藍(lán)健姿　潘　奇　陶　慶　施　欣　程曉東　張春燕

(上海市東方醫(yī)院中醫(yī)科,上海,200120)

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益腎活血顆粒對(duì)氣虛血瘀型早期糖尿病腎病患者尿CTGF影響的臨床研究

藍(lán)健姿潘奇陶慶施欣程曉東張春燕

(上海市東方醫(yī)院中醫(yī)科,上海,200120)

目的:探討益腎活血顆粒對(duì)氣虛血瘀型早期糖尿病腎病患者患者纖維化的影響及其對(duì)結(jié)締組織生長因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)的作用。方法:將90例氣虛血瘀型2型糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)患者采用采用隨機(jī)信封方式分為常規(guī)組和治療組,每組各45例,另將同期45例健康體檢者設(shè)為對(duì)照組,其中2組DN患者均接受積極控制血糖,治療高血壓,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝異常等治療,治療組則在該基礎(chǔ)上加用益腎活血顆粒。2組均以12周為1個(gè)療程,于治療前及治療12周后檢測(cè)3組蛋白尿排泄率(uAER)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、空腹血糖(FGC)、餐后2 h血糖(2 h BG)、I、Ⅲ型膠原(PI NP、PⅢNP)以及尿結(jié)締組織生長因子(CTGF)的變化。結(jié)果:1)2組患者治療前24 h蛋白尿排泄率、HbAlc、FGC、2 h BG比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),2組治療后24 h蛋白尿排泄率、FPG、OGTT均較治療前降低,與常規(guī)組比較,治療組降低的程度較為明顯(P<0.05);治療組的臨床有效率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。2)治療前相比,治療12周后治療組和常規(guī)治療組患者uAER、I、Ⅲ型膠原以及CTGF水平均有明顯下降(P<0.01),其中治療組上述指標(biāo)均顯著低于常規(guī)治療組(P<0.05)。3)利用Spearman法進(jìn)行相關(guān)參數(shù)相關(guān)性分析后可知CTGF與PI NP、PⅢNP均具有正相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論:益腎活血顆粒可以顯著降低尿CTGF水平,該效應(yīng)可能是益腎活血顆粒防治氣虛血瘀型早期糖尿病腎病纖維化的作用機(jī)制之一。

糖尿病腎病;纖維化;尿蛋白排泄率;結(jié)締組織生長因子;益腎活血顆粒

隨著現(xiàn)代生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的不斷改變,2型糖尿病逐漸成為臨床常見的疾病,糖尿病所致的大血管并發(fā)癥及微血管病變是威脅人類生命安全的主要疾病,其中DN是2型糖尿病最為常見的慢性并發(fā)癥之一,也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。研究人員進(jìn)行的一項(xiàng)多中心大樣本調(diào)查顯示[1]:2型糖尿病是導(dǎo)致尿毒癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因子,其危險(xiǎn)系數(shù)僅低于慢性腎炎。因此我們認(rèn)為科學(xué)合理的治療糖尿病可部分逆轉(zhuǎn)腎損害。90年代末美國科學(xué)家Mason率先報(bào)道腎臟細(xì)胞可表達(dá)CTGF,越來越多的文獻(xiàn)[2-5]認(rèn)為CTGF可作為新型的促纖維化因子,其不但可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖,抑制其凋亡,還可以通過抑制金屬蛋白酶的分泌而發(fā)揮促膠原分泌的作用。通過對(duì)文獻(xiàn)的大量學(xué)習(xí),我們認(rèn)為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)DN診斷依據(jù)中尿白蛋白屬于中醫(yī)學(xué)“精微”“腎精”“精氣”,尿白蛋白持續(xù)漏出即精微下注的病證,故DN的病機(jī)本為脾腎不足而致氣虛血瘀,臨床實(shí)踐中我們利用具有活血化瘀效應(yīng)的益腎活血顆?？擅黠@改善患者尿蛋白排泄率,因此我們?cè)O(shè)想:益腎活血顆粒治療DN是否通過改善其纖維化實(shí)現(xiàn)？而此過程是否通過CTGF進(jìn)行橋接？于是我們進(jìn)行一系列臨床研究,具體情況如下。

