中成藥物，為肺癌的臨床治療提供一定的指導意義。

1Johnson DH，Schiller JH，Bunn PA Jr.Recent clinical advances in lung cancer management〔J〕.J Clin Oncol，2014；32(10)：973-82.

2Rao JS，Gondi C,Chittivelu S,etal.Inhibition of invasion，angiogenesis，tumor growth，and metastasis by adenovirus-mediated transfer of antisense uPAR and MMP-9 in non-small cell lung cancer cells〔J〕.Mol Cancer Ther，2005；4(9)：1399-408.

3Olayanju A，Copple IM，Bryan HK，etal.Brusatol provokes a rapid and transient inhibition of Nrf2 signaling and sensitizes mammalian cells to chemical toxicity—implications for therapeutic targeting of Nrf2〔J〕.Free Radic Biol Med，2015；78(2)：202-12.

4Cuendet M，Gills JJ，Pezzuto JM.Brusatol-induced HL-60 cell differentiation involves NF-kappaB activation〔J〕.Cancer Lett，2004；206(1)：43-50.

5Hanrahan V，Currie MJ，Gunningham SP，etal.The angiogenic switch for vascular endothelial growth factor(VEGF)-A，VEGF-B，VEGF-C，and VEGF-D in the adenoma-carcinoma sequence during colorectal cancer progression〔J〕.J Pathol，2003；200(2)：183-94.

6Park K，Gad E，Goodell V，etal.Insulin-like growth factor-binding protein-2 is a target for the immunomodulation of breast cancer〔J〕.Cancer Res，2008；68(20)：8400-9.

7Lu H，Wang L，Gao W，etal.IGFBP2/FAK pathway is causally associated with dasatinib resistance in non-small cell lung cancer cells〔J〕.Mol Cancer Ther，2013；12(12)：2864-73.

8Cabarcas S，Schramm L.RNA polymerase Ⅲ transcription in cancer：the BRF2 connection〔J〕.Mol Cancer，2011；10(1)：1-10.

9Lockwood WW，Chari R,Coe BP，etal.Integrative genomic analyses identify BRF2 as a novel lineage-specific oncogene in lung squamous cell carcinoma〔J〕.PLoS Med，2010；7(7)：e1000315.

10Caplan M,Kamsteeg EJ,Ouffield A.Tetraspan proteins：regulators of renal structure and function〔J〕.Curr Opin Nephrol Hypertens，2007；16(4)：353-8.

11Levy S，Shoham T.Protein-protein interactions in the tetraspanin web〔J〕.Physiology，2005；20(2)：218-24.

12Fedor B，Elena O.Tetraspanins as regulators of protein trafficking〔J〕.Traffic，2007；8(2)：89-96.

13Yue S，Mu W，Z?ller M.Tspan8 and CD151 promote metastasis by distinct mechanisms〔J〕.Eur J Cancer，2013；49(13)：2934-48.

〔2015-10-12修回〕

(編輯袁左鳴)

The inhibitory effects of brusatol on the migration of human non-small cell lung carcinoma A549 cells and its molecular mechanism

CHEN Guo,LI Wei,LI Xiao-Hui.

Sichuan Provincial People's Hospital,Chengdu 610072,Sichuan,China

ObjectiveTo explore the inhibitory effects of brusatol on the migration of human non-small cell lung carcinoma A549 cells and its molecular mechanism.MethodsReed-Muench method was used to calculate the lethal concentration of 50%(LC50) of brusatol on A549 cell.Transwell method was used to detect the inhibitory effect of A549 cell lines migration after deal with brusatol,and different inhibition rate of migration with different concentration of brusatol.Western blot was used to detect the expression of cell metastasis associated proteins.ResultsThe migration of A549 cell was down-regulated compared with that of control group after dispose with brusatol.Cell metastasis associated proteins BRF2,IGFBP-2 and CD151 were obviously reduced expressions in cell after dispose with brusatol.ConclusionsHrusatol is a potential anticancer drug against the non-small cell lung carcinoma,the further molecular mechanism should be revealed to provide significance guiding for clinical treatment.

Brusatol;Non-small cell lung carcinoma;A549 cell;Migration

國家“973”計劃項目(No.2011CB708133)；四川省科技廳項目(No.2015SZ0042)

李蔚(1966-)，女，主任醫(yī)師，主要從事肺癌、COPD等疾病的治療及機制研究。

陳果(1981-)，女，碩士，主要從事非小細胞肺癌的治療及其相關(guān)機制研究。

R736

A

1005-9202(2016)16-3897-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.012