李冬植，王凱,2，徐莉，柴婷婷，崔峰，邱立紅，鄭明奇，覃兆海，王成菊,*

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京100193

2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽110161

戊吡蟲胍對幾種非靶標(biāo)生物的急性毒性

李冬植1，王凱1,2，徐莉1，柴婷婷1，崔峰1，邱立紅1，鄭明奇1，覃兆海1，王成菊1,*

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京100193

2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽110161

戊吡蟲胍是一種從煙堿類和縮胺脲類殺蟲劑活性結(jié)構(gòu)拼接而成的系列化合物中篩選出來的新型殺蟲劑，目前戊吡蟲胍對非靶標(biāo)生物的毒性研究報道較少。為探究戊吡蟲胍的環(huán)境安全性，采用生物毒性試驗方法測定了其對斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)、大型溞(Daphnia magna)、家蠶(Bombyx mori)、斑馬魚(Brachydanio rerio)、赤子愛勝蚯蚓(Eisenia fetide)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、赤眼蜂(Trichogramma nubilale)、意大利蜜蜂(Apis mellifera)、日本鵪鶉(Coturnix coturnix japonica)共9種非靶標(biāo)生物的急性毒性。結(jié)果顯示戊吡蟲胍對斜生柵藻和大型溞的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為8.79 mg·L-1和10.97 mg·L-1，對家蠶、斑馬魚、赤子愛勝蚯蚓和非洲爪蟾的半數(shù)致死濃度(LC50)分別為2.32 mg·L-1、13.74 mg·L-1、>100 mg·kg-1和19.30 mg·L-1，對赤眼蜂的安全系數(shù)為0.16～0.031，對蜜蜂急性觸殺和急性攝入毒性分別為51.82 μg·bee-1和10.8×103mg·L-1，對鵪鶉的急性經(jīng)口和急性飼喂毒性LC50分別為>1 000 mg·kg-1和>2×103mg·kg-1。按照最新國標(biāo)(GB/T31270—2014)化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價準(zhǔn)則的毒性等級劃分，戊吡蟲胍除了對家蠶和赤眼蜂為高毒和極高風(fēng)險外，對其余非靶生物均為低毒。

戊吡蟲胍；非靶標(biāo)生物；急性毒性

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新煙堿類殺蟲劑是近年來農(nóng)業(yè)害蟲防治中的一類重要的新型殺蟲劑，其作用靶標(biāo)為煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)[1]。自20世紀(jì)80年代新煙堿類殺蟲劑引入市場以來[2]，因其作用方式新穎、選擇毒性強(qiáng)、高效、廣譜和對哺乳動物安全等特點在世界范圍內(nèi)受到廣泛關(guān)注[3]。目前，經(jīng)過20多年的研發(fā)已經(jīng)有7個新煙堿類殺蟲劑商品化，它們對哺乳動物、鳥類及水生生物低毒安全，在環(huán)境中幾乎無殘留等優(yōu)點使其成為殺蟲劑中銷售額最大的農(nóng)藥[4]。其中吡蟲啉是使用最廣的新煙堿類殺蟲劑[5]，雖然其對環(huán)境相對安全[6-7]，但對蚯蚓、蜜蜂等能造成一系列傷害[8-12]。隨著新煙堿類殺蟲劑的大量使用，其對蜜蜂的毒性越來越被人們關(guān)注，歐盟為此于2013年12月起暫停這類殺蟲劑使用3年[13]。因此開發(fā)對環(huán)境非靶標(biāo)生物安全的新穎結(jié)構(gòu)殺蟲劑尤為重要。