1　資料與方法

1.1一般資料將2014年7月至2015年5月同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院中醫(yī)科和內(nèi)分泌科住院的90例糖尿病腎病患者納入本研究,其中男性51例,女性39例,年齡32～61歲,平均(42.8±4.2)歲,病程2.5～18年,平均(27.8±10.2)個(gè)月。90例患者采用隨機(jī)信封方式分為常規(guī)組(45例)和治療組(45例)。另將同期45例健康體檢者設(shè)為對(duì)照組,其中男性25例,女性20例,年齡35～68歲,平均(43.7±4.6)歲。3組患者在年齡、性別等一般情況方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。具有均衡性和可比性。本研究方案經(jīng)過醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審查批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)符合早期糖尿病腎病(Mogensen分期III期)診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者;其他如感染、酸中毒、電解質(zhì)紊亂、高血壓等得到有效控制者;知情同意,并能配合治療者。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn)近1個(gè)月內(nèi)有糖尿病酮癥、酮癥酸中毒以及感染者;1型糖尿病,妊娠糖尿病、甲亢或肝炎等其他疾病所致的高血糖患者;伴有精神病、老年性癡呆等不能配合者;嚴(yán)重的心、腦、肝等并發(fā)癥或并發(fā)嚴(yán)重原發(fā)性疾病者;妊娠期及哺乳期婦女;其他原因致尿蛋白增多。

1.4氣虛血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)國家中醫(yī)藥管理局2002版《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》。氣虛主要癥狀:倦怠乏力,口干,腰腿酸軟或面色晄白,自汗畏風(fēng)。氣虛次癥:少氣懶言,心悸氣短,舌淡,苔薄白,脈細(xì)。具備主癥2項(xiàng),次癥1項(xiàng)即可辯證為氣虛證。血瘀主要癥狀:手足麻木,胸痛,腰痛,入夜尤甚。次癥:面部瘀斑,口唇暗,失眠健忘,舌暗甚至有瘀斑,舌下脈絡(luò)青紫迂曲,脈沉澀。具備主癥2項(xiàng),次癥1項(xiàng)即可辯證為血瘀證。同時(shí)具備氣虛證和血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)者為氣虛血瘀證。

1.5治療方法2組患者均接受糖尿病教育、糖尿病飲食,內(nèi)科口服降糖藥物或者皮下注射胰島素治療(劑量依照患者血糖水平而設(shè)定);合并高血壓者加用硝苯地平緩釋片(國藥準(zhǔn)字H32026198),10～20 mg,2次/d;合并高脂血癥者加服辛伐他汀(京必舒新批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字H20000009),20 mg/d。治療組在上述治療方案基礎(chǔ)上加用益腎活血顆粒(廣東一方制藥有限公司國藥準(zhǔn)字Z44020657),組方:山茱萸15 g,杜仲15 g,桑螵蛸10 g,山藥15 g,女貞子15 g,黃芪30 g,黨參30 g,桃仁15 g,赤芍15 g,路路通15 g,川芎10 g,丹參15 g,白花蛇舌草15 g。用法:1次/d,開水沖服。2組均以12周為1個(gè)療程。

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1糖化血紅蛋白、空腹血糖、餐后2 h血糖、蛋白尿排泄率留取常規(guī)組及治療組患者治療前及治療12周后24 h尿液,加入二甲苯進(jìn)行防腐,采用放射免疫法對(duì)尿蛋白Alb進(jìn)行測(cè)定,然后根據(jù)尿液的容積和所得Alb數(shù)值計(jì)算出蛋白尿排泄率(uAER)。糖化血紅蛋白(HbAlc)、空腹血糖(FGC)、餐后2 h血糖(2 h BG)的變化。

