黃　鑫　季　倩　陳瑞兵　何　德　張　磊

(1. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2. 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

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燈盞花發(fā)根培養(yǎng)條件篩選研究

黃鑫1,2季倩2陳瑞兵2何德1張磊1,2

(1. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2. 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

為建立燈盞花的發(fā)根培養(yǎng)體系，用C58C1發(fā)根農(nóng)桿菌空菌株和攜帶目的基因的菌株轉(zhuǎn)化燈盞花葉片獲得發(fā)根，測(cè)定發(fā)根的生長(zhǎng)曲線，比較不同因素對(duì)發(fā)根生長(zhǎng)量的影響。結(jié)果表明：利用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1菌株成功從燈盞花中誘導(dǎo)出了發(fā)根，并建立了燈盞花發(fā)根最優(yōu)的培養(yǎng)體系，其誘導(dǎo)的最佳農(nóng)桿菌菌液濃度為OD600=0.6，最佳浸染時(shí)間為10 min，最佳共培養(yǎng)時(shí)間為2 d，在此條件下誘導(dǎo)率高達(dá)60%。經(jīng)PCR鑒定證明Ri質(zhì)粒的T-DNA已成功轉(zhuǎn)化燈盞花的發(fā)根。

發(fā)根農(nóng)桿菌；誘導(dǎo)率；遺傳轉(zhuǎn)化體系；燈盞花；培養(yǎng)基

燈盞花 (Erigeronbreviscapus) 又名燈盞細(xì)辛、短葶飛蓬，為菊科飛蓬屬多年生草本藥用植物，全草入藥。其主要有效成分為燈盞乙素，又名野黃芩苷[1]。燈盞乙素具有舒張血管、改善微循環(huán)、抑制血小板及紅細(xì)胞聚集，治療冠心病、心絞痛、腎衰和高血脂癥等疾病，具多種作用[2-4]。但是作為云南最有發(fā)展前景的藥物之一，卻面臨著因?yàn)E采濫挖及種質(zhì)退化導(dǎo)致資源緊缺的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[5-7]。因此，從處于代謝節(jié)點(diǎn)處的關(guān)鍵基因著手，改善燈盞花的種質(zhì)，提高燈盞花素的含量成為亟待解決的問(wèn)題。

目前，燈盞花種質(zhì)資源的改善主要依靠人工栽培馴化，馴化改善的燈盞花品種中有效成分燈盞乙素雖然可達(dá)1.053%～2.628%[8]，但仍有很大提升空間，而且還面臨著種質(zhì)很容易退化的嚴(yán)重問(wèn)題。植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化是植物基因工程的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。以發(fā)根農(nóng)桿菌 (Agrobacteriumrhizogenes) Ri質(zhì)粒為載體可將植物次生代謝物合成關(guān)鍵酶基因整合到植物基因組中并表達(dá)，從而達(dá)到穩(wěn)定改良植物性狀、提高次生代謝物含量的目的[9]。發(fā)根體系具有操作過(guò)程簡(jiǎn)便，遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因材料等優(yōu)勢(shì)，發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

植物次生代謝工程技術(shù)的應(yīng)用已在多種植物中取得成果，如將矮牽牛 (Petuniahybrida) 中黃酮代謝途徑中的查爾酮異構(gòu)酶基因CHI導(dǎo)入西紅柿中并過(guò)量表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因西紅柿中果皮黃酮醇含量提高了78倍[10]。過(guò)量表達(dá)莨菪類生物堿合成的關(guān)鍵酶基因PMT和H6H，成功將莨菪轉(zhuǎn)基因發(fā)根中東莨菪堿的含量提高了9倍[11]。過(guò)表達(dá)丹參JAs合成途徑中的關(guān)鍵酶基因AOC、AOS和JMT，顯著提高了丹參發(fā)根中丹參酮ⅡA的含量[12]。過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵酶基因PLR成功提高了菘藍(lán)發(fā)根中落葉松脂素的含量[13]等。而對(duì)于燈盞花，目前尚無(wú)建立遺傳轉(zhuǎn)化體系的報(bào)道。

