邱先鑫，蘇凱麒，田玉蘭，鄒瞿超，方佳如，李　蓉，王　平*

（1.浙江大學(xué)生物傳感器國家專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生儀學(xué)院，杭州310027；2.中科院傳感技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200050）

現(xiàn)場快速檢測大田軟海綿酸的傳感器與儀器的研究*

邱先鑫1，2，蘇凱麒1，田玉蘭1，鄒瞿超1，方佳如1，李蓉1，王平1，2*

（1.浙江大學(xué)生物傳感器國家專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生儀學(xué)院，杭州310027；2.中科院傳感技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200050）

研究并建立針對大田軟海綿酸OA（okadaic acid）快速、有效的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）定量檢測方法，制備了定量檢測試劑盒-生物酶傳感器，并研發(fā)配套的現(xiàn)場快速檢測儀器-仿生電子眼（Bionic e-Eye），實(shí)現(xiàn)對OA的快速檢測。對標(biāo)準(zhǔn)樣品的參數(shù)進(jìn)行測定，該OA試劑盒的檢測限為0.19 μg/L，檢測范圍為0.2 μg/L～5 μg/L；樣品回收率為75%～125%，精密度在±15%以內(nèi)。將Bionic e-Eye的檢測結(jié)果和酶標(biāo)儀及高效液相色譜HPLC（high performance liquid chromatog?raphy）所測數(shù)據(jù)的結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，Bionic e-Eye的性能與酶標(biāo)儀的檢測結(jié)果一致。此外，該儀器可以直接得出檢測結(jié)果，不需要人工計(jì)算處理，適用于現(xiàn)場的快速檢測，將是一種新的現(xiàn)場快速定量檢測OA的技術(shù)手段。

生物傳感器；大田軟海綿酸；仿生電子眼；試劑盒；ELISA

EEACC：7230Jdoi：10.3969/j.issn.1004-1699.2016.05.001

大田軟海綿酸（OA）是由鰭藻和原甲藻產(chǎn)生的一種脂溶性的海洋生物毒素。不同種類貝類通過食用海洋藻類實(shí)現(xiàn)了生物毒素在貝類中的富集。這種毒素被不同種類貝類食用，雖然該毒素不影響貝類，但人類在食用受污染的貝類后，會引起腹瀉性貝類中毒（DSP）和胃腸道紊亂。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，OA已經(jīng)被證明了具有致癌性，致突變和免疫毒性。歐盟委員會（EC）規(guī)定貝肉中的最大濃度不超過160 μg/kg（EC號853/2004 15）［1-4］。小鼠生物法曾被作為測定OA的標(biāo)準(zhǔn)方法。但其選擇性和精度較低且涉及到倫理問題，于2011年1月已被禁止。Stengel團(tuán)隊(duì)［5］采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法和Steve團(tuán)隊(duì)［6］采用的HPLC-熒光方法靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，但設(shè)備非常昂貴、耗時(shí)、也需要熟練的操作人員，且對樣品前處理有較高要求，不利于將其發(fā)展為現(xiàn)場檢測技術(shù)。柳其芳［7］和Sassolas等人［8］采用酶標(biāo)儀配合ELISA方法被用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的OA毒素濃度評估，但其體積較大，速度較慢，數(shù)據(jù)后處理復(fù)雜，也不適合樣品的現(xiàn)場快速檢測和篩選。其他技術(shù)如細(xì)胞傳感器等也被用于貝類毒素的檢測，但也不利于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測［9-12］。因此迫切需要高度敏感的方法來實(shí)現(xiàn)快速檢測貝肉中的OA毒素。本文研究并建立針對大田軟海綿酸快速、有效的ELISA定量檢測方法，其中包括制備針對OA的定量檢測試劑盒-生物酶傳感器，并且基于生物酶傳感器設(shè)計(jì)一種OA毒素的現(xiàn)場檢測系統(tǒng)，即Bionic e-Eye。該Bionic e-Eye系統(tǒng)以移動(dòng)終端作為分析平臺，開發(fā)了iPlate數(shù)據(jù)處理軟件，具有通量高、速度快、操作簡單、便攜等特點(diǎn)［13］。本文將介紹該系統(tǒng)的原理和組成，并且通過和酶標(biāo)儀及商用試劑盒比較及毒素檢測實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證系統(tǒng)的可行性。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

