鐘　錚, 密　霞, 馮衛(wèi)生, 孫德梅*, 甘海峰

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州　450046； 2. 南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京　211800)

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新型Bluco類β-內(nèi)酰胺酶分子探針的合成

鐘錚1, 密霞1, 馮衛(wèi)生1, 孫德梅1*, 甘海峰2

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州450046； 2. 南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京211800)

以2-氰基-6-羥基苯并噻唑為原料,與溴乙醛縮二乙醇縮合制得縮醛后再水解合成中間體6-(2-羰乙基)苯并[d]噻唑-2-甲腈(2)； 7-苯乙酰氨基-3-氯甲基頭孢菌烷酸二苯甲酯依次經(jīng)碘代和Wittig反應(yīng)得(Z)-3-[3-(2-氰基苯并[d]噻唑-6-氧)丙-1-烯]-8-羰基-7-(2-苯乙酰氨基)-5-噻-1-氮[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸二苯甲酯(5); 5經(jīng)脫保護(hù)、縮合和氧化反應(yīng)合成了3個新的Bluco類似物,其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR和HR-MS(ESI)表征。

2-氰基-6-羥基苯并噻唑;β-內(nèi)酰胺酶； 分子探針； Bluco類似物； 合成

報告基因技術(shù)廣泛應(yīng)用于監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)[1-3]。近年來發(fā)展的TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶[4-6](β-lactamase)報告基因技術(shù)可以用于監(jiān)測和示蹤活細(xì)胞和體內(nèi)的生物過程。小分子Bluco是用來檢測β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的一類新型生物熒光分子探針。該分子在細(xì)胞內(nèi)先被β-內(nèi)酰胺酶水解生成D-Luciferin, 而D-Luciferin可被氧化產(chǎn)生生物熒光而被檢測到，從而達(dá)到檢測β-內(nèi)酰胺酶活性的目的[7]。

為改善Bluco在體內(nèi)的穩(wěn)定性，本文以2-氰基-6-羥基苯并噻唑(1)為原料,與溴乙醛縮二乙醇縮合制得縮醛后再水解合成中間體6-(2-羰乙基)苯并[d]噻唑-2-甲腈(2)； 7-苯乙酰氨基-3-氯甲基頭孢菌烷酸二苯甲酯(3)依次經(jīng)碘代和Wittig反應(yīng)得(Z)-3-[3-(2-氰基苯并[d]噻唑-6-氧)丙-1-烯]-8-羰基-7-(2-苯乙酰氨基)-5-噻-1-氮[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸二苯甲酯(5)； 5經(jīng)脫保護(hù)、縮合和氧化反應(yīng)合成了3個新的Bluco類似物——3-【(Z)-3- {2-[(S)-4-羧基-4,5-二氫噻唑-2-基]苯并[d]噻唑-6-氧}丙-1-烯】-8-羰基-7-(2-苯乙酰氨基)-5-噻-1-氮雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸(Bluco-S)， 3-【(Z)-3- {2-[(S)-4-羧基-4,5-二氫噻唑-2-基]苯并[d]噻唑-6-氧}丙-1-烯】-8-羰基-7-(2-苯乙酰氨基)-5-亞砜-1-氮雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸(Bluco-SO1)和3-【(Z)-3- {2-[(S)-4-羧基-4,5-二氫噻唑-2-基]苯并[d]噻唑-6-氧}丙-1-烯】-8-羰基-7-(2-苯乙酰氨基)-5-砜-1-氮雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸(Bluco-SO2)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR和HR-MS(ESI)表征。

Chart 1

Scheme 1

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

TEMP-MELT型熔點儀(溫度未校正)；Bruker AMX-400型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；HP5989A型質(zhì)譜儀。

1(98%), 上海凌凱醫(yī)藥科技有限公司； 3參照文獻(xiàn)[7]制備；溴乙醛縮二乙醇(95%), 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 其余所用試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2合成