戊吡蟲胍([1-硝基-3-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-4-戊亞甲基氨基胍])(圖1)是2008年中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的一種新型結(jié)構(gòu)的新煙堿類殺蟲劑[14]。它是從新煙堿類和縮胺脲類殺蟲劑的活性結(jié)構(gòu)基團(tuán)巧妙的組合到一個分子中的系列化合物篩選出的產(chǎn)物，兼具新煙堿類和鈉離子通道抑制劑2種殺蟲劑的活性特點。已有的數(shù)據(jù)表明戊吡蟲胍能有效地防治蚜蟲和褐飛虱，且對于哺乳動物的毒性較吡蟲啉低[15]。

由于其高效、成本相對低廉和潛在的環(huán)境安全優(yōu)勢，戊吡蟲胍具有較大的潛在市場價值。研究其對環(huán)境非靶標(biāo)生物的安全性，尤其是對蜜蜂的安全性對新煙堿類殺蟲劑安全使用和其新型結(jié)構(gòu)的研發(fā)具有十分重要的借鑒意義。本研究目的在于評價戊吡蟲胍對環(huán)境非靶標(biāo)生物的毒性，并以此評估其環(huán)境安全風(fēng)險。

圖1 戊吡蟲胍的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 供試藥劑

95%戊吡蟲胍原藥由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院農(nóng)藥合成實驗室提供。原藥使用丙酮溶解配成母液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

1.2 供試生物和試驗方法

1.2.1 藻類生長抑制試驗

斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)由農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所生物技術(shù)研究測試中心提供。采用水生4號培養(yǎng)基在(23±1.0)℃、4 500～5 000 lux的條件下轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)。取轉(zhuǎn)接2到3次后對數(shù)生長期的斜生柵藻細(xì)胞進(jìn)行試驗，將含戊吡蟲胍的培養(yǎng)液與藻細(xì)胞稀釋液以1:1混合致藥劑終濃度為1.0、3.0、9.0、27.0、81.0 mg·L-1，同時設(shè)置空白對照和助劑對照，每一處理3次重復(fù)。暴露72 h后根據(jù)650 nm處吸光值(OD)的變化來計算戊吡蟲胍的EC50[16]。

1.2.2 溞類活動抑制試驗

大型溞(Daphnia magna)由中國疾病防控中心提供，參照齊素貞等[14]報道的方法連續(xù)培養(yǎng)。在整個試驗中，水的硬度控制在(250±50)mg·L-1范圍內(nèi)(以CaCO3計)，水中溶氧量>5.80 mg·L-1(OECD,2011)。實驗濃度設(shè)為2.50、5.00、10.00、20.00和40.00 mg· L-1，同時設(shè)置空白對照和助劑對照，每一處理3次重復(fù)。暴露48 h后根據(jù)大型溞在不同濃度組中的受抑制數(shù)計算EC50。

1.2.3 家蠶急性毒性試驗

家蠶(Bombyx mori)(菁松×皓月)購于山東廣通蠶種集團(tuán)有限公司，在26～28℃，相對濕度為76%～ 79%，模擬日光光照(白天∶黑夜=14 h∶10 h)的條件下飼養(yǎng)，取二齡蠶作為實驗材料。實驗采用浸液飼喂法，即將5 g桑葉分別浸在50 mL不同濃度(1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 mg·L-1)的藥液中10 s取出，在室溫放置晾干桑葉表面藥液后移入培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中放入20頭二齡幼蟲。設(shè)置空白對照和助劑對照，每一處理3次重復(fù)。24 h、48 h和96 h后記錄家蠶的中毒癥狀和死亡情況并計算96 h-LC50[17]。

1.2.4 魚類急性毒性試驗

斑馬魚成魚(Brachydanio rerio)購于北京宏大高峰水族館。在室內(nèi)馴養(yǎng)7 d以上，期間每天喂食1到2次，馴養(yǎng)期間正常死亡率低于5%。試驗前24 h停止喂食，挑選體長(3.0±0.5)cm、體重(0.3±0.1)g健康活潑個體用于試驗。采用半靜態(tài)法[18]，實驗濃度設(shè)定為13.00、14.30、15.73、17.30、19.03 mg·L-1，同時設(shè)置空白對照，每一處理3次重復(fù)。暴露6 h、24 h、48 h、72 h和96 h后觀察斑馬魚的中毒癥狀，并計算96 h-LC50。