大田軟海綿酸（OA）；牛血清白蛋白（BSA）；碳二亞胺（EDC）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）；乙醇；大田軟海綿酸單克隆抗體；辣根過氧化物酶；3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）；磷酸鹽緩沖液（PBS）；碳酸鹽緩沖液；Tween 20；二甲基亞砜（DMSO），Beacon Okadaic Acid試劑盒。透析袋；渦旋振蕩儀；磁力攪拌器；酶標(biāo)儀；Bionic e-Eye；超純水機(jī)，電子天平。

1.2系統(tǒng)原理

將合成的OA-BSA偶聯(lián)體包被在多孔板上，OA-BSA與加入的OA標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品競爭性結(jié)合HRP標(biāo)記的OA單克隆抗體，OA濃度越高，OA-BSA競爭性結(jié)合的OA抗體-HRP越少，因此HRP催化發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物越少，顯藍(lán)色越淺，反之，則顯藍(lán)色越深，加入終止液后，溶液顯黃色，這樣就形成了濃度依賴的顏色梯度，根據(jù)儀器檢測數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算出待測樣品的濃度。

在智能手機(jī)的基礎(chǔ)上，我們開發(fā)了基于試劑盒-酶傳感器的比色系統(tǒng)Bionic e-Eye儀器，由智能手機(jī)或pad平板終端（iPhone 4s或iPad 3）作為檢測儀器和一個(gè)暗箱構(gòu)成，暗箱中內(nèi)嵌廣角鏡頭，并用一塊低功耗冷光片用來提供光源。圖1為該系統(tǒng)檢測過程，將96孔微孔板放置在箱內(nèi)多孔板裝載臺上，位置于冷光片上，通過手機(jī)后置相機(jī)Bionic e-Eye攝像頭捕獲到檢測圖像，然后系統(tǒng)通過提取的待測物的顏色分量值，并選用檢測分析性能最好的顏色通道建立內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測物的濃度并直接顯示在自制App-iPlate軟件界面上。Bionic e-Eye的圖像處理算法用到和人類視覺系統(tǒng)相似的色調(diào)，飽和度和亮度（HSV，也稱為六角錐體模型）顏色模型來進(jìn)行圖像處理。iPlate采用Objective-C語言進(jìn)行開發(fā)iPlate軟件。在高通量的檢測中，Bionic e-Eye采用光學(xué)圖像檢測具有高通量同時(shí)檢測的性質(zhì)，且光學(xué)圖像檢測具有同時(shí)和同步性，且iPlate無需借用計(jì)算機(jī)等進(jìn)行線下處理，所以非常適用于現(xiàn)場檢測。而酶標(biāo)儀通過機(jī)械結(jié)構(gòu)達(dá)到高通量的檢測是異步的。高通量同時(shí)檢測比異步檢測具有更高的準(zhǔn)確性。因此，Bionic e-Eye在臨床應(yīng)用、工業(yè)質(zhì)量控制、環(huán)境監(jiān)測、和食品評估領(lǐng)域?qū)⑹抢硐氲谋壬珯z測設(shè)備。

圖1　基于試劑盒的現(xiàn)場檢測系統(tǒng)原理圖

1.3方法

1.3.1包被抗原OA-BSA的制備

取OA粉劑溶解于DMSO中，然后加入碳二亞胺（EDC）以及N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）（溶解在MES（pH=5.5）），室溫振蕩500 r/min，2 h。將BSA溶液（溶解在0.01 mol/L PBS緩沖液（pH=7.2～7.4）中）逐滴加入上述活化的OA溶液中，離心管震蕩速度為1 000 r/min，反應(yīng)4 h。將上述合成的OA-BSA加入到經(jīng)前處理后的透析袋中，置于燒杯中透析，透析液為上述PBS，每隔8 h換一次透析液，共4次。之后將透析袋內(nèi)的液體吸出，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2OA-BSA、HRP-抗體最佳稀釋比例的確定

用直接非競爭ELISA法作棋盤滴定，包被抗原OA-BSA按1∶200、1∶300和1∶400稀釋，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)孔，空白組加入1 μg/mL的OA溶液。HRP-抗體溶液，稀釋比例為1∶2 000，1∶3 000，1∶4 000，用競爭性ELISA方法作標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇OA-BSA的最佳稀釋比例和酶標(biāo)記抗體的最佳稀釋比例。

