馬香芹，陳潔，趙汴霞，趙娜，楊紅梅

替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)乳鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響

馬香芹1，陳潔1，趙汴霞1，趙娜1，楊紅梅1

目的分析替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對(duì)血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）誘導(dǎo)的乳鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響以及相關(guān)機(jī)制。方法新生1～3 d Wistar 大鼠30只，雌雄不拘，培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，采用差速貼壁獲得心肌成纖維細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期成纖維細(xì)胞，分組并給予處理，對(duì)照組：加入15%胎牛血清DEME培養(yǎng)液，Ang Ⅱ組：15%胎牛血清DEME培養(yǎng)液+Ang Ⅱ，替米沙坦組：在Ang Ⅱ組基礎(chǔ)上加入替米沙坦，氨氯地平組：在Ang Ⅱ組基礎(chǔ)上加入氨氯地平，聯(lián)合組：在Ang Ⅱ組基礎(chǔ)上加入替米沙坦+氨氯地平。鑒定成纖維細(xì)胞。CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，應(yīng)用免疫組化染色測(cè)定血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）蛋白水平，應(yīng)用RT-PCR法測(cè)定LOX-1及TNF-α mRNA表達(dá)水平。結(jié)果心肌成纖維細(xì)胞胞體較大，胞漿透明，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核呈橢圓形，通常含2～3個(gè)核，細(xì)胞純度高達(dá)98%。與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組增殖活性升高，而加入替米沙坦和氨氯地平后，抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的增殖，聯(lián)合應(yīng)用替米沙坦和氨氯地平較單藥抑制作用更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組心肌成纖維細(xì)胞TNF-α及LOX-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。各藥物干預(yù)組與Ang Ⅱ組相比，TNF-α及LOX-1 mRNA表達(dá)水平顯著降低，其中聯(lián)合組下降最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組心肌成纖維細(xì)胞TNF-α及LOX-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。各藥物干預(yù)組與AngⅡ組相比，TNF-α及LOX-1蛋白表達(dá)水平顯著降低，聯(lián)合組較替米沙坦組和氨氯地平組兩種蛋白的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)論替米沙坦聯(lián)合氨氯地平能有效抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖，其可能機(jī)制為抑制LOX-1及TNF-α過度表達(dá)。

替米沙坦；氨氯地平；血管緊張素Ⅱ；成纖維細(xì)胞；血凝素樣氧化低密度蛋白受體-1

成纖維細(xì)胞活化及增生是心肌纖維化的重要因素。血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，介導(dǎo)心肌纖維化［1］。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）可與血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）結(jié)合并介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣斑塊形成及發(fā)展［2］。另外，LOX-1還與心室重構(gòu)、心肌肥大及心力衰竭有密切的關(guān)系。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，可促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡并介導(dǎo)心肌纖維化［3］。替米沙坦屬于Ang Ⅱ受體拮抗劑，能有效預(yù)防心肌纖維化，氨氯地平屬于長效降壓藥，可有效舒張血管，改善心肌供血并抑制心肌纖維化［4］。本研究觀察了替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的乳鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及LOX-1、TNF-α表達(dá)的影響，旨在探討替米沙坦聯(lián)合氨氯地平對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的作用及可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑新生1～3 d Wistar大鼠30只，雌雄不拘，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。新生胎牛血清（北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司）、DEME培養(yǎng)液（美國Sigma公司）、Ang Ⅱ試劑（北京方程生物科技有限公司）、胰蛋白酶消化液（北京索萊寶科技有限公司）、TNF-α多克隆抗體（美國Sigma公司）、MM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（美國Sigma公司）、LOX-1抗體（美國Gibco公司）。替米沙坦（北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：H201502036）、氨氯地平（蘇州第壹制藥有限公司，批號(hào)：H201509123）。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)：MCO-20AIC，德國Heraeus公司）、電子天平（BP211D型，Sartorius公司）、紫外投射儀（蘇州電子儀器有限公司）、凝膠密度掃描成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）、水平凝膠電泳槽（德國Eppendorf公司）、光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：DMLP-MP30，日本RICOH公司）、微量移液器（20 μl、200 μl、1000 μl）購自Dragon Med公司、臺(tái)式微量離心機(jī)（型號(hào)：H1650-W，美國Sigma公司）、高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：A1330103，美國Beckman公司）、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（型號(hào)：TD-35M/TD35，德國Hettich公司）。

