郝霽萍，高宇勤，賀少輝，趙國(guó)平

?論著?

肉桂酸預(yù)處理通過激活A(yù)kt信號(hào)通路對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

郝霽萍1，高宇勤1，賀少輝1，趙國(guó)平2

目的探討肉桂酸預(yù)處理對(duì)大鼠心肌細(xì)胞Akt信號(hào)通路及心肌缺血再灌注損傷的影響。方法30只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為三組，每組各10只，分別為假手術(shù)組（只開胸不結(jié)扎前降支）、缺血再灌注組、藥物預(yù)處理組。采用了結(jié)扎SD大鼠心臟冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，利用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，利用蛋白印跡（Western blot）技術(shù)探究肉桂酸預(yù)處理對(duì)Akt信號(hào)通路的影響。結(jié)果 肉桂酸藥物預(yù)處理組與缺血再灌注組比較，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯減少（P＜0.05）；肉桂酸預(yù)處理能促進(jìn)p-Akt蛋白（磷酸化Akt）的表達(dá)，增加BCL-2表達(dá)，對(duì)非磷酸化Akt無明顯影響。結(jié)論 肉桂酸預(yù)處理能減少SD大鼠在體心肌缺血再灌注損傷模型的心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能通過促使Akt磷酸化，從而增加BCL-2蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡來發(fā)揮保護(hù)作用。

肉桂酸；心肌缺血再灌注損傷；磷酸化蛋白激酶B

缺血再灌注損傷病理過程涉及到凋亡等機(jī)制，通過減少再灌注心肌細(xì)胞的凋亡有助于減輕再灌注后心肌損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，Akt信號(hào)通路激活后，可增加BCL-2表達(dá)，進(jìn)一步抑制Caspase3激活，減少和穩(wěn)定線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔的開放，抑制心肌細(xì)胞凋亡［1，2］。肉桂酸是從肉桂皮分離出來的有機(jī)酸，減輕心肌缺血再灌注損傷，其作用機(jī)制可能與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)［3］，但對(duì)于心肌缺血灌注損傷的心肌細(xì)胞凋亡影響未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究提出一個(gè)假說，肉桂酸預(yù)處理能減輕心肌缺血再灌注損傷，那么其機(jī)制是否可能與減少心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)？而且此機(jī)制是否通過干預(yù)Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用？為了驗(yàn)證此假說，本研究采用在體SD大鼠冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）結(jié)扎術(shù)模型來觀察肉桂酸預(yù)處理對(duì)SD大鼠心肌缺血再灌注損傷的心肌保護(hù)作用及與Akt信號(hào)通路的關(guān)系。

1　材料和方法

1.1主要試劑與儀器肉桂酸購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司（批號(hào)ZL2008009RGS）， anti-Akt（抗鼠一抗）抗體，anti-pAkt（ser473）抗體（抗鼠一抗），購(gòu)置于Cell signaling公司，BCL-2、DAPDH（內(nèi)參）購(gòu)自SANTA CRUZ生物技術(shù)公司，TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（KGA7032）購(gòu)于凱基生物有限公司。Westernblot蛋白印跡電泳儀（美國(guó) Bio-rad公司），TS-2000A脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司），生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)處理系統(tǒng)（成都泰盟生物科技公司）。

1.2動(dòng)物模型的建立SPF 級(jí)雄性SD（30只）大鼠，體重280～400 g，月齡5～10月，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002。將大鼠稱重，注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)，頸部備皮，碘伏消毒，縱形剪開頸部皮膚約2～3 cm，分離皮下組織及肌肉，顯露氣管，鈍性分離氣管，行氣管插管，接呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸頻率60 次/min、通氣量20 ml/kg。胸骨左緣3 mm縱形剪開皮膚約4 cm，鈍性分離皮下、胸大肌與前鋸肌，于三肋間逐步剪開肋間肌，撐開肋骨，撕破心包，顯露心臟，確定縫扎位置（肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界處下方2 mm，前降支近端位置）。用0號(hào)線，疊一個(gè)0.8～1 mm的凹槽硅膠管，出針打結(jié)結(jié)扎前降支，缺血30 min，松開結(jié)扎，復(fù)灌2 h。模型復(fù)制的可靠性用ECGⅡ?qū)?lián)的變化來判斷，以ST段抬高為心肌缺血存在，以ST段回落1/2為再灌注成功（圖1）。本實(shí)驗(yàn)建?？偣灿?只SD大鼠因?yàn)槁樽砗褪中g(shù)原因死亡，死亡率16%。