1.6.2尿CTGF、PI NP、PⅢNP檢測(cè)收集對(duì)照組,常規(guī)組及治療組患者治療前及治療12周后連續(xù)24 h尿液,在4 ℃,14 000 prn條件下離心5 min,用高壓槍頭吸取離心后的上清液,使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行檢測(cè),操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,試劑盒由廣州達(dá)安基因股份有限公司提供,顯色后采用492 nm波長,TMB反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)需要450 nm波長。檢測(cè)時(shí)一定要首先進(jìn)行空白孔系統(tǒng)調(diào)零,用測(cè)定標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測(cè)定孔平均值的比值(P/N)表示。以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值,若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,即為陽性。

1.7療效判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2002年國家中醫(yī)藥管理局組織制定的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》顯效:尿微量白蛋白排泄率減低≥50%,或恢復(fù)正常。有效:尿微量白蛋白排泄率減低≥30%,但不足50%。無效:未達(dá)上述有效標(biāo)準(zhǔn)者。臨床有效率=(顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。

2　結(jié)果

2.12組24 h蛋白尿排泄率、HbAlc、FGC、2 h BG以及臨床療效的比較2組患者治療前24 h蛋白尿排泄率、HbAlc、FGC、2 h BG比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),2組治療后24 h蛋白尿排泄率、FPG、OGTT均較治療前降低,與常規(guī)組比較,治療組降低的程度較為明顯(P<0.05);治療組的臨床有效率明顯高于對(duì)照組(P<0.05),具體見表1、表2。

表1　2組uAER、HbAlc、FGC、2 h BG比較

注:與治療前相比,*P<0.05,與常規(guī)組相比,△P<0.05。

注:χ2=3.19,P=0.02<0.05。

2.23組CTGF、PI NP、PⅢNP濃度比較對(duì)不同治療組患者24 h尿液中CTGF、PI NP、PⅢNP進(jìn)行ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示:2組DN患者治療前尿液中中CTGF、PI NP、PⅢN表達(dá)無明顯差異,但與對(duì)照組相比,治療組患者治療前的CTGF[(43.20±8.89)pg/mL vs (16.81±3.01) pg/mL,|t|=5.24,P=0.002 4<0.05]、PI NP[(102.99±20.39)pg/mL vs (42.91±6.49) pg/mL,|t|=4.67,P=0.001 1<0.05]、PI NP[(757.8±167.3) pg/mL vs (158.55±40.49) pg/mL,|t|=4.07,P=0.001 5<0.05]表達(dá)均明顯增加;經(jīng)過益腎活血顆粒治療后治療組的CTGF[(25.59±4.79) pg/mL vs (43.20±8.89) pg/mL,|t|=8.92,P=0.000 9<0.001]、PI NP[(49.33±9.67) pg/mL vs (102.99±20.39) pg/mL,|t|=6.67,P=0.000 8<0.001]、PⅢN[(384.8±83.11) pg/mL vs (757.8±167.3) pg/mL,|t|=5.07,P=0.000 8<0.001]表達(dá)顯著低于治療前,也低于常規(guī)組治療后(P<0.05)見圖1-3。

圖1　各組CTGF濃度變化

圖2　各組PI NP濃度變化

圖3　各組PⅢN濃度變化

2.3CTGF與PI NP、PⅢNP的相關(guān)性研究CTGF與PI NP、PⅢNP數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布,使用Spearman法進(jìn)行相關(guān)參數(shù)相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTGF與PI NP、PⅢNP的表達(dá)均存在正相關(guān)性,具體見表3。