1.3.3試劑盒的制備與儲存

用最佳OA-BSA和HRP-抗體稀釋比例，向多孔板中加入100 μL最優(yōu)稀釋比例OA-BSA，室溫下孵育1 h。3次洗板后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的BSA封閉液進(jìn)行封閉，室溫封閉1 h，三次洗板后，4℃密封干燥保存。試劑盒中還包括上述PBST溶液、HRP-抗體溶液、TMB底物，終止液HCl。將試劑盒密封4℃保存，即得到大田軟海綿酸試劑盒。

1.3.4試劑盒的使用方法

向試劑盒中的多孔板中第1列每孔加入100 μLOA標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為（0、0.2、0.5、1、2、5）μg/L，向其它列加入其它濃度或者待測OA樣品溶液，然后加入50 μL HRP-抗體溶液，室溫反應(yīng)30 min后用PBST溶液洗板三次，最后加入100 μL TMB底物，室溫反應(yīng)30 min后，用酶標(biāo)儀和iPlate軟件進(jìn)行檢測。

1.3.5試劑盒參數(shù)測定

精密度和回收率：按照試劑盒的使用方法，向多孔板中加溶液，OA濃度為（0、0.2、0.5、1、2、5）μg/L，每種濃度三個(gè)重復(fù)孔，用以作標(biāo)準(zhǔn)曲線。加標(biāo)濃度為（40，80、160）中μg/kg，每種濃度6個(gè)孔，加標(biāo)5次，用以測定試劑盒的精密度（精密度=6個(gè)重復(fù)孔測量得到的值的標(biāo)準(zhǔn)方差/平均值）和回收率（6個(gè)重復(fù)孔得到的值的平均值/真實(shí)值），以及空白對照組6個(gè)孔，用以計(jì)算試劑盒的檢測限（濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)品組6個(gè)重復(fù)孔測量得到的濃度平均值+3倍的濃度標(biāo)準(zhǔn)方差）。

1.3.6自制試劑盒與商用試劑盒進(jìn)行對比以及該

系統(tǒng)與酶標(biāo)儀和HPLC檢測實(shí)際樣品的對比按照商用Beacon試劑盒的說明書進(jìn)行檢測，并和自制試劑盒進(jìn)行比較。同時(shí)，用iPlate和酶標(biāo)儀對自制試劑盒進(jìn)行檢測以測試iPlate的準(zhǔn)確性。并將試劑盒檢測結(jié)果和HPLC進(jìn)行比較。

2　結(jié)果與討論

2.1自制試劑盒參數(shù)測定

經(jīng)過棋盤滴定，OA-BSA的最佳稀釋比例為1∶300，抗體-HRP的最佳稀釋比例為1∶3 000。表1為貝肉樣品加標(biāo)的回收率和變異系數(shù)，由表可見，加標(biāo)濃度為40 μg/kg的樣本回收率為79.30%～109.05%，變異系數(shù)為12.55%，加標(biāo)濃度為80 μg/kg的樣本回收率為83.39%～112.04%，變異系數(shù)為12.19%，加標(biāo)濃度為160 μg/kg的樣本回收率為78.67%～104.81%，變異系數(shù)為11.60%，三個(gè)加標(biāo)濃度的平均回收率均能達(dá)到75%～125%的技術(shù)要求，變異系數(shù)也均在15%以內(nèi)。根據(jù)1.3.5中的方法計(jì)算得到試劑盒的檢測限為0.19 μg/L，達(dá)到商用試劑盒的檢測水平。

表1　貝肉樣品加標(biāo)的回收率和變異系數(shù)

2.2自制試劑盒和Beacon OA試劑盒比較

分別對自制的試劑盒和Beacon OA試劑盒用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，比較兩種試劑盒的一致性。酶標(biāo)儀測定的本試劑盒和商用Beacon試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。自制試劑盒能達(dá)到商用試劑盒的動(dòng)態(tài)檢測范圍0.2 μg/L～5.0 μg/L，與Beacon OA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線有較好的一致性，說明自制試劑盒的有效性。

圖2　自制試劑盒和Beacon OA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3酶標(biāo)儀和iPlate分別對自制的試劑盒進(jìn)行檢測及3種方法檢測實(shí)際樣品的對比