1.2.5 蚯蚓急性毒性試驗

赤子愛勝蚯蚓(Eisenia fetida savigny)購自北京大環(huán)蚯蚓廠。在人工土壤(10%泥炭蘚、20%高嶺土和70%石英砂)中按照溫度為(20±1)℃、相對濕度80% ～85%、600 lux連續(xù)光照的實驗條件飼養(yǎng)。選擇具有繁殖帶，體重在300～500 mg的成蚯用于試驗。實驗只設(shè)置一個上限濃度100 mg·kg-1(即準(zhǔn)確稱取150 mg藥劑與1 500 g人工土壤混勻后再加入450 mL曝氣水)，重復(fù)3次并設(shè)有空白對照。暴露7 d和14 d后觀察中毒癥狀記錄死亡情況，并計算14 d-LC50[19]。

1.2.6 兩棲急性毒性試驗

非洲爪蟾(Xenopus laevis)的蝌蚪購于中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所。蝌蚪飼養(yǎng)于盛有15 L去氯曝氣水的100 L玻璃缸內(nèi)，正式試驗前馴化至少一周[20]。試驗前饑餓處理24 h，選擇健康、齡期一致的蝌蚪隨機(jī)移入到盛有2 L去氯曝氣水的玻璃缸中用于試驗。將一定量的戊吡蟲胍母液加入到去氯曝氣水中，配成11.9、17.8、26.7、40.0、60.0 mg·L-1共5個濃度，并設(shè)有空白對照，每個處理3次重復(fù)。暴露24 h和48 h后記錄蝌蚪的中毒癥狀和死亡數(shù)量，并計算48 h-LC50[21]。

1.2.7 赤眼蜂急性毒性試驗

赤眼蜂(Trichogramma nubile)由廣東昆蟲研究所提供。被寄生的米蛾卵(Corcyra cephalonica)，在(25.0±1.0)℃,、相對濕度(70%±10%)、避光條件下的人工氣候箱中飼養(yǎng)，羽化出的成蜂用于急性毒性試驗。采用藥膜法[22-24]評價急性毒性。將不同濃度(0.31、0.62、1.25、2.49、4.99、9.98 mg·L-1)的1 mL藥液加入指行管中充分滾吸晾制成藥膜管后，把赤眼蜂放入管中爬行1 h再轉(zhuǎn)入無藥指行管，并用10%的蜂蜜水飼喂。試驗設(shè)置對照，每一處理3次重復(fù)。24 h后觀察中毒癥狀并計算半致死殘留量(LR50)和安全系數(shù)。安全系數(shù)的計算方法參見以下公式：安全系數(shù)=LR50(mg·cm-2)/田間推薦使用濃度(mg·cm-2)。

1.2.8 蜜蜂急性毒性試驗

意大利蜜蜂(Apis melliferaL)成蟲由中國農(nóng)科院蜜蜂研究所提供。室內(nèi)馴化7 d以后，挑選大小一致，健康活潑的成年工蜂作為實驗材料[25-26]。

急性觸殺實驗：在干燥器內(nèi)用適量乙醚麻醉蜜蜂后在每頭蜜蜂的前胸背板上點滴1 μL藥劑，戊吡蟲胍的最終點滴劑量為2.56、6.40、16.00、40.00、100.00 μg ·bee-1，每一處理3次重復(fù)，并以丙酮為空白對照。將處理過的蜜蜂置于蓋有黑布的蜂籠中，用脫脂棉浸泡33%蔗糖水飼喂。24 h、48 h觀察記錄中毒癥狀和死亡數(shù)并計算48 h的半數(shù)致死劑量(LD50)。