1.3方法

1.3.1心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在無菌條件下取30只Wistar乳鼠，將其左心室取出并剪碎成1 mm3大小，PBS緩沖液反復(fù)沖洗3次，依次加入0.01% Ⅱ型膠原酶、0.08%胰蛋白酶消化10 min，反復(fù)消化直至組織塊消失。收集懸浮液離心過濾后留取沉淀物，并置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。由于成纖維細(xì)胞與心室肌細(xì)胞生長時(shí)間不同，采用差速貼壁2 h獲得心肌成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞生長至滿瓶后應(yīng)用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3代后收集成纖維細(xì)胞。

1.3.2心肌成纖維細(xì)胞鑒定將傳代成纖維細(xì)胞接種至玻片上，待細(xì)胞爬滿玻片后，將玻片取出，PBS緩沖液沖洗3遍，室溫下加入4%多聚甲醛固定，于恒溫水浴箱中孵育30 min，采用血清封閉，室溫下以1：50加入鼠抗波形蛋白單克隆抗體工作液恒溫孵育3 h，依次加入生物素標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白及辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液于室溫孵育。應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑顯色，PBS緩沖液沖洗，蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水，中性樹脂封固，并于倒置顯微鏡下觀察。

1.3.3分組及藥物處理對(duì)照組：加入15%胎牛血清DEME培養(yǎng)液，Ang Ⅱ組：15%胎牛血清DEME培養(yǎng)液+1×10-6mol/L Ang Ⅱ，替米沙坦組：在Ang Ⅱ組基礎(chǔ)上加入替米沙坦，終濃度為10 μmol/L，氨氯地平組：在Ang Ⅱ組基礎(chǔ)上加入氨氯地平，終濃度為1 μmol/L，聯(lián)合組：在Ang Ⅱ組基礎(chǔ)上加入替米沙坦（終濃度10 μmol/L）+氨氯地平（終濃度1 μmol/L）。

1.4CCK-8檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞增殖將心肌成纖維細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置6個(gè)孔。待細(xì)胞貼壁生長后，藥物處理各組細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，吸去上清液，各孔加入10% CC-K 20 μl，于培養(yǎng)箱孵育2.5 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度（OD）值。

1.5RT-PCR擴(kuò)增目的基因乳鼠LOX-1基因序列以β-actin為內(nèi)參，TNF-α基因以GAPDH為內(nèi)參，引物序列由上海生物工程有限公司合成（表1）。藥物干預(yù)48 h后，TRIzol試劑一步法提取心肌成纖維細(xì)胞總RNA，經(jīng)PCR分析儀檢測(cè)，LOX-1、TNF-α目的基因OD值為1.8～2.0，符合實(shí)驗(yàn)要求。采用PCR試劑盒合成cDNA，再取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μl行PCR擴(kuò)增，LOX-1反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，經(jīng)38個(gè)循環(huán)后再延伸5 min。TNF-α反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)后72℃再延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，mRNA表達(dá)量=目的基因吸光度/內(nèi)滲β-actin吸光度。

1.6免疫組化染色藥物處理細(xì)胞48 h后，制作細(xì)胞涂片。3% H2O2孵育5～10 min，PBS洗3次，每次5min；10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min。去除血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗（山羊抗鼠LOX-1多克隆抗體1：100，山羊抗鼠TNF-α多克隆抗體1：50），4℃濕盒過夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加辣根酶標(biāo)記的二抗（1：100），37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色，PBS洗3次，每次5 min。自來水沖洗，復(fù)染，封片。采用Biosins 數(shù)碼成像系統(tǒng)分析染色區(qū)域積分光密度值。