表3　相關(guān)性分析

3　討論

2型糖尿病導(dǎo)致的腎損傷是一類進(jìn)展性的疾病,在疾病早期腎臟體積逐漸增大,導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率增加,呈高濾過狀態(tài),以后逐漸出現(xiàn)間隙蛋白尿或微量白蛋白尿,隨著疾病的日益惡化患者逐漸出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、水腫、高血壓等臨床癥狀,進(jìn)而出現(xiàn)腎功能不全、尿毒癥,最終導(dǎo)致死亡。有資料顯示[6]:約有30%的2型糖尿病患者將出現(xiàn)DN,其中接近一半患者腎功能損傷在一定程度上具有可逆性,因此我們認(rèn)為早期干預(yù)糖尿病腎病患者具有重要臨床意義。

CTGF在機(jī)體多個(gè)臟器均有表達(dá),其中腎臟的表達(dá)量是最高的。成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及腎小球系膜細(xì)胞等均是機(jī)體合成CTGF的主要場(chǎng)所,在正常的生理狀態(tài)下,CTGF在血漿呈低表達(dá),以低量的表達(dá)維持多種生物學(xué)功能,病理學(xué)狀態(tài)下CTGF濃度上調(diào),則導(dǎo)致腎臟纖維化、肺纖維化等纖維化疾病的發(fā)生,有研究證實(shí)CTGF可通過抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤敏感基因蛋白(Rb)的磷酸化程度,抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期,導(dǎo)致細(xì)胞周期持續(xù)停頓與G期,從而出現(xiàn)系膜細(xì)胞肥大并逐漸想肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換[7-10]。有本研究結(jié)果可以看出,2組DN患者尿液中CTGF的濃度明顯高于對(duì)照組,并在介入干預(yù)治療后尿CTGF濃度均出現(xiàn)降低,其中治療組降低的趨勢(shì)更為明顯,且PI NP、PⅢNP的濃度表達(dá)具有一致性。PI NP、PⅢNP是腎臟EcM的主要膠原成分,在腎臟纖維化進(jìn)程中具有重要作用,隨著2型糖尿病腎病的進(jìn)展,腎固有細(xì)胞受損,因此激活細(xì)胞外基質(zhì),導(dǎo)致成纖維細(xì)胞(FB)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及細(xì)胞因子等相互調(diào)節(jié)失衡,導(dǎo)致系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(EcM)重構(gòu),主要表現(xiàn)為是成纖維大量增殖,細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積及細(xì)胞因子分泌失常,膠原超常合成沉積與降解減少,隨著病情的逐漸發(fā)展,在DN后期腎小球及腎間質(zhì)出現(xiàn)纖維化,最后導(dǎo)致腎小球的硬化。CTGF是具有絲裂原性和趨化性的因子之一,可誘導(dǎo)成纖維增殖及刺激ECM的分泌,從而加劇了上述腎臟病變過程的惡化[11-12]。因此我們認(rèn)為CTGF是導(dǎo)致DN腎臟纖維化的始動(dòng)因子,它的過表達(dá)導(dǎo)致了PI NP、PⅢNP的釋放,加速了成纖維細(xì)胞的增殖過程從而形成腎纖維化。

由于各類西藥都可能產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng),糖尿病腎病患者較難耐受,因此本研究對(duì)根據(jù)DN中醫(yī)病機(jī)予益腎活血顆粒進(jìn)行治療。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DN的本為脾腎不足,健脾益腎是根本,大多數(shù)DN病程較久,必然元?dú)獯髠?氣虛則運(yùn)血無力,血行艱澀而成久病及腎,久病入絡(luò)之血瘀證候。方中黨參、黃芪、山藥補(bǔ)氣健脾,山茱萸補(bǔ)益肝腎,合黨參、山藥共奏滋補(bǔ)腎陰的功效,桑螵蛸有溫腎補(bǔ)陽固攝之療效,女貞子可發(fā)揮益精填髓的目的,血瘀是貫穿于糖尿病腎病疾病全過程,本方加用桃仁、赤芍、路路通、川芎、丹參以活血化瘀通絡(luò),白花蛇舌草清熱解毒,使得整個(gè)方子補(bǔ)而不膩,溫而不化火[13-15]。研究中我們發(fā)現(xiàn)加用益腎活血顆粒的治療組患者在降低uAER、PI NP、PⅢNP以及CTGF方面均明顯優(yōu)于對(duì)照組,因此我們認(rèn)為益腎活血顆?？膳c常規(guī)藥物產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。