圖1　SD大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立成功的心電圖表現(xiàn)

1.3分組及給藥方案肉桂酸與生理鹽水混合，于灌胃前加熱溶解混均，藥物預(yù)處理組大鼠給予肉桂酸400 mg/kg灌胃，灌胃一天一次，連續(xù)灌胃4 d，最后一次于手術(shù)前30 min給予。實(shí)驗(yàn)共分為3組，30只雄性SD大鼠被隨機(jī)分為3組，每組10只，實(shí)際建模成功是每組8只大鼠，三組分別為：假手術(shù)組（只開胸不結(jié)扎前降支）、缺血再灌注組、藥物預(yù)處理組。

1.4心肌TUNEL凋亡原位檢測(cè)及步驟再灌注結(jié)束，迅速剪下心臟，置于冰PBS 中洗凈殘血；分離左心室前壁缺血邊緣區(qū)，于10%的中性甲醛固定12 h，然后制作石蠟切片。嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒方法進(jìn)行操作。陽性細(xì)胞核呈棕黃色，陰性細(xì)胞核呈藍(lán)色，每張切片于缺血部位隨機(jī)選取8個(gè)高倍視野（×400倍），分別記數(shù)凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)并進(jìn)行匯總，以凋亡心肌細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞總數(shù)的百分比作為凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞

1.5蛋白印跡（Western blot）檢測(cè)配制分離膠的配制濃度：8%和12%分離膠，制備5%濃縮膠，上液蛋白總量120 μg，進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜條件：Akt、p-Akt、BCL-2蛋白檢測(cè)用350 mA恒流濕轉(zhuǎn)45 min。一抗孵育條件：anti-Akt（1：1000），Anti-GAPDH（1：2000），Anti-p-Akt（1：500）， Anti-BCL-2（1：500），4℃孵育過夜，二抗（1：5000）。將Western blot ECL發(fā)光液A、B 各500μL等量混合后，涂在PVDF膜上，覆蓋膠片，在暗房中，曝光，掃描儀掃描Western blot圖像，Quantity one軟件分析Western blot條帶的灰度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用 SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肉桂酸預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肉桂酸藥物預(yù)處理組凋亡指數(shù)為0.17±0.04，與缺血再灌注組相比較，明顯降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，圖2）。

表1　肉桂酸預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)影響（±s）

表1　肉桂酸預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與缺血再灌注組比較，bP＜0.05

組別　n　凋亡指數(shù)假手術(shù)組　8　0.06±0.02缺血再灌注組　8　0.32±0.07a藥物預(yù)處理組　8　0.17±0.04ab

圖2　肉桂酸預(yù)處理對(duì)SD大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響（×200，TUNEL法）

2.2肉桂酸預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌細(xì)胞Akt信號(hào)通路的影響結(jié)果顯示，肉桂酸預(yù)處理組能誘導(dǎo)Akt蛋白磷酸化，p-Akt（ser473）在肉桂酸藥物預(yù)處理組中明顯升高，和缺血再灌注組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），發(fā)現(xiàn)與缺血再灌注組比較，肉桂酸預(yù)處理能升高BCL-2（Akt信號(hào)通路的下游蛋白）表達(dá)（P＜0.01），肉桂酸預(yù)處理對(duì)于總Akt（非磷酸化Akt）蛋白無明顯影響（圖3）。

3　討論

目前，急性心肌梗死再灌注治療是一種重要的治療方法，缺血再灌注損傷可造成心肌細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，上述原因造成心功能的下降、惡性心律失常的發(fā)生以及猝死［1］。防治心肌缺血再灌注損傷成為目前急需要解決的問題。

圖3　肉桂酸預(yù)處理對(duì)SD大鼠心肌細(xì)胞Akt信號(hào)通路的影響（藥物預(yù)處理組與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；藥物預(yù)處理組與缺血再灌注組相比，bP＜0.01）