急性經(jīng)口毒性：將戊吡蟲胍配制成2 000 mg· L-1的母液，用33%的蔗糖水將母液分別稀釋為5.6× 102mg·L-1、1.28×103mg·L-1、3.2×103mg·L-1、8.0× 103mg·L-1、2.0×104mg·L-1。配好的藥劑用0.30 g脫脂棉浸漬直至飽和形成棉球，放在蜂籠上方飼喂蜜蜂，并用燒杯罩住以減少揮發(fā)。蜂籠置于黑布遮蓋的飼養(yǎng)架上，24 h、48 h觀察記錄中毒癥狀和死亡數(shù)并計算48 h-LC50[27]。

1.2.9 鳥類急性毒性試驗

日本鵪鶉(Coturnix coturnix japonica)由山東嘉祥縣鴻新鵪鶉養(yǎng)殖有限公司提供。選取同一批孵化、飼養(yǎng)30 d左右、體重在90～110 g健康活潑，且雌雄比例為1∶1的鵪鶉作為實驗材料。試驗前在實驗室(溫度(25.0±1.0)℃，相對濕度62%～72%，自然光下)馴化7 d后用于試驗[28]。

急性經(jīng)口毒性：試驗藥劑濃度設(shè)置為1.00×104和1.00×105mg·L-1。采用經(jīng)口一次性染毒法，即饑餓處理12 h后按照每100 g體重灌藥1 mL的標(biāo)準(zhǔn)對鵪鶉進(jìn)行灌胃染毒處理，2 h后正常飼喂。每個處理10頭鵪鶉，并設(shè)有空白對照和助劑對照。8 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h和168 h后記錄中毒癥狀和死亡數(shù)并計算168 h-LD50[29]。

急性飼喂毒性：向飼料中加入戊吡蟲胍母液，混勻制成1.00×103和2.00×103mg·kg-1終濃度的帶藥飼料，每天用含藥的飼料早中晚飼喂3次，連續(xù)飼喂5 d，再用不含藥的飼料飼喂3 d[26]。觀察8 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192 h后的中毒癥狀和死亡數(shù)并計算192 h-LC50。

1.3 供試生物的培養(yǎng)條件和實驗條件

所有非靶標(biāo)生物均在實驗室條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)條件列于表1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

LC50、LD50、EC50(半數(shù)有效濃度)、LR50(半數(shù)致死殘留)及置信限由SPSS 17.0軟件用概率回歸分析計算而得。

2 結(jié)果（Results）

表1 測試生物的培養(yǎng)條件Table 1 Culture conditions of test organisms

表2 戊吡蟲胍對非靶標(biāo)生物的急性毒性Table 2 Toxicity of guadipyr to non-target organisms

2.1 戊吡蟲胍對供試生物的急性毒性

戊吡蟲胍對9種環(huán)境非靶標(biāo)生物的急性毒性結(jié)果見表2和表3。戊吡蟲胍對水生生物斜生柵藻72 h-LC50、大型溞48 h-EC50和斑馬魚的96 h-LC50分別是8.79 mg·L-1、10.97 mg·L-1和13.74 mg·L-1。中毒的斜生柵藻細(xì)胞分裂減少、藻液顏色變淺；而大型溞則表現(xiàn)出活力下降、游動緩慢、容易沉于容器底部；斑馬魚中毒后體背顏色發(fā)黑、活力下降。經(jīng)濟(jì)昆蟲家蠶的96 h-LC50較高為2.32 mg·L-1，中毒后的家蠶取食明顯減少、蟲體逐漸縮小并伴有吐水現(xiàn)象。對于土壤生物蚯蚓，由于在上限濃度100 mg·kg-1下7 d和14 d均未觀察到死亡現(xiàn)象，因此戊吡蟲胍對其的急性毒性LC50大于100 mg·kg-1。對天敵生物非洲爪蟾蝌蚪和赤眼蜂的急性毒性分別為19.30 mg· L-1和2.98 mg·L-1。由于赤眼蜂采用的是藥膜法，因此用安全系數(shù)來表示更具有直觀性，根據(jù)LR50(3.24 ×10-5mg·cm-2)與田間推薦使用劑量(7.48×10-4mg· cm-2)的比算出戊吡蟲胍對赤眼蜂的安全系數(shù)為4.33 ×10-2，即LR50值明顯小于田間使用劑量，具有較高的風(fēng)險。戊吡蟲胍對這2種天敵的中毒癥狀表現(xiàn)為活力下降，行動緩慢。蜜蜂和鵪鶉的急性經(jīng)口毒性分別為1.08×104mg·L-1和>1 000 mg·kg-1，蜜蜂的急性觸殺毒性為51.82 μg·bee-1，鵪鶉的急性飼喂毒性為>2 000 mg·L-1。中毒后的蜜蜂身體失衡、伸喙展翅，鵪鶉則表現(xiàn)出精神萎靡、羽毛蓬松、打盹。