表1　各引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用方差分析，兩兩比較采用LST-D法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1心肌成纖維細(xì)胞鑒定倒置顯微鏡下可見心室肌細(xì)胞在未貼壁時(shí)呈圓形，貼壁后，生長逐漸呈梭形、多角形，胞核1～2個(gè)、呈圓形，細(xì)胞大小均勻，細(xì)胞有偽足伸出，變?yōu)槎噙呅危▓D1A）。而心肌成纖維細(xì)胞胞體較大，胞漿透明，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核呈橢圓形，通常含2～3個(gè)核，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，細(xì)胞純度高達(dá)98%（圖1B）。

圖1　心肌成纖維細(xì)胞鑒定（×200）（1A為心室肌細(xì)胞，1B為心肌成纖維細(xì)胞）

2.2各組心肌成纖維細(xì)胞增殖情況與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組增殖活性升高，而加入替米沙坦和氨氯地平后，抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的增殖，聯(lián)合應(yīng)用替米沙坦和氨氯地平較單藥抑制作用更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表2）。

2.3各組心肌成纖維細(xì)胞TNF-α與LOX-1 mRNA表達(dá)水平比較與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組心肌成纖維細(xì)胞TNF-α及LOX-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。各藥物干預(yù)組與Ang Ⅱ組相比，TNF-α及LOX-1 mRNA表達(dá)水平顯著降低，其中聯(lián)合組下降最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表3）。

2.4各組LOX-1、TNF-α免疫組化染色結(jié)果對(duì)照組心肌成纖維細(xì)胞LOX-1、TNF-α染色呈陰性；Ang Ⅱ組細(xì)胞質(zhì)中有明顯的棕色顆粒，呈陽性。與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組心肌成纖維細(xì)胞TNF-α及LOX-1蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。各藥物干預(yù)組與AngⅡ組相比，TNF-α及LOX-1蛋白表達(dá)水平顯著降低，聯(lián)合組較替米沙坦組和氨氯地平組兩種蛋白的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表4、圖2、圖3）。

表2　各組心肌成纖維細(xì)胞增殖情況（n=6）

（1為對(duì)照組，2為Ang Ⅱ組，3為替米沙坦組，4為氨氯地平組，5為聯(lián)合組）

表3　各組心肌成纖維細(xì)胞TNF-α 與LOX-1相對(duì)表達(dá)情況（n=6）

3　討論

一些血管活性物質(zhì)及促纖維化因子可激活多種細(xì)胞信號(hào)通路，引起膠原蛋白沉積，增加心室肌僵硬度［5］。有效抑制心肌成纖維細(xì)胞過度增殖對(duì)保護(hù)心臟功能具有重要的作用。Ang Ⅱ具有收縮血管作用，與其受體結(jié)合通過酪氨酸激酶途徑激活絲裂霉素活化蛋白酶，從而促進(jìn)及介導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化，在心臟病終末期病變中起到重要作用［6，7］。替米沙坦作為新一代非肽類Ang Ⅱ受體拮抗劑，阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAS），抑制Ang Ⅱ分泌［8］。Liu等［9］研究認(rèn)為，替米沙坦能有效降低心肌病大鼠炎癥水平及心肌蛋白的表達(dá)，抑制心肌纖維化。氯氨地平屬于鈣離子通道阻滯劑，能有效改善心肌供血，降低心臟壓力負(fù)荷，抑制心肌膠原蛋白生成，進(jìn)而抑制心肌纖維化［10，11］。