總之,PI NP、PⅢNP以及CTGF與早期糖尿病腎病纖維化具有密切關(guān)系,對(duì)CTGF水平的檢測(cè)可以評(píng)估DN腎纖維化,益腎活血顆粒可以顯著降低尿CTGF水平,該效應(yīng)可能是益腎活血顆粒防治氣虛血瘀型早期糖尿病腎病纖維化的作用機(jī)制之一。但由于本研究隨訪時(shí)間較短、樣本量較少,以期在下階段增大樣本量、延長隨訪時(shí)間,進(jìn)一步證實(shí)益腎活血顆粒改善DN預(yù)后的明確機(jī)制,以指導(dǎo)臨床用藥。

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(2015-07-16收稿責(zé)任編輯：王明)

The Clinical Study of Yishenhuoxue Granules on Urinary CTGF of Patients with Qi Deficiency and Blood Stasis Type of Early Diabetic Nephropathy

Lan Jianzi,Pan Qi,Tao Qing,Shi Xing,Cheng Xiaodong,Zhang Chunyan

(Traditional Chinese Dedicine Department of Shanghai Eastern Hepatobiliary Hospital,Shanghai 200120,China)

Objective:To investigate the impact of Yishenhuoxue granules on fibrosis of patients with qi deficiency and blood stasis type of early diabetic nephropathy and its effect on CTGF.Methods:90 cases of patients with qi deficiency and blood stasis type of type 2 diabetic nephropathy (DN) were divided into normal group and observation group by using random envelope,45 cases in each group,45 cases of healthy physical examination in the corresponding period as healthy control group,both of the two groups of patients with DN accepted the treatment such as positive control of blood glucose,high blood pressure treatment, adjusted abnormal lipids metabolism,the observation group added Yishenhuoxue granules based on the treatment.Both of the two groups according to 12 weeks for a period of treatment, tested the changes of three sets of albuminuria excretion rate (uAER) and collagen type I,Ⅲ (PI NP,P Ⅲ NP),and connective tissue growth factor (CTGF) of the urine before and after 12 weeks of treatment.Results:1) 24 h before the treatment,urine protein excretion rate,HbAlc,FGC,2 h BG of the two groups of patients were with no statistical differences (P>0.05),24 h after the treatment,urine protein excretion rate,FPG,OGTT of the two groups reduced compared to before the treatment,and the comparison with the conventional group,the observation group reduced the more obvious extent(P<0.05);The clinical effectiveness of observation group was obviously higher than that of control group(P<0.05).2)Compared with before treatment,uAER,collagen type I,Ⅲ and CTGF levels in patients of observation group and conventional therapy group were significantly decreased after 12 weeks(P<0.01),the indexes above of the observation group were significantly lower than that of conventional treatment group(P<0.05).3)After related parameters correlation analysis by using of Spearman method,it showed CTGF and PI NP,P Ⅲ NP had positive correlation (P<0.05).Conclusion:Yishenhuoxue granules can significantly reduce urinary CTGF level,this effect may be one of the mechanism of Yishenhuoxue granules prevent and treat qi deficiency and blood stasis type of early diabetic nephropathy fibrosis.

Diabetic nephropathy;Fibrosis;Connective tissue growth factor;Yishenhuoxue granules

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)中醫(yī)藥科研基金課題任務(wù)(編號(hào):2014LP033B)；2014年浦東新區(qū)中醫(yī)領(lǐng)軍人才項(xiàng)目(編號(hào)：PDZYXK-4-2014005)

藍(lán)健姿(1971.10—),女,碩士,副主任醫(yī)師,研究方向:中醫(yī)內(nèi)科,中西醫(yī)結(jié)合腎病,E-mail:weidhj34@163.com

R255.4

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.019