用酶標(biāo)儀和Bionic e-Eye對自制試劑盒進(jìn)行檢測，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對貝類盲樣進(jìn)行OA毒素的檢測同時(shí)比較3種檢測系統(tǒng)的一致性。

圖3為酶標(biāo)儀和iPlate兩種儀器測定的試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶標(biāo)儀（斜率為-0.45，線性相關(guān)系數(shù)為0.98）與Bionic e-Eye（斜率為-0.42，線性相關(guān)系數(shù)為0.96）具有相同水平的檢測性能。表2為用3種方法檢測盲樣的結(jié)果，樣本號為2、10、13、14和15的盲樣能檢測出貝肉中的OA的濃度，而其他樣本中所測濃度小于10 μg/kg（前處理過程中稀釋50倍，所以換算成貝肉中的線性范圍下限是10 μg/kg），雖不在試劑盒的線性檢測范圍內(nèi)，但低于歐盟所規(guī)定的出口標(biāo)準(zhǔn)（160 μg/kg）。此外，iPlate對實(shí)際樣品中OA的濃度的檢測值與酶標(biāo)儀和HPLC的檢測結(jié)果展現(xiàn)了一致性。

圖3　酶標(biāo)儀和Bionic e-Eye檢測自制試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2　iPlate與酶標(biāo)儀及HPLC檢測實(shí)際樣品比較

3　總結(jié)

OA毒素的致腹瀉、致癌，致突變和免疫毒性等生物毒性對人的健康有著嚴(yán)重的危害，因此，監(jiān)測貝肉中OA毒素的含量具有重要意義。本研究研制了具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的OA定量檢測試劑盒，其檢測限為0.19 μg/L，檢測范圍為0.2 μg/L～5.0 μg/L，達(dá)到了國外同類試劑盒的技術(shù)指標(biāo)，同時(shí)配套研發(fā)的基于移動(dòng)終端的Bionic e-Eye用于OA毒素的現(xiàn)場檢測，能夠達(dá)到商用酶標(biāo)儀在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下的檢測水平。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的試劑盒和仿生電子眼在實(shí)現(xiàn)高通量，準(zhǔn)確檢測OA毒素的同時(shí)，還具有體積小方便攜帶，處理速度快，很好的人機(jī)交互體驗(yàn)等優(yōu)勢，非常利于現(xiàn)場檢測，填補(bǔ)了OA毒素現(xiàn)場檢測儀器的空白，因此具有良好的研究價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用前景。

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邱先鑫（1990-），女，浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程2014級碩士研究生，從事生物醫(yī)學(xué)工程與生物醫(yī)學(xué)傳感器研究，xianxin?qiu@zju.edu.cn；

王平（1962-），男，浙江大學(xué)，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)閭鞲衅髋c檢測技術(shù)、生物芯片與生物電子學(xué)、人工嗅覺與人工味覺等，cnpwang@zju.edu.cn。

The Research of Biosensor and Bionic e-Eye for Rapid Detection of Okadaic Acid on-Site*

QIU Xianxin1，2，SU Kaiqi1，TIAN Yulan1，ZOU Quchao1，F(xiàn)ANG Jiaru1，LI Rong1，WANG Ping1，2*
（1.Biosensor National Special Laboratory，Key Laboratory for Biomedical Engineering of Education Ministry，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China；2.State Key Laboratory of Transducer Technology，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200050，China）

Based on Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），test kit，namely，enzyme sensor and the corre?sponding instrument was prepared，Bionic e-Eye for rapid，effective and quantitative detection of okadaic acid（OA）on-site.The detection limit of the kit is 0.19 μg/L and the range is among 0.2 μg/L and 5 μg/L.The recovery rate is among 75%and 125%and the accuracy is within±15%.The performance of Bionic e-Eye is consistent with micro?plate reader and high performance liquid chromatography（HPLC）.In addition，without artificial calculation，the instrument can show the results directly on the screen，which is very suitable for rapid detection，and will be a new technology for rapid and quantitative detection of OA on site.

Biosensor；Okadaic Acid；Bionic e-Eye；Kit；ELISA

R318

A

1004-1699（2016）05-0633-04

項(xiàng)目來源：國家海洋公益專項(xiàng)項(xiàng)目（201305010）；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目（20120101130011）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31571004）

2015-12-16修改日期：2016-01-18