表4　各組LOX-1、TNF-α免疫組化染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果（n=6）

圖2　各組TNF-α免疫組化染色結(jié)果（×400）（A為對(duì)照組，B為Ang Ⅱ組，C為替米沙坦組，D為氨氯地平組，E為聯(lián)合組）

圖3　各組LOX-1免疫組化染色結(jié)果（×400）（A為對(duì)照組，B為AngⅡ組，C為替米沙坦組，D為氨氯地平組，E為聯(lián)合組）

本研究發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的增殖，結(jié)果與既往研究［12］一致。與Ang Ⅱ組相比，各藥物干預(yù)組抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖，替米沙坦聯(lián)合氨氯地平抑制更明顯。TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。本研究應(yīng)用免疫組化法測(cè)定各組TNF-α和LOX-1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，對(duì)照組呈陰性，Ang Ⅱ組呈陽性，替米沙坦組、氨氯地平組及聯(lián)合組染色呈弱陽性。RT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與免疫組化染色結(jié)果一致。提示，Ang Ⅱ可上調(diào)LOX-1和TNF-α表達(dá)，替米沙坦聯(lián)合氨氯地平可明顯抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的表達(dá)上調(diào)。

綜上所述，替米沙坦聯(lián)合氨氯地平能有效抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖，其可能機(jī)制與抑制LOX-1及TNF-α蛋白過度表達(dá)有關(guān)。

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本文編輯：姚雪莉

Effect of telmisartan and amlodipine on myocardial fibroblasts proliferation of neonatal rats inducedby angiotensin Ⅱ

MA Xiang-qin*， CHEN Jie， ZHAO Bian-xia， ZHAO Na， YANG Hong-mei.*Henan medical college， Zhengzhou Henan， 451191， China.

YANG Hong-mei； E-mail: yyd19982@163.com

Objective To investigate the combination impact of telmisartan and amlodipine on proliferation of neonatal rat cardiac fibroblasts induced by angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ）. Methods Primary cardiac fibroblasts were isolated from 30 Wistar neonatal rats and continuously cultured. Cell cultures were divided into five groups and treated with different drugs： control group （cultured with DEME plus 15% fetal bovine serum）， Ang Ⅱ group （control medium supplemented with 1×10-6mol/L Ang Ⅱ）， telmisartan group （TE group， addition of 10 μmol/L telmisartan on the basis of Ang Ⅱ group）， amlodipine group （AM group， addition of 1 μmol/L amlodipine on the basis of Ang II group），and telmisartan + amlodipine group （TE + AM group， addition of 10 μmol/L telmisartan and 1 μmol/L amlodipine on the basis of Ang Ⅱ group）. The cell proliferation of cardiac fibroblasts was measured by CCK8 method. The protein level of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 （LOX-1） and tumor necrosis factor α （TNF-α）was determined by immunohistochemical staining. The mRNA level of LOX-1 and TNF-α was detected by RTPCR. Results Cardiac fibroblasts were large and spindle with transparent cytoplasm including 2-3 nucleuses in elliptical shape. The purity was 98%. Compared with the control group， the protein level and mRNA level of LOX-1 and TNF-α were significantly increased in the Ang Ⅱ group （P<0.05）. Compared with the Ang II group， the protein level and mRNA level of LOX-1 and TNF-α were significantly reduced in telmisartan group and amlodipine group（P<0.05）. Compared with telmisartan group and amlodipine group， the protein level and mRNA level of LOX-1 and TNF-α were further reduced in the combination drug group （P<0.05）. Conclusion The induced proliferation of cardiac fibroblasts by Ang II could be inhibited by telmisartan and amlodipine. The combination uses of two drugs yielded more obvious reduction. The possible mechanism might be due to inhibiting the over-expression of LOX-1 and TNF-α.

Telmisartan； Amlodipine； Angiotensin Ⅱ； Cardiac fibroblasts； Lectin-like oxidized LDL receptor-1 protein

R544.1

A

1674-4055（2016）08-0928-04

河南省二O一四年基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（142300410467）

1 451191鄭州，河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校

楊紅梅，E-mail：yyd19982@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.08.10