本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒成功地從燈盞花葉片誘導(dǎo)出發(fā)根，初步建立了最適燈盞花發(fā)根培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步利用遺傳代謝工程手段調(diào)節(jié)燈盞花次生代謝物含量提供了可行方法，以期用此方法部分替代野生資源，減輕濫采濫挖現(xiàn)狀及解決種質(zhì)退化問(wèn)題。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料來(lái)源

供試燈盞花種子由西南林業(yè)大學(xué)劉江華教授提供，農(nóng)桿菌C58C1由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院保存。

1.1.2試劑

試驗(yàn)用到的HgCl2，MS、B5、YEB等培養(yǎng)基，蔗糖，瓊脂，瓊脂糖凝膠，頭孢、潮霉素、利福平等抗生素，各試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭olB、rolC基因引物由蘇州金唯智生物公司合成。PCR反應(yīng)的rTaqDNA 聚合酶Mix購(gòu)自Takara生物公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1植物材料處理

燈盞花種子用0.1%升汞浸泡10 min消毒，無(wú)菌水沖洗3～5次，滅菌吸水紙吸除殘留水分。將滅菌種子播種到MS固體空白培養(yǎng)基上，置于4 000 lx、16 h日光照，25 ℃條件下培養(yǎng)。種子3～5 d后開(kāi)始發(fā)芽，大約15 d后長(zhǎng)出無(wú)菌實(shí)生苗，45～60 d長(zhǎng)成可供剪取葉盤的燈盞花無(wú)菌苗。

1.2.2發(fā)根農(nóng)桿菌菌株活化

取-80 ℃凍存的C58C1菌液，于含40 mg/L利福平 (Rif) 的YEB平板上劃線，28 ℃恒溫暗培養(yǎng)2 d。挑取單菌落于1 mL YEB (含40 mg/L Rif) 液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)12～16 h。取活化的C58C1菌液200 μL加入到30 mL YEB (40 mg/L Rif) 液體培養(yǎng)基中28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600分別為0.4、0.6、0.8。常溫下，5 000 r/min離心10 min，去上清，分別加30 mL B5、1/2B5、1/2MS、MS (均含100 μmol/L乙酰丁香酮) 液體培養(yǎng)基重懸菌體，28 ℃，100 r/min振蕩孵育30 min，用以浸染葉盤。最后統(tǒng)計(jì)分析不同濃度的菌液對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。

1.2.3葉盤法轉(zhuǎn)化

將燈盞花無(wú)菌苗葉片剪成約0.5 cm2大小的葉盤，分別置于B5、1/2B5、1/2MS、MS固體空白培養(yǎng)基上25 ℃恒溫暗培養(yǎng)2 d (預(yù)培養(yǎng))。將部分葉盤不作農(nóng)桿菌浸染處理，以作對(duì)照。其余預(yù)培養(yǎng)后的葉盤分別放入制備好的OD600為0.4、0.6、0.8的3種濃度的農(nóng)桿菌菌液中，分別浸染5、10、15 min，撈出后吸干殘留菌液。再分別放回預(yù)培養(yǎng)時(shí)的B5、1/2B5、1/2MS、MS固體培養(yǎng)基，25 ℃，分別無(wú)光恒溫共培養(yǎng)0、1、2、3 d。之后將共培養(yǎng)的葉盤對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)到含500 mg/L頭孢噻污鈉 (Cef) 的B5、1/2B5、1/2MS、MS固體培養(yǎng)基，25 ℃無(wú)光恒溫除菌培養(yǎng)10～15 d后，一般可看到葉盤邊緣傷口處有發(fā)根長(zhǎng)出，待發(fā)根長(zhǎng)至2～3 cm后將其剪下，分別對(duì)應(yīng)在新的含500 mg/L Cef及10 mg/L潮霉素B (Hyb) 的B5、1/2B5、1/2MS、MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌篩選培養(yǎng)，每15～20 d更換1次培養(yǎng)基。每更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)基其他成分不變，抗生素Cef濃度按500 mg/L → 300 mg/L → 100 mg/L → 0 mg/L階梯性降低，直至除菌完全。

最后統(tǒng)計(jì)比較不同菌液濃度 (處理A—OD600=0.4；B—處理OD600=0.6；C—處理OD600=0.8)、不同浸染時(shí)間 (處理a—5 min；處理b—10 min；處理c—15 min) 和不同共培養(yǎng)時(shí)間 (處理1—0 d；處理2—1 d；處理3—2 d；處理4—3 d) 對(duì)葉盤發(fā)根誘導(dǎo)率、葉盤死亡率及染菌率等的影響，從而得出燈盞花發(fā)根最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)條件。