心肌缺血再灌注損傷一個(gè)重要機(jī)制是心肌細(xì)胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)作用。當(dāng)Akt被激活后，其上調(diào)下游的BCL-2，抑制Caspase3激活，減少mPTP（線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔）開放，以避免和減少線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用［2，4］。肉桂酸是從肉桂皮分離出來的有機(jī)酸。有研究發(fā)現(xiàn)肉桂酸和芍藥苷、甘草酸、阿魏酸混合液可以通過激活微血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放eNOS（內(nèi)皮型一氧化氮合酶）進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激損傷［5］。研究提示肉桂酸能降低MDA，升高SOD以減輕心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷［3］，肉桂酸和阿魏酸及甘草酸混合液可以抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減輕炎癥反應(yīng)［6］。以上研究發(fā)現(xiàn)肉桂酸是一個(gè)能防治心肌缺血再灌注損傷的藥物，但是機(jī)制研究還很欠缺，特別是對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響目前未見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)?zāi)康木褪怯^察肉桂酸預(yù)處理能否通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路拮抗心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕心肌缺血再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)采用在體SD大鼠冠狀動(dòng)脈LAD結(jié)扎術(shù)在體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，利用TUNEL技術(shù)，觀察肉桂酸預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)肉桂酸預(yù)處理能明顯降低模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，說明肉桂酸確實(shí)能減少心肌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步本實(shí)驗(yàn)利用蛋白印跡（Western blot）技術(shù)檢測(cè)心肌組織中的Akt、p-Akt（ser473）、BCL-2，發(fā)現(xiàn)磷酸化Akt［p-Akt（ser473）］在肉桂酸預(yù)處理組中明顯升高，而且在此組中BCL-2也明顯上調(diào)，Akt是PI3K信號(hào)通路的上游關(guān)鍵蛋白，Akt被配體后，可以繼續(xù)激活下游BCL-2蛋白，由此激發(fā)抗凋亡機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)了實(shí)驗(yàn)假設(shè)。

綜上所述，本研究顯示肉桂酸預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷大鼠模型心肌的保護(hù)作用部分是通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，上調(diào)BCL-2，減少心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示肉桂酸將是一種有前途的防治心肌缺血再灌注損傷的藥物。但是本研究只是通過在體證明肉桂酸抗凋亡作用及與PI3K信號(hào)通路相關(guān)，還需要通過離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，也需要電鏡下凋亡的客觀形態(tài)，此類問題有待于進(jìn)一步研究。

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本文編輯：劉暢，田國(guó)祥

Protective effect of cinnamic acid preconditioning in the myocardial ischemia reperfusion injury of ratsby activating Akt signal pathway

HAO Ji-ping*， GAO Yu-qin， HE Shao-hui， ZHAO Guo-ping.*Imaging department， Xi'an Ninth Hospital， Xi'an， 710054， China.

GAO Yu-qin； E-mail: 2101749095@qq.com

Objective To explore the effect of cinnamic acid preconditioning on Akt signal pathway and in myocardial ischemia reperfusion injury of rats. Methods 30 male SD rats were randomly divided into three groups：sham operation group （Thoracotomy was accomplished with no anterior descending branch ligation）， ischemia reperfusion group， and drug preconditioning group. Myocardial ischemia reperfusion injury model was established by ligating the left anterior descending coronary artery. The apoptosis index of cardiomyocyte was observed by TNUEL（terminal- deoxynucleotidyl-transferase - mediated dUTP-biotin nick end labeling）. Western blot technology was used to explore the effects of cinnamic acid preconditioning on Akt signal pathway. Results Compared with ischemia reperfusion group， apoptosis index of drug preconditioning group was significantly decreased （P<0.05）. Cinnamic acid pretreatment could increase expression of the phosphorylation Akt （p-Akt） and BCL-2 protein， but had no effect on non-phosphorylation Akt. Conclusion Cinnamic acid preconditioning could reduce apoptosis of cardiomyocyte in myocardial ischemia reperfusion injury model of SD rats. It may induce phosphorylation of Akt，increase expression of BCL-2 and preventing cardiomyocyte apoptosis.

Cinnamic acid； Myocardium ischemia reperfusion injury； Phosphorylated protein kinase B

R541.4

A

1674-4055（2016）08-0932-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（81173189）；西安市衛(wèi)生局科技項(xiàng)目及西安市科技項(xiàng)目（SF1416）

1710054西安，西安市第九醫(yī)院影像科；2510632廣州，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院

高宇勤，E-mail：2101749095@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.08.11