(1) 2的合成

在50 mL單口瓶中加入1 1.10 g(6.24 mmol),溴乙醛縮二乙醇4.94 g(24.2 mmol), K2CO31.04 g(7.53 mmol)和DMF 22 mL，攪拌下于110 ℃反應(yīng)4 h。冷卻至室溫，加入乙酸乙酯120 mL 稀釋，依次用1 mol·L-1NaOH溶液和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮得黃色油狀液體。將全部黃色油狀液體,對甲苯磺酸0.12 g(0.62 mmol)及乙醇30 mL加入到50 mL單口瓶中，室溫下反應(yīng)8 h。反應(yīng)液用150 mL二氯甲烷稀釋，依次用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥后真空濃縮，經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑:A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=5 ∶1] 純化得白色固體2 0.62 g，收率45.6%;1H NMRδ：9.90(s, 1H), 8.15(d,J=8.6 Hz, 1H), 7.33～7.27(m, 2H), 4.72(s, 2H); MS(ESI)m/z: 219.1{[M+H]+} 。

(2) 4的合成

在100 mL單口瓶中加入3 2.66 g(5 mmol)、NaI 3.75 g(25 mmol)和無水丙酮30 mL，攪拌下于室溫反應(yīng)1 h。濃縮，殘留物倒入水中，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次用10% Na2S2O3溶液(25 mL)、水、飽和食鹽水洗滌, 無水硫酸鎂干燥，濃縮至體積約35 mL，加入三苯基膦1.57 g(6 mmol)，于室溫反應(yīng)過夜。抽濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌，干燥得季鏻鹽4 3.10 g，收率71.1%(直接用于下一步反應(yīng))。

(3) 5的合成

在250 mL單口瓶中加入4 3.00 g(3.38 mmol)，二氯甲烷90 mL及1 mol·L-1NaOH溶液30 mL，攪拌下于室溫反應(yīng)40 min，分液。有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾，濾液加入2 0.49 g(2.25 mmol)，于室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)液濃縮得粗品，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=5 ∶1)純化得5 0.81 g ，收率52.6%；1H NMRδ： 7.99(d,J=8.7 Hz, 1H), 7.42～7.26(m, 15H), 7.06(d,J=8.7 Hz, 2H), 6.92(s, 1H), 6.30(d,J=11.4 Hz, 1H), 6.01(d,J=9.0 Hz, 1H), 5.88(dd,J=4.8 Hz, 9.0 Hz, 1H), 5.77～5.69(m, 1H), 4.99(d,J=4.8 Hz, 1H), 4.39(dd,J=7.1 Hz, 12.8 Hz, 1H), 4.09(dd,J=4.8 Hz, 12.8 Hz, 1H), 3.66(s, 2H), 3.51～3.24(m, 2H); MS(ESI)m/z: 685.1{[M + H]+} 。

(4) (Z)-3-[3-(2-氰基苯并[d]噻唑-6-氧)丙-1-烯]-8-羰基-7-(2-苯乙酰氨基)-5-噻-1-氮雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸(6)的合成

在50 mL單口瓶中加入5 0.10 g (0.14 mol)和二氯甲烷13 mL，攪拌下于0 ℃下加入茴香醚0.22 mL和TFA 0.55 mL，加畢，于室溫反應(yīng)4 h。反應(yīng)液濃縮，殘留物用乙醚洗滌后干燥得白色固體6 0.056 g，收率77.5 %；1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ：13.65(br s, 1H) , 9.16(d,J=8.4 Hz, 1H), 8.16(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.85(dd,J=2.4 Hz, 9.0 Hz, 1H), 7.34(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.30～7.21(m, 5H), 6.51(d,J=8.7 Hz, 1H), 5.88～5.80(m, 1H), 5.70(dd,J=4.8 Hz, 8.1 Hz, 1H), 5.16(d,J=4.8 Hz, 1H), 4.87～4.68(m, 2H), 3.79～3.61(m, 2H), 3.56～3.47(m, 2H)； MS(ESI)m/z: 519.2{[M + H]+} 。