1.2.4發(fā)根鑒定

取在除菌篩選培養(yǎng)基上仍生長(zhǎng)良好的發(fā)根約100 mg，采用CTAB法提取總DNA，以總DNA為樣品模板，同時(shí)以C58C1菌為陽(yáng)性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)化根DNA為陰性對(duì)照，PCR鑒定毛狀根總DNA中是否含發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1 Ri質(zhì)粒的rolB和rolC基因：1) primers forrolB:rolB-F: 5′-CGA GGG GAT CCG ATT TGC TT-3′；rolB-R: 5′-GAC GCC CTC CTC GCC TTC CT-3′。2) primers forrolC:rolC-F: 5′-TCG CCA TGC CTC ACC AAC TCA C-3′；rolC-R: 5′-CCT TGA TCG AGC CGG GTG AGA A-3′。3) 反應(yīng)體系 (20 μL)：ddH2O 7 μL, Template DNA 1 μL, Forward Primer (10 μmol/L) 1 μL，Reverse Primer (10 μmol/L) 1 μL, 2 × rTaq PCR SuperMix 10 μL。4) PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。凝膠成像系統(tǒng)下觀察DNA條帶。

1.2.5液體振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)

選取除菌完全且鑒定為陽(yáng)性的發(fā)根，剪取約300 mg，分別放入裝有200 mL B5、1/2B5、1/2MS、MS液體培養(yǎng)基的三角瓶，置于搖床上，25 ℃避光，100 r/min振蕩培養(yǎng)，每周更換1次培養(yǎng)基并稱質(zhì)量，比較不同培養(yǎng)基對(duì)發(fā)根生長(zhǎng)速率的影響。

2　結(jié)果與分析

結(jié)果顯示，對(duì)照組未經(jīng)農(nóng)桿菌浸染誘導(dǎo)處理的葉盤也有極少部分長(zhǎng)出了不定根。燈盞花發(fā)根誘導(dǎo)流程見(jiàn)圖1。經(jīng)農(nóng)桿菌浸染處理的試驗(yàn)組葉盤，因培養(yǎng)條件不同，表現(xiàn)出了不同的誘導(dǎo)率。具體誘導(dǎo)率見(jiàn)表1。

A. 葉盤預(yù)培養(yǎng); B. 誘導(dǎo); C. 除菌篩選培養(yǎng); D. 液培

圖1燈盞花發(fā)根誘導(dǎo)流程

Fig.1　The flow chart of hairy root induction of Erigeron breviscapus

注：為方便統(tǒng)計(jì)，表中所述長(zhǎng)出發(fā)根的葉盤數(shù)是指凡是葉盤邊緣長(zhǎng)出了根的葉盤的數(shù)量，這些根不一定是發(fā)根，因此，誘導(dǎo)率也并不一定是陽(yáng)性誘導(dǎo)率；死亡和染菌嚴(yán)重的葉盤數(shù)指培養(yǎng)過(guò)程中黃化死亡未能長(zhǎng)出發(fā)根的，及雖長(zhǎng)出了發(fā)根但染菌嚴(yán)重，無(wú)法脫菌完全的葉盤總數(shù)。

2.1發(fā)根的鑒定

按上述發(fā)根鑒定方法對(duì)脫菌完全的發(fā)根提取DNA進(jìn)行PCR鑒定，其中對(duì)照組絕大部分在除菌篩選培養(yǎng)時(shí)已黃化死亡，少數(shù)存活的不定根PCR鑒定也均不含rolB、rolC基因，因此不是發(fā)根。試驗(yàn)組則大部分是有rolB、rolC基因的陽(yáng)性發(fā)根。PCR鑒定結(jié)果如圖2。陽(yáng)性發(fā)根則于液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。