2.2 戊吡蟲胍對供試生物的毒性等級劃分

根據(jù)最新的國標(biāo)GB/T 31270.10—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》[30]中農(nóng)藥對環(huán)境非靶標(biāo)生物的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，戊吡蟲胍對所測的9種非靶標(biāo)生物的毒性除了家蠶為高毒、赤眼蜂為極高風(fēng)險外，其余7種環(huán)境生物均表現(xiàn)為低毒。

3 討論（Discussion）

目前市場上常見的新煙堿類殺蟲劑對水生生物(例如藻類和大型溞)都較為安全，但對土壤生物和傳粉蜜蜂則表現(xiàn)出一定的毒性，特別是對蜜蜂的毒性多為劇毒(表4)。我們的研究結(jié)果表明戊吡蟲胍對水生生物斜生柵藻、大型溞、斑馬魚為低毒；對天敵兩棲生物非洲爪蟾低毒；對土壤生物蚯蚓為低毒；對意大利蜜蜂和鳥類日本鵪鶉均為低毒；特別是對蜜蜂的毒性(急性觸殺48 h-LD50為51.82 μg·bee-1)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于目前市場的新煙堿類殺蟲劑，這對于緩解新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂的毒性壓力有一定的幫助。另外，小鼠實驗表明戊吡蟲胍的急性經(jīng)口毒性LD50> 5 000 mg·kg-1b.w.，急性皮膚試驗LD50>5 000 mg· kg-1b.w.，急性吸入毒性LC50>3 458 mg·m-3，在毒性分級中屬于輕微毒性，低于吡蟲啉對小鼠的毒性[13]。

戊吡蟲胍和其他新煙堿類殺蟲劑之間毒性差異的原因可能與它的化學(xué)結(jié)構(gòu)有較大關(guān)系(圖1)。戊吡蟲胍是由新煙堿類和縮胺脲類殺蟲劑的2種活性基團(tuán)巧妙結(jié)合的衍生物，而農(nóng)藥化學(xué)結(jié)構(gòu)上的細(xì)微改變很容易導(dǎo)致化學(xué)性質(zhì)的重大變化[13]。這種新穎結(jié)構(gòu)可能是導(dǎo)致其對蜜蜂低毒的原因，對于新煙堿類殺蟲劑的未來研發(fā)改造中具有一定的借鑒意義，使新煙堿類殺蟲劑可以對環(huán)境，特別是蜜蜂更加安全。

表3 戊吡蟲胍對蜜蜂和鳥的急性毒性Table 3 Toxicity of guadipyr to bees and birds

表4 多種新煙堿類殺蟲劑對不同非靶標(biāo)生物的生態(tài)毒性（IUPAC，2015）Table 4 Toxicity of neonicotinoid insecticides to non-target organisms(IUPAC,2015)