(5) Bluco-S的合成

在10 mL單口瓶中加入6 120 mg(0.22 mmol)、DMF 4 mL及水1 mL，加入D-Cysteine·HCl·H2O 96 mg(0.54 mmol)、碳酸氫鈉69 mg(0.82 mmol)，攪拌下于室溫反應(yīng)40 min。過濾，濾液用1 mol·L-1鹽酸調(diào)至pH 1，過濾，固體用DMF 1 mL溶解，滴入乙醚20 mL，滴畢(析出固體)，過濾，濾餅干燥得Bluco-S 120 mg，收率85%；1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ： 13.60～13.16(m, 2H), 9.15(d,J=8.1 Hz, 1H), 8.06(d,J=9.3 Hz, 1H), 7.96(s, 1H), 7.72(s, 1H), 7.37～7.19(m, 6H), 6.50(d,J=12.3 Hz, 1H), 5.87～5.68(m, 2H), 5.43(t,J=8.9 Hz, 1H), 5.17(t,J=4.8 Hz, 1H), 4.84～4.68(m, 2H), 3.82～3.48(m, 5H);13C NMRδ： 174.6, 170.1, 165.5, 163.3, 161.9, 155.9, 154.2, 143.2, 136.8, 134.9, 133.7, 132.1, 128.4, 128.3, 126.5, 126.3, 122.1, 120.6, 112.1, 103.4, 78.7, 65.6, 56.8, 55.2, 38.7, 33.1, 26.4; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C29H25N4O7S3{[M + H]+} 637.088 5, found 637.089 2。

(6) Bluco-SO1的合成

在單口瓶中加入Bluco-S 89 mg(0.14 mmol)和二氯甲烷4 mL，攪拌下0 ℃滴加m-CPBA 55 mg (0.22 mmol)的二氯甲烷(4 mL)溶液，滴畢，繼續(xù)反應(yīng)0.5 h。反應(yīng)液用二氯甲烷(60 mL)稀釋，依次用10% Na2S2O3溶液和飽和食鹽水洗滌, 無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮得粗品，經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑:B=V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)= 30 ∶1～10 ∶1]純化得Bluco-SO172 mg。

用類似方法合成Bluco-SO2128 mg。

Bluco-SO1： 收率78.8%;1H NMRδ： 13.80～13.20(m, 2H)， 8.49(d,J=8.4 Hz, 1H), 8.06(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.95(s, 1H), 7.69(s, 1H), 7.31～7.19(m, 6H), 6.52(d,J=12.0 Hz, 1H), 5.89～5.79(m, 2H), 5.43(t,J=9.0 Hz, 1H), 4.93(d,J=4.2 Hz, 1H), 4.86～4.67(m, 2H), 3.99(d,J=18.0 Hz, 1H), 3.82～3.52(m, 5H);13C NMRδ： 174.5, 170.1, 165.7, 163.3, 161.9, 155.9, 154.2, 143.2, 136.8, 134.9, 133.7, 132.1, 128.4, 128.3, 126.5, 126.3, 122.1, 120.6, 112.1, 103.4, 78.7, 65.8, 65.6, 61.1, 41.7, 38.7, 3.2; HR-ESI-MSm/z: Calcd for C29H25N4O8S3{[M+H]+} 653.083 5, found 653.084 4。

Bluco-SO2： 收率約92.2 %;1H NMRδ: 13.85(br s, 1H), 13.25(br s, 1H), 8.95(s, 1H), 8.06(s, 1H), 7.96(s, 1H), 7.71(s, 1H), 7.59～7.19(m, 6H), 6.42(s, 1H), 5.94～5.82(m, 2H), 5.41(d,J=9.3 Hz, 2H), 4.88～4.73(m, 2H), 4.44～4.26(m, 2H), 3.81～3.60(m, 3H);13C NMRδ： 174.6, 170.1, 165.7, 163.3, 161.9, 155.9, 154.2, 143.2, 136.8, 134.9, 133.7, 132.1, 128.4, 128.3, 126.5, 126.3, 122.1, 120.6, 112.1, 103.4, 78.7, 77.6, 65.2, 55.1, 50.2, 38.7, 33.2; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C29H25N4O9S3{[M+H]+} 669.078 4, found 669.078 9。