M: T-2000 DNA Maker; N: 陰性對(duì)照; P: 陽(yáng)性對(duì)照; 1～10: 樣品

圖2發(fā)根中rolB、rolC基因PCR鑒定結(jié)果

Fig.2The PCR detection ofrolBandrolCin transformed hairy root

2.2菌液濃度對(duì)發(fā)根誘導(dǎo)率的影響

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，菌液濃度是否適當(dāng)是轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵問(wèn)題之一。若菌液濃度過(guò)低，可能會(huì)使農(nóng)桿菌無(wú)法有效侵染葉盤而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率過(guò)低；若菌液濃度過(guò)高，則可能造成侵染過(guò)度或菌體產(chǎn)生代謝物對(duì)植物細(xì)胞造成傷害而導(dǎo)致葉盤死亡。此外，如果濃度過(guò)高，可能使農(nóng)桿菌在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上也會(huì)生長(zhǎng)過(guò)旺，導(dǎo)致后續(xù)的脫菌培養(yǎng)無(wú)法進(jìn)行。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌液濃度的OD600值為0.4時(shí)，誘導(dǎo)率普遍較低，甚至未能成功誘導(dǎo)出陽(yáng)性發(fā)根；菌液濃度在OD600值為0.8時(shí)雖然轉(zhuǎn)化率較高，但外植體死亡率或染菌率也高，發(fā)根后續(xù)脫菌培養(yǎng)過(guò)程難以抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，造成無(wú)法液培。而OD600為0.6時(shí)，整體上誘導(dǎo)率相對(duì)較高，外植體死亡率較低，且基本不影響后續(xù)的脫菌培養(yǎng)及液培。因此綜合取OD600=0.6為最佳菌液濃度。

2.3浸染時(shí)間對(duì)發(fā)根誘導(dǎo)率的影響

農(nóng)桿菌菌液浸染葉盤的時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率有很大影響。若浸染時(shí)間太短，可能農(nóng)桿菌未能成功侵入葉盤細(xì)胞而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失??；若浸染時(shí)間太長(zhǎng)，則農(nóng)桿菌容易對(duì)葉盤造成過(guò)度傷害而使葉盤黃化死亡。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌液濃度較低時(shí)，浸染時(shí)間越長(zhǎng)，則整體上誘導(dǎo)率越高，但葉盤死亡率或染菌率也隨之增高；菌液濃度較高時(shí)，浸染時(shí)間在10 min以內(nèi)，誘導(dǎo)率隨浸染時(shí)間的增加而整體呈增加的趨勢(shì)，但浸染時(shí)間達(dá)15 min時(shí)，則因葉盤大量黃化死亡而導(dǎo)致誘導(dǎo)率直線下降。因此，綜合取浸染時(shí)間為10 min最佳。

2.4共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)根誘導(dǎo)率的影響

浸染后共培養(yǎng)的目的，是使葉盤表面的農(nóng)桿菌充分侵入細(xì)胞。因此，共培養(yǎng)時(shí)間也是影響誘導(dǎo)率的重要因素。試驗(yàn)表明，菌液濃度較低，浸染時(shí)間較短時(shí)，0～3 d內(nèi)，共培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，誘導(dǎo)率基本就越高，但同樣存在隨共培養(yǎng)時(shí)間增加，葉盤死亡率和染菌率也增高的問(wèn)題；而菌液濃度較高，浸染時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，共培養(yǎng)時(shí)間在0～2 d時(shí)，誘導(dǎo)率整體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但超過(guò)2 d，則轉(zhuǎn)化率不會(huì)再顯著升高，甚至反而會(huì)因?yàn)檫^(guò)度生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌抑制植物細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，造成葉盤死亡率急劇升高，或者因脫菌不完全而導(dǎo)致無(wú)法液培。因此，共培養(yǎng)時(shí)間以2 d為最好。

2.5不同液體培養(yǎng)基對(duì)發(fā)根生長(zhǎng)速率的影響

發(fā)根脫菌完全后，轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。在上述4種不同的液體培養(yǎng)基中，發(fā)根生長(zhǎng)速率不同，總體上是B5>1/2MS≈1/2B5>MS。在含200 mL B5液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，發(fā)根整個(gè)生長(zhǎng)周期為60～70 d，其中前3周，發(fā)根生長(zhǎng)速率極慢，基本看不到明顯的生長(zhǎng)現(xiàn)象，第4周開(kāi)始表現(xiàn)出較快的生長(zhǎng)速率，在第5～7周生長(zhǎng)速率達(dá)到最快，在第8～9周以后生長(zhǎng)基本進(jìn)入停滯期，10周之后發(fā)根開(kāi)始變硬，部分根尖開(kāi)始褐化。不同培養(yǎng)基生長(zhǎng)速率比較如圖3。