生物防治活性上，戊吡蟲胍防治蚜蟲和褐飛虱效果優(yōu)于吡蟲啉。大田試驗表明戊吡蟲胍在(60 g a.i.·ha-1)用量下對褐飛虱的防效可達(dá)83.5%，而吡蟲啉要達(dá)到類似的防效則需要近雙倍的用量(112.5 g a.i.·ha-1)[13]。戊吡蟲胍的這種高效、安全的特性，可能會有較為廣闊的市場應(yīng)用前景。但是，戊吡蟲胍對家蠶、赤眼蜂還是具有一定的環(huán)境風(fēng)險，因此在使用時應(yīng)該盡量避免在桑園附近和害蟲天敵防護(hù)區(qū)使用。由于其對蚯蚓較為安全且對多數(shù)水生生物為低毒，因此戊吡蟲胍在土壤處理劑上有較好的發(fā)展優(yōu)勢。

致謝：感謝中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院生測組各位同學(xué)在實驗上給予的幫助。

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[27] Laurino D,Porporato M,Patetta A,et al.Toxicity of neonicotinoid insecticides to honey bees:Laboratory tests[J]. Bulletin of Insectology,2011,64:107-113

[28] OECD.Guideline for the testing of chemicals:Avian dietary toxicity test[S].Paris:OECD,1984

[29] OECD.Guidelines for the testing of chemicals:Avian acute oral toxicity test[S].Paris:OECD,2010

[30] 中華人民共和國國家環(huán)境保護(hù)部.GB/T31270.10—2014化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則[S].北京:中華人民共和國國家環(huán)境保護(hù)部,2014◆

Acute Toxicity of Guadipyr to Non-target Organisms

Li Dongzhi1,Wang Kai1,2,Xu Li1,Chai Tingting1,Cui Feng1,Qiu Lihong1,Zheng Mingqi1,Qin Zhaohai1,Wang Chengju1,*

1.China Agricultural University,Beijing 100193,China
2.Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161,China

21 September 2015 accepted 16 November 2015

Guadipyr is a novel insecticide,which contains both neonicotinoid and oxiadiazine insecticidal activity moieties.Its toxicity to the non-target organisms remains largely unknown till now.In this study,the toxicity of guadipyr to nine organisms including algae(Scenedesmus obliquus),Daphnia magna,silkworm(Bombyx mori),zebrafish(Brachydanio rerio),earthworm(Eisenia fetide),tadpole(Xenopus laevis),parasitoid(Trichogramma nubilale),bee(Apis mellifera)and quail(Coturnix coturnix japonica)was determined.The median effective concentration(EC50)of guadipyr to algae andDaphnia magnawas found to be 8.79 mg·L-1and 10.97 mg·L-1,respectively; the median lethal concentration(LC50)of guadipyr to silkworm,zebrafish,earthworm and frog was 2.32 mg·L-1,13.74 mg·L-1,>100 mg·kg-1and 19.3 mg·L-1,respectively;the risk quotient of guadipyr to parasitoid was 0.0433; the median lethal dose(LD50)for contact toxicity and LC50for oral toxicity to bee were 51.82 μg·bee-1and 10.8× 103mg·L-1,respectively.The LD50for oral toxicity and LC50for dietary toxicity to quail(Coturnix coturnix japonica)were>1 000 mg·kg-1and>2 000 mg·L-1,respectively.According to the GB/T 31270-2014,guadipyr is classified as a low-toxicity compound for most of the non-target organisms,and it exhibits high toxicity and risk only to silkworm and parasitoid.

guadipyr;non-target organisms;toxicity

2015-09-21 錄用日期：2015-11-16

1673-5897（2016）3-331-07

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150921001

簡介：王成菊(1964-)，女，教授，主要研究方向為農(nóng)藥毒理與使用技術(shù)。

國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0200504)

李冬植(1989-)，男，博士研究生，研究方向為農(nóng)藥毒理與使用技術(shù)，E-mail：lidongzhi1989@163.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:wangchengju@cau.edu.cn