2　結(jié)果與討論

2.12的合成

在2的合成中，使用縮醛保護(hù)的溴乙醛作烷基化試劑，避免了醛基被空氣氧化；當(dāng)堿為NaOH和NaH時均不反應(yīng)，而碳酸鉀能取得較好收率(兩步合并收率45.6%)，可能是氰基對強(qiáng)堿不穩(wěn)定所致；使用DMF作溶劑效果優(yōu)于乙腈和丙酮。

2.25的合成

在5的合成中，用甲醇鈉和NaH作堿, 收率均非常低，原因可能是二苯甲基對強(qiáng)堿不穩(wěn)定。改用1 mol·L-1的 NaOH溶液后順利完成反應(yīng)。

2.3Bluco-S的合成

在Bluco-S的合成中，室溫條件下在DMF-H2O中反應(yīng)能夠很快發(fā)生，收率最高達(dá)到85%；而升溫至60 ℃時副產(chǎn)物明顯增加；0 ℃時則反應(yīng)時間明顯延長，水解副產(chǎn)物增加，收率降低。使用乙醇為溶劑在室溫下反應(yīng)，有新的副產(chǎn)物出現(xiàn)，可能是乙醇在堿性條件下親核性較強(qiáng)與氰基反應(yīng)，收率降低。

2.4Bluco-SO1和Bluco-SO2的合成

控制間氯過氧苯甲酸的用量和反應(yīng)時間可以選擇性地合成Bluco-SO1或Bluco-SO2。通過對氧化劑用量的優(yōu)化比較(1.4 eq., 1.5 eq., 1.6 eq., 1.7 eq.)，發(fā)現(xiàn)0 ℃條件下，1.6 eq.的氧化劑在0.5 h時原料Bluco-S能恰好完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物Bluco-SO1收率最高，而過度氧化物砜最少。將間氯過氧苯甲酸用量增大至2.3 eq.，同時延長反應(yīng)時間，得到充分氧化物砜Bluco-SO2。

3　結(jié)論

為改善β-內(nèi)酰胺酶分子探針Bluco在體內(nèi)的生物穩(wěn)定性，本文合成了三個Bluco類新化合物。該合成路線條件溫和，操作簡單、收率高，為β-內(nèi)酰胺酶檢測分子探針研究及Bluco化合物的合成提供了重要參考。

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Synthesis of Newβ-Lactamase Molecular Probe Bluco Analogues

ZHONG Zheng1,MI Xia1,FENG Wei-sheng1,SUN De-mei1*,GAN Hai-feng2

(1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China;2. School of bio & pharma engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211800, China)

6-(2-Oxoethoxy)benzo[d]thiazole-2-carbonitrile(2)was prepared by condensation of 2-cyano-6-hydroxy benzothiazole(1) and 2-bromo-1,1-diethoxyethane and then hydrolytic reaction. (6R,7R,Z)-benzhydryl 7-benzamido-3-[3-(2-cyanobenzo[d]thiazol-6-yloxy)prop-1-enyl]-8-oxo-5-thia-1-aza-bicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate(5) was synthesized by iodination and Wittig reaction from(6R,7R)-benzhydryl 7-benzamido-3-(chloromethyl)-8-oxo-5-thia-1-aza-bicyclo [4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate. Three novel analogues of Bluco were synthesized by deprotection, condensation and oxidation reactions from 5. The structures were characterized by1H NMR，13C NMR and HR-MS(ESI).

2-cyano-6-hydroxy benzothiazole;β-lactamase; molecular probe; Bluco analogues; synthesis

2016-06-06

鐘錚(1980-)，男，漢族，河南新鄉(xiāng)人，博士，主要從事藥物合成與合成方法學(xué)的研究。

孫德梅，高級實驗師， E-mail: sam_zhong@yeah.net

O621.3

ADOI： 10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.09.16139