圖3發(fā)根在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率

Fig.3The growth rate of hairy roots in different liquid mediums

3　結(jié)論與討論

本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1菌株侵染燈盞花葉片，成功誘導(dǎo)出毛狀根。同時(shí)，通過(guò)對(duì)菌液濃度、浸染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間3個(gè)影響因素的試驗(yàn)，優(yōu)化了燈盞花發(fā)根的誘導(dǎo)條件。

結(jié)果顯示農(nóng)桿菌菌液濃度直接影響發(fā)根誘導(dǎo)效率，燈盞花發(fā)根誘導(dǎo)的最佳菌液濃度為OD600=0.6，李景濱等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，金鐵鎖 (Psammosilenetunicoides) 毛狀根誘導(dǎo)的最佳菌液濃度為OD600=0.8；農(nóng)桿菌對(duì)葉盤的浸染時(shí)間是遺傳轉(zhuǎn)化中的重要因素，燈盞花最佳浸染時(shí)間為10 min，黃偉劍等[15]的研究表明，廣藿香 (Pogostemoncablin) 毛狀根誘導(dǎo)的最佳浸染時(shí)間為25 min；共培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短也與轉(zhuǎn)化效率密切相關(guān)，適于燈盞花發(fā)根誘導(dǎo)的共培養(yǎng)時(shí)間為2 d，劉連旺等[16]的研究顯示，適于地黃 (Rehmanniaglutinosa) 毛狀根誘導(dǎo)的最佳共培養(yǎng)時(shí)間為4 d。由此可見(jiàn)不同植物對(duì)農(nóng)桿菌敏感性不同，因此選擇合適的菌液濃度、浸染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間有助于提高誘導(dǎo)率。另外，燈盞花發(fā)根擴(kuò)大培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為B5液體培養(yǎng)基。

本研究初步建立了燈盞花發(fā)根遺傳轉(zhuǎn)化體系。隨著對(duì)植物中次生代謝途徑了解的深入，基因克隆和高效遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的發(fā)展，利用遺傳代謝工程手段在植物細(xì)胞工廠大量生產(chǎn)有藥理活性的次生代謝化合物已成為可能。如果將燈盞花中燈盞乙素代謝途徑中催化速率限制步驟的關(guān)鍵酶基因采用代謝工程的方法在燈盞花植物體或發(fā)根中過(guò)量表達(dá)，則理論上也可以提高燈盞乙素的含量。

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[16]劉連旺, 張永清, 李先恩, 等. 地黃毛狀根的誘導(dǎo)及優(yōu)化[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 47(1): 47-50.

(責(zé)任編輯張坤)

Establishment of Hairy Root Culture ofErigeronbreviscapus

Huang Xin1,2, Ji Qian2, Chen Ruibing2, He De1, Zhang Lei1,2

(1. College of Life Sciences, Southwest Forestry University, Kunming Yunnan 650224, China;2. Department of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

To establish the cultural system for hairy root ofErigeronbreviscapusroot ofE.breviscapuswas obtained from leaf explants after infected withAgrobacteriumrhizogenesC58C1 strains, determine the growth curve of hairy roots, and compared the effect of hairy roots increment by different factors. The results showed that the hairy root ofE.breviscapuswas successfully induced by usingA.rhizogenesstrain C58C1, and the best system of hairy root culture was established. The best concentration ofA.rhizogenesliquid is OD600=0.6, the best infection time is 10 min, and the best co-culture time is 2 d. These conditions allow the inducement rate was 60%. The transformation of T-DNA from Ri plasmid to the hairy root was confirmed by PCR analysis.

Agrobacteriumrhizogenes, induction rate, genetic transformation system,Erigeronbreviscapus, culture medium

10. 11929/j. issn. 2095-1914. 2016. 05. 004

2016-02-02

張磊 (1977—)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。Email: leizhang100@163.com。

S723.1

A

2095-1914(2016)05-0021-06

第1作者：黃鑫 (1990—)，男，碩士生。研究方向：藥用植物次生代謝工程。Email: huangxin6635@qq.com。